奶業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)

Milk Research Team

2022 年度報(bào)告

Annual Report

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所

Institute of Animal Sciences, CAAS

用陽光，迎接 2023

2022 年，奶業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)潛心科研，努力拼搏，圓滿完成各項(xiàng)任務(wù)，

取得可喜成績。

團(tuán)隊(duì)圍繞奶牛健康養(yǎng)殖與牛奶品質(zhì)形成機(jī)理、奶產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與

營養(yǎng)功能評(píng)價(jià)兩個(gè)研究領(lǐng)域，發(fā)表論文 47 篇，其中 SCI 文章 33 篇，

中文文章 14 篇，出版著作 12 部，獲得授權(quán)發(fā)明專利 3 項(xiàng)。成功申報(bào)

“十四五”國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目 2 項(xiàng)。

受農(nóng)業(yè)農(nóng)村部委托，團(tuán)隊(duì)組織全國優(yōu)勢單位，牽頭實(shí)施生鮮乳質(zhì)

量安全監(jiān)測計(jì)劃、液態(tài)奶中復(fù)原乳監(jiān)測計(jì)劃和奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)專

項(xiàng)等項(xiàng)目，發(fā)布《中國奶產(chǎn)品質(zhì)量安全研究報(bào)告（2021 年）》和《中

國奶業(yè)質(zhì)量報(bào)告（2022）》。成功召開第七屆“奶牛營養(yǎng)與牛奶質(zhì)量”

國際研討會(huì)。

牽頭國家奶業(yè)科技創(chuàng)新聯(lián)盟，在全國 25 個(gè)省 64 家企業(yè)實(shí)施優(yōu)質(zhì)

乳工程，被列入國家衛(wèi)健委《國民營養(yǎng)計(jì)劃》重點(diǎn)工作。

新春的腳步正在向我們走來。在此，向關(guān)心、支持和幫助奶業(yè)創(chuàng)

新團(tuán)隊(duì)的領(lǐng)導(dǎo)、專家和朋友，致以最衷心的感謝和最崇高的敬意！

祝您們節(jié)日愉快、闔家歡樂！

執(zhí)行首席專家：

首席專家：

團(tuán)隊(duì)簡介

奶產(chǎn)品質(zhì)量與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（簡稱奶業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，MRT）

是首批入選創(chuàng)新工程的團(tuán)隊(duì)，建有農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶及奶制品質(zhì)量安全控

制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶及奶制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（北京）、

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（北京）和國家奶業(yè)國際

聯(lián)合研究中心等平臺(tái)。

團(tuán)隊(duì)始終聚焦奶牛健康養(yǎng)殖與牛奶品質(zhì)形成機(jī)理、奶產(chǎn)品質(zhì)量

安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與營養(yǎng)功能評(píng)價(jià)兩個(gè)研究領(lǐng)域，發(fā)揮科技引領(lǐng)作用。近

五年發(fā)表 SCI 文章 100 余篇，獲得國家科技進(jìn)步二等獎(jiǎng) 1 項(xiàng)，被評(píng)為

“全國農(nóng)業(yè)科研杰出創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)”和“中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年文明號(hào)”。

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（北京）

國家農(nóng)業(yè)檢測基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室（奶及奶制品污染物）

奶牛健康養(yǎng)殖與牛奶品質(zhì)形成機(jī)理

奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與營養(yǎng)功能評(píng)價(jià)

全國生鮮乳質(zhì)量安全監(jiān)測

奶業(yè)

創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)

服務(wù)行業(yè) 全國奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶及奶制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（北京）

科研領(lǐng)域

技術(shù)平臺(tái) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶及奶制品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

國家奶業(yè)科技創(chuàng)新聯(lián)盟

國家奶業(yè)國際聯(lián)合研究中心

目 錄

一、成果概覽 ..................................... 1

（一）文 章 ........................................... 2

（二）著 作 .......................................... 12

（三）發(fā)明專利 ........................................ 13

（四）標(biāo) 準(zhǔn) .......................................... 14

二、研究進(jìn)展 .................................... 15

領(lǐng)域一：奶牛健康養(yǎng)殖與牛奶品質(zhì)形成機(jī)理 .................. 16

1. 宏基因組指導(dǎo)未培養(yǎng)微生物分離培養(yǎng)的機(jī)遇與挑戰(zhàn) ....... 16

2. 荷斯坦奶牛生乳總固形物含量的變化與瘤胃細(xì)菌群落有關(guān) ... 39

3. 基于活性和富集的宏蛋白質(zhì)組學(xué)解析牛瘤胃微生物活性脲酶 49

4. 瘤胃細(xì)菌對(duì)奶牛個(gè)體氮利用效率的貢獻(xiàn) ................. 58

5. 提高生乳中ω-3 多不飽和脂肪酸對(duì)生乳風(fēng)味影響較小 ..... 66

6. 牛奶中ω-6 和ω-3 脂肪酸比例影響揮發(fā)性物質(zhì)的組成 .... 74

7. 新的α-亞麻酸瘤胃生物氫化中間產(chǎn)物：t9c12c15-C18:3 .. 81

8. 自然霉變?nèi)占Z霉菌毒素暴露對(duì)泌乳奶牛生產(chǎn)性能與健康影響 87

9. 不同纖維降解酶的作用順序促進(jìn)玉米秸稈降解 ........... 93

10. 亞麻籽物理形態(tài)影響生乳中ω-3 多不飽和脂肪酸的富集 . 102

領(lǐng)域二：奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與營養(yǎng)功能評(píng)價(jià) ........... 113

1. AFM1 與 OTA 單獨(dú)及聯(lián)合處理誘導(dǎo)新生腸道炎癥損傷 ...... 113

2. 揭示黃曲霉毒素 B1 和黃曲霉毒素 M1 對(duì)腸道 NCM460 細(xì)胞的加

和毒性作用 ........................................... 124

3. 乳鐵蛋白緩解黃曲霉毒素 M1 誘導(dǎo)的 NCM460 細(xì)胞凋亡 ....... 135

4. 乳鐵蛋白對(duì)黃曲霉毒素 M1 誘導(dǎo)的腸道損傷具有保護(hù)作用 .... 142

5. 乙酸、丙酸和丁酸對(duì)離體培養(yǎng)的胎鼠空腸和未成熟小腸細(xì)胞的

抗炎作用 ............................................. 153

6. 全轉(zhuǎn)錄組分析揭示黃曲霉毒素 M1 和赭曲霉毒素 A 發(fā)揮腸道免

疫抑制的 ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò) ............................... 163

7. 代謝組學(xué)分析揭示黃曲霉毒素 M1 和赭曲霉毒素 A 聯(lián)合處理致

小鼠肝臟損傷機(jī)制 ..................................... 175

8. 2'-巖藻糖基乳糖通過調(diào)節(jié)腸道菌群和促進(jìn) MUC2 表達(dá)改善炎癥

性腸病 ............................................... 182

9. 不同鐵飽和度重組乳鐵蛋白對(duì)幼鼠腸炎損傷的保護(hù)作用 ..... 189

10. 工業(yè)污染區(qū)重金屬對(duì)牛奶品質(zhì)的影響 ................. 196

11. 牧場環(huán)境和生鮮乳中蠟樣芽孢桿菌的腐敗研究 ......... 201

12. 頭孢菌素類抗生素對(duì)奶牛糞便中菌群和耐藥基因的影響 . 206

13. 從中國不同地區(qū)的生乳中分離出的金黃色葡萄球菌的耐藥性

和分子特征 ........................................... 212

14. 牧場墊料材料對(duì)生乳微生物結(jié)構(gòu)與耐藥基因的影響 ..... 220

15. 基于 16S rDNA 基因測序的 Source Tracker 模型評(píng)估巴氏殺

菌乳中微生物風(fēng)險(xiǎn)關(guān)鍵點(diǎn)分析 ........................... 229

16. 我國不同地區(qū)生乳中嗜冷菌的多樣性分析 ............. 233

17. 生乳中假單胞桿菌的種類及其蛋白酶活力的分析 ....... 242

三、服務(wù)行業(yè) ................................... 248

1. 奶業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)與蒙牛乳業(yè)集團(tuán)召開乳品質(zhì)量提升會(huì)議 .... 249

2. 2021 年生鮮乳質(zhì)量安全監(jiān)管項(xiàng)目績效評(píng)價(jià)工作會(huì)議 ...... 251

3. “獸藥殘留分析樣品前處理技術(shù)”培訓(xùn) ................ 253

4. 研討奶業(yè)國家標(biāo)準(zhǔn) 助力高質(zhì)量發(fā)展 ................... 254

5. 2022 年全國生鮮乳質(zhì)量安全監(jiān)測項(xiàng)目檢測技術(shù)培訓(xùn)班召開 .. 256

6. 飛鶴遠(yuǎn)來共商新鮮定義 乳業(yè)相攜暢談產(chǎn)業(yè)標(biāo)準(zhǔn) ......... 258

—2022 年度飛鶴乳業(yè)與奶業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)合作進(jìn)展交流會(huì)議召開 .. 258

7. 奶業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì) 4 項(xiàng)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)順利通過審定 .......... 261

8. 我國首個(gè)奶牛養(yǎng)殖場生乳中病原微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)順利通過

審定 ................................................. 263

9. 嚴(yán)格過程控制 保障牛奶質(zhì)量安全 ..................... 265

10. 瞄準(zhǔn)國際前沿 建立我國首個(gè)生乳中體細(xì)胞過程控制 .... 267

技術(shù)規(guī)范 ............................................. 267

11. 我國首個(gè)牛奶中未變性乳鐵蛋白測定方法農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)通過

審定 ................................................. 269

12. 科技挖掘品質(zhì)特色 助力打造優(yōu)質(zhì)奶源 ................ 272

13. 乳品專項(xiàng)檢測技術(shù)培訓(xùn)班順利召開 ................... 274

14. 奶業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì) 5 項(xiàng)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)順利通過審定 ............. 276

15. 科學(xué)定義新鮮品質(zhì)，讓中國寶寶喝上優(yōu)質(zhì)奶粉 ......... 278

四、黨建與文化建設(shè) ............................. 280

1. 奶產(chǎn)品質(zhì)量與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估團(tuán)隊(duì)黨支部召開專題組織生活會(huì) .. 281

2. 奶產(chǎn)品質(zhì)量與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估團(tuán)隊(duì)黨支部開展 ................ 283

“以史為鑒，自強(qiáng)不息”主題黨日活動(dòng) ................... 283

3. 居家辦公不掉線 共克時(shí)艱勇向前 ..................... 285

4. 2022 年研究生畢業(yè)答辯會(huì)議 .......................... 287

5. 2022 年研究生中期和開題報(bào)告會(huì)議 ..................... 289

6. 賀信精神再次點(diǎn)燃青春激情 奶業(yè)團(tuán)隊(duì)堅(jiān)定信心勇爭一流 . 291

7. 賡續(xù)偉大建黨精神 打造畜產(chǎn)品學(xué)科第一方陣 ........... 293

—奶產(chǎn)品質(zhì)量與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估團(tuán)隊(duì)黨支部和優(yōu)質(zhì)功能畜產(chǎn)品團(tuán)隊(duì)黨支

部聯(lián)合主題黨日活動(dòng) ................................... 293

8. 奶業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)召開 2022 年上半年總結(jié)會(huì) ............... 295

9. 奶產(chǎn)品質(zhì)量與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估團(tuán)隊(duì)黨建與科技創(chuàng)新融合發(fā)展 .... 297

10. 學(xué)習(xí)貫徹二十大精神，培養(yǎng)一流人才，建設(shè)一流團(tuán)隊(duì) ... 299

五、專題報(bào)告 ................................... 302

大力發(fā)展尿素飼料是實(shí)現(xiàn)牛羊豆粕減量替代的戰(zhàn)略途徑 ..... 303

第七屆“奶牛營養(yǎng)與牛奶質(zhì)量”國際研討會(huì)成功召開 ....... 308

申報(bào)獲批兩項(xiàng)國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目 ..................... 328

六、大事記 ..................................... 332

一、成果概覽 █

﹣1﹣

一、成果概覽

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣2﹣

2022 年，發(fā)表論文 47 篇，其中 SCI 文章 33 篇，中文文章 14

篇，出版著作 12 部，獲得授權(quán)發(fā)明專利 3 項(xiàng)，發(fā)布團(tuán)隊(duì)標(biāo)準(zhǔn) 5 項(xiàng)。

（一） 文 章

領(lǐng)域一：奶牛健康養(yǎng)殖與牛奶品質(zhì)形成機(jī)理

1. Liu Sijia, Moon Christina D, Zheng Nan, Huws Sharon, Zhao

Shengguo, Wang Jiaqi. Opportunities and challenges of using

metagenomic data to bring uncultured microbes into cultivation.

Microbiome. 2022. 10(1): 76.

2. He Yue, Zhang Xiaoyin, Li Min, Zheng Nan, Zhao Shengguo, Wang

Jiaqi. Coptisine: A natural plant inhibitor of ruminal bacterial urease

screened by molecular docking.

Science of the Total Environment. 2022. 808: 151946.

3. Huang Guoxin, Li Ning, Liu Kaizhen, Yang Jiyong, Zhao Shengguo,

Zheng Nan, Zhou Jinhui, Zhang Yangdong, Wang Jiaqi. Effect of

flaxseed supplementation in diet of dairy cow on the volatile organic

compounds of raw milk by HS-GC-IMS.

Frontiers in Nutrition. 2022. 9: 831178.

一、成果概覽 █

﹣3﹣

4. Zhang Xiaoyin, Xiong Zhanbo, Li Min, Zheng Nan, Zhao Shengguo,

Wang Jiaqi. Activity- and enrichment-based metaproteomics insights

into active urease from the rumen microbiota of cattle.

International Journal of Molecular Science. 2022. 23: 817.

5. Liu Kaizhen, Zhang Yangdong, Huang Guoxin, Zheng Nan, Zhao

Shengguo, Wang Jiaqi. Ruminal bacterial community is associated

with the variations of total milk solid content in Holstein lactating cows.

Animinal Nutrition. 2022. 9: 175-83.

6. Li Min, Zhong Huiyue, Li Ming, Zheng Nan, Wang Jiaqi, Zhao

Shengguo. Contribution of ruminal bacteriome to the individual

variation of nitrogen utilization efficiency of dairy cows.

Frontiers in Microbiology. 2022. 13: 815225.

7. Jia Yangyang, Zhao Shengguo, Guo Wenjie, Peng Ling, Zhao Fang,

Wang Lushan, Fan Guangyi, Zhu Yuanfang, Xu Dayou, Liu Guilin,

Wang Ruoqing, Fang Xiaodong, Zhang He, Kristiansen Karsten,

Zhang Wenwei，Chen Jianwei. Sequencing introduced false positive

rare taxa lead to biased microbial community diversity, assembly, and

interaction interpretation in amplicon studies.

Environmental Microbiome. 2022. 17(1):43.

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣4﹣

8. Zhao Shengguo, Diaby M, Zheng Nan, Wang Jiaqi. Sequential action

of different fiber-degrading enzymes enhances the degradation of corn

stover.

Agriculture. 2022. 12(2): 181.

9. Wu Xufang, Guo Liya, Huang Guoxin, Tang Wenhao, Zhao Shengguo,

Wang Jiaqi, Zhang Yangdong. Effects of dietary natural mycotoxins

exposure on performance, biochemical parameters and milk small

molecule metabolic pathways of lactating cows.

Agriculture. 2022. 12(3): 420.

10. Li Ning, Huang Guoxin, Zhang Yangdong, Zheng Nan, Zhao

Shengguo, Wang Jiaqi. Diversity of volatile compounds in raw milk

with different n-6 to n-3 fatty acid ratio.

Animals (Basel). 2022. 12(3): 252.

11. Huang Guoxin, Wang Jiaqi, Liu Kaizhen, Zheng Nan, Zhao Shengguo,

Qu Xueyin, Yu Jing, Zhang Yangdong, Wang Jiaqi. Effect of flaxseed

supplementation on milk and plasma fatty acid composition and plasma

parameters of holstein dairy cows.

Animals (Basel). 2022. 12(15): 1898.

一、成果概覽 █

﹣5﹣

12. Huang Guoxin, Guo Liya, Chen Meiqing, Wu Xufang, Tang Wenhao,

Zheng Nan, Zhao Shengguo, Zhang Yangdong, Wang Jiaqi.

Biohydrogenation pathway of alpha-linolenic acid in rumen of dairy

cow in vitro.

Animals (Basel). 2022. 12(4): 502.

13. 唐文浩, 張養(yǎng)東, 鄭楠, 王加啟. 苜蓿青貯品質(zhì)評(píng)價(jià)研究進(jìn)展[J].

動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào). 2022. 34(07):4165-4173.

14. 楊繼勇, 張養(yǎng)東, 鄭楠, 王加啟. 牛奶感官特征及風(fēng)味物質(zhì)的研究

進(jìn)展[J].

動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào). 2022. 34(05):2790-2797.

15. 武旭芳, 張養(yǎng)東, 鄭楠, 王加啟. 乳中短鏈脂肪酸組成、生理功能

及檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J].

動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào). 2022. 34(04):2148-2155.

16. 陳美慶, 張養(yǎng)東, 鄭楠, 王加啟. 短鏈脂肪酸調(diào)控奶牛乳腺乳脂合

成作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].

動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào). 2022. 34(03):1426-1433.

17. 卜瑩, 鄭楠, 王加啟, 趙圣國. 免疫球蛋白調(diào)控動(dòng)物胃腸道健康及

微生物功能的研究進(jìn)展[J].

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣6﹣

中國畜牧獸醫(yī). 2022. 49(10):3800-3808.

18. 唐文浩, 張養(yǎng)東, 黃國欣, 楊繼勇, 劉凱珍, 鄭楠, 王加啟. 體外

產(chǎn)氣法評(píng)價(jià)不同物理狀態(tài)苜蓿干草營養(yǎng)價(jià)值的研究[J].

飼料工業(yè). 2022. 43(20):27-32.

19. 楊繼勇, 張養(yǎng)東, 鄭楠, 王加啟. 鍶元素的生物學(xué)功能及其在人體

內(nèi)的代謝研究進(jìn)展[J].

中國食物與營養(yǎng). 2022. 28(09):50-56.

領(lǐng)域二：奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與營養(yǎng)功能評(píng)價(jià)

20. Du Bingyao, Meng Lu, Liu Huimin, Zheng Nan, Zhang Yangdong,

Zhao Shengguo, Li Ming, Wang Jiaqi. Diversity and proteolytic

activity of Pseudomonas species isolated from raw cow milk samples

across China.

Science of The Total Environment. 2022. 838(Pt 3): 156382.

21. Gao Yanan, Wang Ziwei, Yang Xue, Wang Jiaqi, Zheng Nan.

Aflatoxin M1 and ochratoxin A induce a competitive endogenous RNA

regulatory network of intestinal immunosuppression by wholetranscriptome analysis.

Science of The Total Environment. 2022: 158777.

一、成果概覽 █

﹣7﹣

22. Yao Qianqian, Gao Yanan, Fan Linlin, Wang Jiaqi, Zheng Nan. 2'-

Fucosyllactose remits colitis-induced liver oxygen stress through the

gut–liver–metabolites axis.

Nutrients. 2022. 14(19): 4186.

23. Yao Qianqian, Fan Linlin, Zheng Nan, Blecker christophe, Delcenserie

véronique, Li Huiying, Wang Jiaqi. 2'-Fucosyllactose ameliorates

inflammatory bowel disease by modulating gut microbiota and

promoting MUC2 expression.

Frontiers in Nutrition. 2022. 9: 822020.

24. Du Bingyao, Meng Lu, Wu Haoming, Yang Hongjian, Liu Huimin,

Zheng Nan, Zhang Yangdong, Zhao Shengguo, Wang Jiaqi. Source

tracker modeling based on 16S rDNA sequencing and analysis of

microbial contamination sources for pasteurized milk.

Frontiers in Nutrition. 2022. 9: 845150.

25. Wu Haoming, Wang Yang, Du Bingyao, Li Huiying, Dong Lei, Hu

Haiyan, Meng Lu, Zheng Nan, Wang Jiaqi. Influence of dairy cows

bedding material on the microbial structure and antibiotic resistance

genes of milk.

Frontiers in Microbiology. 2022. 13: 830333.

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣8﹣

26. Meng Lu, Zhang Ruirui, Dong Lei, Hu Haiyan, Liu Huimin, Zheng

Nan, Wang Jiaqi, Cheng Jianbo. Characterization and spoilage

potential of Bacillus cereus isolated from farm environment and raw

milk.

Frontiers in Microbiology. 2022. 13: 940611.

27. Liu Huimin, Dong Lei, Zhao Yankun, Meng Lu, Wang Jiaqi, Wang

Cheng, Zheng Nan. Antimicrobial susceptibility, and molecular

characterization of staphylococcus aureus isolated from different raw

milk samples in China.

Frontiers in Microbiology. 2022. 13: 840670.

28. Du Bingyao, Meng Lu, Liu Huimin, Zheng Nan, Zhang Yangdong,

Zhao Shengguo, Wang Jiaqi. Single molecule real-time sequencing and

traditional cultivation techniques reveal complex community structures

and regional variations of psychrotrophic bacteria in raw milk.

Frontiers in Microbiology. 2022. 13: 853263.

29. Wang Fengen, Chen Meiqing, Luo Runbo, Huang Guoxin, Wu Xufang,

Zheng Nan, Zhang Yangdong, Wang Jiaqi. Fatty acid profiles of milk

from holstein cows, jersey cows, buffalos, yaks, humans, goats, camels,

and donkeys based on gas chromatography-mass spectrometry.

一、成果概覽 █

﹣9﹣

Journal of Dairy Science. 2022. 105(2): 1687-700.

30. Fan Linlin, Yao Qianqian, Wu Haoming, Wen Fang, Wang Jiaqi, Li

Huiying, Zheng Nan. Protective effects of recombinant lactoferrin with

different iron saturations on enteritis injury in young mice.

Journal of Dairy Science. 2022. 105(6): 4791-803.

31. Wu Haoming, Wang Yang, Li Huiying, Meng Lu, Zheng Nan, Wang

Jiaqi. Protective effect of alkaline phosphatase supplementation on

infant health.

Foods. 2022. 11(9): 23.

32. Wu Hongya, Fan Linlin, Gao Yanan, Wang Jiaqi, Zheng Nan. The

protective effects of iron free lactoferrin on lipopolysaccharideinduced intestinal inflammatory injury via modulating the nf-b/ppar

signaling pathway.

Foods. 2022. 11(21): 3378.

33. Chi Xuelu, Guo Hongxia, Zhang Yangdong, Zheng Nan, Liu Huimin,

Wang Jiaqi. E-nose, E-tongue combined with GC-IMS to analyze the

influence of key additives during processing on the flavor of infant

formula.

Foods. 2022. 11(22): 3708.

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣10﹣

34. Wang Ziwei, Gao Yanan, Huang Shengnan, Wang Jiaqi, Zheng Nan.

Ex vivo and in vitro studies revealed underlying mechanisms of

immature intestinal inflammatory responses caused by aflatoxin M1

together with ochratoxin A.

Toxins (Basel). 2022. 14(3): 173.

35. Gao Yanan, Yang Xue, Wang Jiaqi, Liu Huimin, Zheng Nan. Multiomics reveal additive cytotoxicity effects of aflatoxin B1 and aflatoxin

M1 toward intestinal NCM460 cells.

Toxins (Basel). 2022. 14(6): 368.

36. Gao Yanan, Wu Chenqing, Wang Jiaqi, Zheng Nan. Metabolomic

analysis reveals the mechanisms of hepatotoxicity induced by aflatoxin

M1 and ochratoxin A.

Toxins (Basel). 2022. 14(2): 141.

37. Zheng Nan, Min Li, Li Dagang, Tan Sheng, Gao Yanan, Wang Jiaqi.

Occurrence of Aflatoxin M1 in Cow, Goat, Buffalo, Camel, and Yak

Milk in China in 2016.

Toxins (Basel). 2022. 14.

38. Dong Lei, Meng Lu, Liu Huimin, Wu Haoming, Schroyen martine,

Zheng Nan, Wang Jiaqi. Effect of cephalosporin treatment on the

一、成果概覽 █

﹣11﹣

microbiota and antibiotic resistance genes in feces of dairy cows with

clinical mastitis.

Antibiotics (Basel). 2022. 11(1): 117.

39. Su Chuanyou, Qu Xueyin, Gao Yanan, Zhou Xuewei, Yang Xue,

Zheng Nan. Effects of heavy metal exposure from leather processing

plants on serum oxidative stress and the milk fatty acid composition of

dairy cows: a preliminary study.

Animals (Basel). 2022. 12(15): 1900.

40. Huang Shengnan, Gao Yanan, Wang Ziwei, Yang Xue, Wang Jiaqi,

Zheng Nan. Anti-inflammatory actions of acetate, propionate, and

butyrate in fetal mouse jejunum cultures ex vivo and immature small

intestinal cells in vitro.

Food Science & Nutrition. 2022. 10(2): 564-76.

41. 趙艷坤, 劉慧敏, 孟璐, 王成, 王加啟, 鄭楠. 大腸埃希菌異質(zhì)性

耐藥的研究進(jìn)展[J].

生物技術(shù)通報(bào). 2022. 38(09):59-71.

42. 常嶸, 葉巧燕, 劉慧敏, 郝欣雨, 郭洪俠, 鄭楠. 牛奶中激素檢測

方法的研究進(jìn)展[J].

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣12﹣

食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào). 2022. 13(16):5235-5243.

43. 楊麗婷, 王子微, 王加啟, 鄭楠. 短鏈脂肪酸及其調(diào)節(jié)腸道炎癥作

用的研究進(jìn)展[J].

食品工業(yè)科技. 1-23.

44. 郝欣雨, 陳美霞, 劉慧敏, 臧長江, 鄭楠, 王加啟. 不同儲(chǔ)運(yùn)條件

對(duì) UHT 滅菌乳中糠氨酸含量的影響[J].

中國乳品工業(yè). 2022. 50(08):31-34.

45. 遲雪露, 劉慧敏, 葉巧燕, 鄭楠, 王加啟. 奶中風(fēng)味物質(zhì)檢測技術(shù)

研究進(jìn)展[J].

中國乳品工業(yè). 2022. 50(04):40-45+56.

46. 黃胥萊, 高亞男, 張養(yǎng)東, 王加啟, 鄭楠. 食品中鍶功能的研究進(jìn)

展[J].

食品科學(xué). 2022. 1-15.

47. 楊雪, 高亞男, 王加啟, 鄭楠. 短鏈脂肪酸的功能研究進(jìn)展[J].

食品科學(xué). 2022. 1-16.

（二） 著 作

1. 中國奶業(yè)質(zhì)量報(bào)告（2022）. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社

2. 青貯飼料制作與質(zhì)量安全控制技術(shù). 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社

一、成果概覽 █

﹣13﹣

3. Frontiers in Dairy Cows Nutrition and Milk Quality. 中國農(nóng)業(yè)科

學(xué)技術(shù)出版社

4. 奶牛養(yǎng)殖減抗技術(shù)指南. 中國農(nóng)業(yè)出版社

5. 奶牛學(xué). 中國農(nóng)業(yè)出版社

6. 復(fù)原乳. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社

7. 即食生乳及其制品. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社

8. 牛奶對(duì)健康的雙重營養(yǎng)功能-嬰幼兒篇. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社

9. 牛奶對(duì)健康的雙重營養(yǎng)功能-青少年篇. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社

10. 牛奶對(duì)健康的雙重營養(yǎng)功能-中青年篇. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社

11. 牛奶對(duì)健康的雙重營養(yǎng)功能-老年篇. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社

12. 牛奶對(duì)健康的雙重營養(yǎng)功能-孕婦篇. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社

（三） 發(fā)明專利

1. 趙圣國；王加啟；鄭楠. 一種化合物及其在改善動(dòng)物瘤胃微生物發(fā)

酵中的用途. ZL 20211062703.1

2. 趙圣國；王加啟；鄭楠；張曉音. 一種生物堿類化合物及其在改善

動(dòng)物瘤胃微生物發(fā)酵中的用途. ZL 202110626888.X

3. 趙圣國；王加啟；鄭楠. 調(diào)控反芻動(dòng)物瘤胃微生物發(fā)酵的植物源天

然化合物及其應(yīng)用. ZL 202110684164.2

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣14﹣

（四） 標(biāo) 準(zhǔn)

1. 劉慧敏、葉巧燕、鄭楠、王加啟、屈雪寅、張寧、郭夢薇、郭洪俠、

遲雪露. 嬰幼兒配方乳粉中 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白的測定 凝

膠色譜法. T/TDSTIA 025-2022. 團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

2. 鄭楠、張永久、張養(yǎng)東、王加啟、孟璐、劉慧敏、李雪、屈雪寅.

嬰幼兒配方乳粉新鮮度. T/TDSTIA 027-2022. 團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

3. 解慶剛、王象欣、屈雪寅、劉慧敏、王坤、趙昕、楊惠秀、鄭楠.

嬰幼兒食品和乳品中骨橋蛋白的測定 高效液相色譜法 .

T/TDSTIA 028-2022. 團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

4. 屈雪寅、趙昕、劉慧敏、劉龍飛、鄭桂亮、張彩霞、徐紅、王坤、

楊惠秀、鄭楠. 乳及乳制品商業(yè)無菌檢驗(yàn) 三磷酸腺苷生物熒光法.

T/TDSTIA 029-2022. 團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

5. 趙圣國、鄭楠、張養(yǎng)東、劉慧敏、王加啟、田錦秀. 飼料用緩釋包

被尿素. T/TDSTIA 030-2022. 團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

二、研究進(jìn)展 █

﹣15﹣

二、研究進(jìn)展

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣16﹣

領(lǐng)域一：奶牛健康養(yǎng)殖與牛奶品質(zhì)形成機(jī)理

1. 宏基因組指導(dǎo)未培養(yǎng)微生物分離培養(yǎng)的機(jī)遇與挑戰(zhàn)

宏基因組指導(dǎo)未培養(yǎng)微生物分離培養(yǎng)方法

二、研究進(jìn)展 █

﹣17﹣

摘要

宏基因組測序技術(shù)讓人們對(duì)地球上微生物的多樣性有了更深入

的了解，但分離培養(yǎng)是研究微生物的生理代謝功能并解析其生態(tài)作用

的關(guān)鍵。目前環(huán)境中的大多數(shù)微生物仍未被分離培養(yǎng)，因此，分離未

培養(yǎng)微生物是當(dāng)前研究的首要任務(wù)。分離的微生物菌株可用于開發(fā)新

的益生菌、生物調(diào)控劑和農(nóng)業(yè)工業(yè)添加劑等。當(dāng)前，宏基因組數(shù)據(jù)日

益豐富，為指導(dǎo)靶標(biāo)微生物的分離和培養(yǎng)帶來了新的機(jī)遇。本文介紹

了基于宏基因組數(shù)據(jù)分離和培養(yǎng)靶標(biāo)微生物的新方法及應(yīng)用，主要包

括特定培養(yǎng)條件的設(shè)計(jì)、特異性抗體捕獲分離、靶向基因篩選分離等

技術(shù)。通過未培養(yǎng)微生物基因組信息預(yù)測其代謝特征和生長需求，為

分離培養(yǎng)新的微生物并解析其功能特征提供了突破機(jī)遇。

1 前言

微生物是地球上已知的最早生命形式，其生存的歷史可追溯到30

多億年前。微生物的多樣性很高，存在于幾乎所有的環(huán)境如土壤、海

洋等，以及宿主體內(nèi)，例如動(dòng)物腸道、植物根際等，它們與宿主共同

進(jìn)化并與宿主的健康和相關(guān)功能緊密關(guān)聯(lián)。微生物具有巨大代謝和生

理多樣性，在地球上幾乎所有生物化學(xué)循環(huán)過程中都是必不可少的。

此外，微生物與宿主相互作用在自然界中廣泛存在，微生物可以幫助

宿主吸收或合成機(jī)體必需的營養(yǎng)物質(zhì)，分解代謝機(jī)體無法消化的底物，

另外，微生物自身也可以作為營養(yǎng)來源被宿主利用。它們還可以保護(hù)

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣18﹣

宿主免受病原體和有毒物質(zhì)的侵害，調(diào)節(jié)寄主的生理功能，包括免疫、

發(fā)育、甚至社會(huì)行為。隨著 DNA 測序技術(shù)的不斷發(fā)展，改變了我們

對(duì)地球上微生物多樣性的認(rèn)識(shí)，特別是細(xì)菌和古菌。同時(shí)，這些研究

也揭示了大多數(shù)微生物物種仍未被培養(yǎng)，其中包括很多優(yōu)勢物種。因

此，目前我們對(duì)微生物的了解，部分來自少數(shù)已被分離培養(yǎng)的物種，

部分來自測序獲得的基因組數(shù)據(jù)。雖然基于測序技術(shù)為微生物的多樣

性和功能提供了很多重要的新見解，但獲得重要的未培養(yǎng)微生物的純

菌株對(duì)于直接評(píng)估其代謝和生理功能以更好地理解它們?cè)谧匀画h(huán)境

中的生物學(xué)和生態(tài)學(xué)作用至關(guān)重要。

隨著“組學(xué)”的不斷發(fā)展，人們認(rèn)識(shí)到培養(yǎng)微生物的重要性，在

過去的十年里，將未被培養(yǎng)的微生物“暗物質(zhì)”進(jìn)行分離培養(yǎng)越來越

受研究者的關(guān)注。傳統(tǒng)的非靶向微生物培養(yǎng)方法和高通量培養(yǎng)方法如

培養(yǎng)組學(xué)分離了許多新的和未被培養(yǎng)的微生物。但這種方法費(fèi)時(shí)，需

要消耗很多材料，并且不一定能捕獲群落中重要的靶標(biāo)微生物群。因

此，通過靶標(biāo)微生物的基因組數(shù)據(jù)，確定其獨(dú)特屬性以制定分離策略

具有重要的應(yīng)用前景?；诤昊蚪M測序或單細(xì)胞測序獲得微生物的

基因組，對(duì)靶向分離微生物具有巨大的潛力，這種方法充分挖掘并利

用了未培養(yǎng)微生物的生物和遺傳資源。本文對(duì)利用宏基因組數(shù)據(jù)指導(dǎo)

的微生物分離培養(yǎng)方法的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

二、研究進(jìn)展 █

﹣19﹣

2 未培養(yǎng)微生物

目前估計(jì)的全球微生物多樣性仍存在很大爭議，基于 16S rRNA

基因數(shù)據(jù)集估算全球細(xì)菌和古細(xì)菌的多樣性，預(yù)測存在 220-430 萬個(gè)

原核生物可操作分類單元（OTUs；以 97%相似性進(jìn)行聚類）。但全

球原核生物的數(shù)量遠(yuǎn)超過該數(shù)字，因?yàn)檫@些研究中無法獲得物種的基

因組和菌株表型多樣性的數(shù)據(jù)。此外，真菌、原蟲和其他單細(xì)胞真核

生物等重要微生物類群在多樣性估算中經(jīng)常被忽略，但它們對(duì)微生物

生態(tài)系統(tǒng)的功能具有重要貢獻(xiàn)。目前，已被培養(yǎng)的細(xì)菌物種大多來自

四個(gè)細(xì)菌門：擬桿菌門、變形菌門、厚壁菌門和放線菌門。這些細(xì)菌

門在腸道微生物群落中占主導(dǎo)地位，這可能是由于人們對(duì)人類腸道菌

群研究較多。此外，據(jù)估計(jì)，全球微生物群落中，未被培養(yǎng)的微生物

屬和門分別占 81%和 25%。環(huán)境中未培養(yǎng)的微生物物種占主導(dǎo)位置，

具有重要的生態(tài)作用，因此深入了解它們的生物學(xué)特性對(duì)于揭示它們

對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的貢獻(xiàn)是至關(guān)重要的。在過去十年中，從不同環(huán)境中分離

和培養(yǎng)微生物的進(jìn)展緩慢，因?yàn)槿藗儗?duì)大多數(shù)微生物生長所需的復(fù)雜

因素仍不了解，導(dǎo)致無法在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離培養(yǎng)。微生物生長的自然

環(huán)境通常是復(fù)雜的，并且不同微生物物種生長的最適 pH 值、溫度、

壓力以及未知生長因子等參數(shù)各不相同，因此很難模擬其營養(yǎng)需求。

此外，一些微生物生活在厭氧或其他極端環(huán)境中，這需要在實(shí)驗(yàn)室配

置相關(guān)的專業(yè)設(shè)備。有些微生物在自然界中以休眠狀態(tài)存在，導(dǎo)致在

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣20﹣

實(shí)驗(yàn)室中難以分離培養(yǎng)。在自然環(huán)境中，有些微生物需要交叉喂養(yǎng)或

與宿主及其他群落成員進(jìn)行相互作用。環(huán)境中一些低豐度或稀有微生

物，需要進(jìn)行富集后才能被分離，同時(shí)也需要其他強(qiáng)有力的篩選和分

析方法。分離生長緩慢的細(xì)菌是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)，因?yàn)樵隗w外

分離時(shí)，這些細(xì)菌可能無法與快速生長的細(xì)菌相競爭。

3 微生物培養(yǎng)的重要性

純菌株是直接研究微生物功能的重要生物資源，可通過功能表型

特征鑒定基因組預(yù)測的新基因，從而提高基因注釋的準(zhǔn)確性。純菌株

還可構(gòu)建參考基因組，聯(lián)合參考基因組、宏基因組及宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可

進(jìn)一步解析微生物群落的功能。此外，純菌株能為生物產(chǎn)業(yè)或健康產(chǎn)

業(yè)提供新的生產(chǎn)思路和生物資源。

純菌株可以研究微生物在特定條件下的代謝活性，揭示其未知的

生理特性。這些特性無法從基因組數(shù)據(jù)中推斷出來，因?yàn)榛蚪M信息

是無法確定哪些基因可以表達(dá)的，也無法確定不同基因產(chǎn)物之間的相

互作用以及不同環(huán)境條件對(duì)基因表達(dá)的影響。有研究通過對(duì)純菌株進(jìn)

行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了新的生化途徑和酶促反應(yīng)，而這些功能信息通過基因

組數(shù)據(jù)是無法獲得的。宏基因組學(xué)是解析未培養(yǎng)微生物強(qiáng)有力的工具，

讓科學(xué)家提出了很多新的假設(shè)，但活的純菌株是驗(yàn)證這些假設(shè)的重要

資源。此外，物種間的相互作用、進(jìn)化原理、種群動(dòng)態(tài)和致病性也只

有通過純菌株才能得到證實(shí)。微生物純培養(yǎng)物還可應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)、

二、研究進(jìn)展 █

﹣21﹣

益生菌開發(fā)等生產(chǎn)中。未來可收集代表性培養(yǎng)物構(gòu)建微生物資源庫，

實(shí)現(xiàn)資源共享，用于開發(fā)新的生物技術(shù)。

微生物純培養(yǎng)物可豐富參考基因組數(shù)據(jù)庫和系統(tǒng)分類，這將進(jìn)一

步增加對(duì)生態(tài)系統(tǒng)中微生物功能的認(rèn)識(shí)。目前在 KEGG 等基因數(shù)據(jù)

庫中，幾乎有一半的基因功能無法確定，此外，很多注釋是不準(zhǔn)確的。

通過微生物純培養(yǎng)對(duì)鑒定的基因進(jìn)行功能驗(yàn)證，將大大提高注釋范圍

和準(zhǔn)確性，從而進(jìn)一步提高未培養(yǎng)微生物的可培養(yǎng)性。此外，微生物

分類是描述微生物多樣性的核心。目前，國際原核生物命名規(guī)則是基

于可培養(yǎng)微生物進(jìn)行，未培養(yǎng)微生物無法被正式命名。雖然為了改變

這一現(xiàn)狀，有研究者提出通過 DNA 序列作為微生物命名的依據(jù)，但

如果沒有該新物種可培養(yǎng)的代表菌株，則不能在分類學(xué)上進(jìn)行準(zhǔn)確的

描述。此外，有研究者建議開發(fā)一個(gè)未培養(yǎng)原核生物的命名代碼，將

未培養(yǎng)微生物的分類整合到現(xiàn)有分類框架中。

有些微生物無法單獨(dú)生長，因此富集培養(yǎng)和共培養(yǎng)對(duì)了解這些微

生物也很有價(jià)值。富集培養(yǎng)是通過設(shè)計(jì)特定的生長條件，優(yōu)先刺激特

定微生物的生長，來提高樣品中特定微生物類群的豐度。如果目標(biāo)微

生物的生長依賴于其他微生物，例如交叉喂養(yǎng)（一種微生物的代謝產(chǎn)

物作為另一種微生物生長的底物），則需要將兩種或多種微生物進(jìn)行

共培養(yǎng)。

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣22﹣

未培養(yǎng)微生物分離培養(yǎng)的意義

4 宏基因組數(shù)據(jù)重建微生物基因組及其代謝途徑

宏基因組學(xué)是對(duì)微生物群落中所有基因組進(jìn)行研究，通常采用鳥

槍法測序?qū)ξ⑸镞M(jìn)行物種分類和功能注釋。宏基因組序列組裝是指

將每個(gè) DNA 序列拼接在一起，這是基因組分析的一個(gè)關(guān)鍵步驟。宏

基因組組裝基因組（MAGs）是通過對(duì)具有相似特征的 contigs 進(jìn)行分

箱和質(zhì)量控制生成的。

短讀長測序技術(shù)(NGS)如 Illumina 測序，因其高通量和低成本而

廣泛應(yīng)用。微生物基因組可以通過短讀長測序數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，但宏基

因組組裝的基因組會(huì)受到重復(fù)元件的限制，而長讀長測序可能克服這

一問題。長讀長序列可以跨越 16S rRNA 基因、微型倒置重復(fù)轉(zhuǎn)座元

驗(yàn)證功能基因

驗(yàn)證互作關(guān)系

揭示代謝特征

開發(fā)新生物技術(shù)

構(gòu)建種質(zhì)資源庫

揭示功能機(jī)制

二、研究進(jìn)展 █

﹣23﹣

件、轉(zhuǎn)座子、基因復(fù)制和原噬菌體序列等常見的重復(fù)元件，顯著提高

MAGs 的組裝質(zhì)量。隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，長讀長測序技術(shù)如單

管長片段序列(stLFR)、PacBio 和 Nanopore 等已得到應(yīng)用。這些技術(shù)

已成功從土壤、淡水湖和人類糞便等樣本中重建了完整的或單個(gè)環(huán)狀

的基因組。雖然 MAGs 已經(jīng)成為宏基因組數(shù)據(jù)分析流程中的標(biāo)準(zhǔn)方

法,但它在 16S rRNA 基因、生物合成基因簇(BGCs)、潛在污染、嵌合

基因、染色體或基因缺失、區(qū)分多個(gè)染色體和染色體外成分的能力上

仍有局限。使用長讀長測序技術(shù)和新的分箱算法可提高 MAGs 的質(zhì)

量，有時(shí)可以產(chǎn)生完整的環(huán)形 MAG，從而提高功能注釋和代謝途徑

重塑的效率。

除了宏基因組測序，單細(xì)胞測序是另一種獲得微生物基因組信息

的方法。單細(xì)胞測序是對(duì)環(huán)境樣本中的單一細(xì)胞進(jìn)行測序得到其基因

組信息，該方法在本文中也進(jìn)行了討論，因?yàn)樵摲椒ㄍ瑯涌梢垣@得未

培養(yǎng)微生物的基因組信息。該技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成熟，目前可進(jìn)行高通量

測序，一次試驗(yàn)可得到數(shù)百個(gè)高質(zhì)量的微生物單細(xì)胞基因組(SAG)，

對(duì)指導(dǎo)分離尚未培養(yǎng)的微生物提供基因數(shù)據(jù)。

將 MAGs 或 SAGs 預(yù)測的基因進(jìn)行功能注釋，重建微生物的代

謝途徑，對(duì)于理解微生物潛在功能至關(guān)重要，可幫助實(shí)現(xiàn)微生物的分

離培養(yǎng)。宏基因組功能注釋包括兩個(gè)步驟:基因預(yù)測和基因注釋?；?/p>

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣24﹣

注釋常用的數(shù)據(jù)庫包括 KEGG、EggNOG、dbCAN、RGI、GO、COG、

MetaCyc、BioCyc、Brenda、Rhea、EcoCyc 等。

基于公共數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有的參考代謝途徑，可以基于微生物蛋白質(zhì)

序列的同源性進(jìn)行比對(duì)，預(yù)測和重建微生物代謝途徑。目前重建代謝

途徑的方法包括:BlastKOALA、KAAS、GhostKOALA 和 RAST。然

而，仍有許多代謝途徑無法被識(shí)別，或代謝途徑中的部分環(huán)節(jié)無法被

識(shí)別，僅能構(gòu)建出一個(gè)不完整的代謝途徑。此外，這些方法不能預(yù)測

參考途徑中不存在的新反應(yīng)或酶。為了避免出現(xiàn)上述情況，需要對(duì)基

因間的聯(lián)系有充分了解，如基因-基因間的相互作用，然后根據(jù)微生物

的功能和系統(tǒng)發(fā)育分析進(jìn)行分類。通過解析這些數(shù)據(jù)，確定微生物的

營養(yǎng)和生長需求，指導(dǎo)未培養(yǎng)微生物分離和培養(yǎng)。

基于微生物的基因組信息，可以設(shè)計(jì)分離未培養(yǎng)微生物的方法或

策略。這些方法與傳統(tǒng)的非靶向和高通量培養(yǎng)方法如培養(yǎng)組學(xué)、原位

培養(yǎng)、單細(xì)胞分離和 iChip 可相互補(bǔ)充。宏基因組數(shù)據(jù)分析方法和新

培養(yǎng)方法的不斷發(fā)展，為開發(fā)設(shè)計(jì)靶向分離目標(biāo)種類或功能微生物的

方法提供了新思路。

5 宏基因組數(shù)據(jù)指導(dǎo)的微生物分離方法

5.1 優(yōu)化培養(yǎng)基

二、研究進(jìn)展 █

﹣25﹣

了解營養(yǎng)需求和代謝特性對(duì)未培養(yǎng)微生物分離和培養(yǎng)是至關(guān)重

要的。宏基因組數(shù)據(jù)提供了微生物代謝、底物利用、氧需求、抗生素

耐藥性等信息，也提供了微生物與宿主相互作用信息，為微生物培養(yǎng)

基和生長條件的設(shè)計(jì)提供了理論依據(jù)(圖 1)。然而，通過基因組數(shù)據(jù)

了解目標(biāo)微生物的生理特征并不容易，這需要深厚的代謝途徑和生理

學(xué)知識(shí)背景。但是，這些方法已經(jīng)成功用于海洋和腸道等不同環(huán)境中

分離和培養(yǎng)新的微生物。

Tyson 等通過解析酸性礦井排水生物膜的宏基因組數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)改

良培養(yǎng)基成份，成功分離到一株 參與固氮的鉤端螺旋體

（Leptospirillum）。鉤端螺旋體（Leptospirillum）基于 16S rRNA 基

因被分為 I、II、III 三類。在該研究之前，已經(jīng)得到了 I 類和 II 類的

代表菌株，但 III 類的代表菌株仍未被分離培養(yǎng)。Tyson 等人在 III 類

鉤端螺旋體（Leptospirillum）的基因組中發(fā)現(xiàn) nif 基因操縱子，這在

II 類中是缺失的。作者推斷，同樣存在于生物膜中的 II 類鉤端螺旋體

（Leptospirillum）缺乏固氮基因。因此，作者設(shè)計(jì)了無氮培養(yǎng)基，成

功分離出第一個(gè) III 類鉤端螺旋體（Leptospirillum）的代表菌株。

當(dāng)攝入相同的能量時(shí)，食草性塔瑪沙袋鼠(Tammar wallaby,

Macropus eugenii)比反芻動(dòng)物瘤胃產(chǎn)生的甲烷少很多，研究顯示食草

性塔瑪沙袋鼠(Tammar wallaby, Macropus eugenii)的腸道微生物群組

成獨(dú)特，來自琥珀酸弧菌科(Succinovibrionaceae)的 OTUs 與甲烷產(chǎn)量

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣26﹣

相關(guān)。Pope 等人利用 MAG 數(shù)據(jù)，部分重建了琥珀酸弧菌科

(Succinovibrionaceae)WG-1 的氮和碳利用途徑及抗生素耐藥性。預(yù)測

發(fā)現(xiàn) WG-1 的碳水化合物發(fā)酵底物為淀粉，其基因組中包括脲酶基因

簇，編碼運(yùn)輸和代謝尿素所需的所有基因（13 個(gè)）。根據(jù)這些信息，

作者設(shè)計(jì)了一種培養(yǎng)基，以淀粉和尿素作為唯一的碳源和氮源?；?/p>

組中包含一個(gè)桿菌肽抗性基因，所以在培養(yǎng)基中添加了桿菌肽。作者

成功利用該培養(yǎng)基從袋鼠食糜樣品中富集 WG-1，并通過稀釋平板法

分離到純菌株。該研究對(duì) WG-1 的底物利用和培養(yǎng)發(fā)酵進(jìn)行了詳細(xì)的

描述，對(duì)研究細(xì)菌與產(chǎn)甲烷菌的營養(yǎng)互作提供了基礎(chǔ)。

宏基因組測序能鑒定新微生物生長所需的特定底物，利用該信息

設(shè)計(jì)培養(yǎng)條件從而實(shí)現(xiàn)對(duì)新物種的分離培養(yǎng)。Lugli 等人利用該方法

成功從動(dòng)物糞便樣品中分離出新的雙歧桿菌。首先，對(duì)宏基因組數(shù)據(jù)

進(jìn)行組裝，然后將預(yù)測的基因與糖基水解酶(GH)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，評(píng)

估雙歧桿菌可發(fā)酵的多糖。作者預(yù)測新雙歧桿菌發(fā)酵碳源為阿拉伯半

乳聚糖、支鏈淀粉、淀粉和木聚糖四種多糖。因此，作者分別利用上

述碳源作為唯一碳源設(shè)計(jì)培養(yǎng)基，進(jìn)行分離培養(yǎng)試驗(yàn)。結(jié)果培養(yǎng)出了

13 株表型不同的雙歧桿菌分離株，其中 2 株為新的雙歧桿菌。

Karnachuk 等人從水井深水層分離了一種嗜熱螺旋體，命名為 BY33，

是屬于 Brevinematales 的一個(gè)新科。首先，作者從深水層的宏基因組

數(shù)據(jù)集中鑒定出了一種新的 MAG。通過基因注釋發(fā)現(xiàn)了編碼利用淀

二、研究進(jìn)展 █

﹣27﹣

粉和麥芽糖/麥芽糖糊精 ABC 運(yùn)輸系統(tǒng)的基因，可攝取胞外淀粉的水

解產(chǎn)物。最后，利用添加麥芽糖和淀粉的改良螺旋體培養(yǎng)基進(jìn)行富集

和培養(yǎng)，成功分離出 BY33。Renesto 等人通過基因組分析發(fā)現(xiàn)，

Tropheryma whipplei 在氨基酸生物合成方面存在代謝缺陷。

Tropheryma whipplei 的基因組中缺乏 9 種氨基酸的合成途徑(組氨酸、

色氨酸、亮氨酸、精氨酸、脯氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸和天

冬酰胺)，表明 T. whipplei 需要從外部環(huán)境中獲取這些氨基酸或其前

體物。因此，作者設(shè)計(jì)了一種包含這些氨基酸的培養(yǎng)基，并成功分離

出了之前培養(yǎng)過的3株T. whipplei，并從臨床樣本中分離出1株新菌。

雖然該例子僅是利用了基因組序列數(shù)據(jù)，但這種方法可以應(yīng)用于未培

養(yǎng)的 SAGs 和 MAGs 數(shù)據(jù)。

解析微生物的最適生長條件也是分離培養(yǎng)微生物的一個(gè)重要因

素。David 等人報(bào)道了一種工具，可以根據(jù)微生物的基因組信息預(yù)測

其最佳生長溫度。作者指出，同樣的原理可以應(yīng)用于其他的因素，比

如溫度、pH 值、鹽濃度、滲透壓或氧濃度等。這些信息對(duì)于從極端

環(huán)境中分離微生物例如嗜冷菌、嗜熱菌、耐高鹽菌等是至關(guān)重要的。

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣28﹣

基于特定培養(yǎng)條件的設(shè)計(jì)分離靶標(biāo)微生物的方法流程

5.2 使用抗生素

微生物對(duì)抗生素的抗性表型直接與特定的微生物類群相關(guān)聯(lián)。宏

基因組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)分析能夠分析微生物群的抗生素耐藥基因(ARGs)及

其共現(xiàn)模式(圖 1)。因此，可以通過該方法檢測和評(píng)估不同微生物分

類群對(duì)抗生素耐藥性特征。繪制微生物的抗生素抗性圖譜，可以有針

對(duì)性地分離未被培養(yǎng)的特定微生物類群。Rettedel 等人利用該方法揭

示了人類腸道菌群中 16 種抗生素耐藥表型的分布特征。利用不同組

合抗生素的培養(yǎng)基，作者分離了四種微生物，其中兩種是屬于

二、研究進(jìn)展 █

﹣29﹣

Oscillibacter 屬的新物種。在 Pope 等人的研究中，組裝的 WG-1 基因

組中發(fā)現(xiàn)了桿菌肽抗性基因，作者在設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基中添加桿菌肽，最

后也成功分離出 WG-1。因此，抗生素抗性表型在分離培養(yǎng)中具有重

要指導(dǎo)意義。

5.3 穩(wěn)定性同位素標(biāo)記輔助拉曼活性微生物細(xì)胞分選（RACS）

另一種分離新微生物的方法是利用穩(wěn)定性同位素探針標(biāo)記的拉

曼活性微生物細(xì)胞分選，該方法能夠獲得可培養(yǎng)的活細(xì)胞(圖 1)。通

過宏基因組數(shù)據(jù)可獲得微生物的代謝、底物利用、氧需求、抗生素耐

藥性等性狀的信息，根據(jù)這些信息可針對(duì)靶標(biāo)微生物設(shè)計(jì)培養(yǎng)基并創(chuàng)

造其最適的生長條件。已有研究證明，拉曼顯微鏡技術(shù)結(jié)合氘同位素

探針(DIP)可以在特定的培養(yǎng)基中識(shí)別具有代謝活性的靶標(biāo)細(xì)菌。因

此，可以通過基于 MAGs 或 SAGs 信息設(shè)計(jì)特定的培養(yǎng)基，在使用穩(wěn)

定性同位素氘標(biāo)記的重水(D2O)中培養(yǎng)靶標(biāo)細(xì)菌。D2O 是一種有效的

DIP 探針，它的 C-D 波段在拉曼光譜檢測時(shí)會(huì)在 2000-2300cm-1 產(chǎn)生

偏移。當(dāng)微生物樣品在含有特定代謝底物和 D2O 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，

具有代謝活性的細(xì)菌會(huì)在單細(xì)胞拉曼光譜中產(chǎn)生 C-D 波段偏移，基

于單細(xì)胞拉曼光譜，利用 RACS 便可分離具有代謝活性的靶標(biāo)微生

物。

Yi 等人使用 RACS 技術(shù)從人體腸道微生物群中原位檢測具有代

謝活性的耐藥菌群。取糞便樣品在添加 40% D2O (v/v)和抗生素(阿莫

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣30﹣

西林、頭孢氨芐、氟苯尼考、四環(huán)素和萬古霉素)的 PBS 中培養(yǎng) 24 小

時(shí)(37 ) ℃ 。他們成功地分選出六種微生物類群，包括兩種阿莫西林耐

藥菌(AmoxR)、兩種頭孢菌素耐藥菌(CephR)和兩種頭孢菌素敏感菌

(CephS)。Kang 等人利用這種方法對(duì)小鼠腸道中分解粘蛋白的細(xì)菌進(jìn)

行分選。將小鼠結(jié)腸內(nèi)容物懸浮于含 50% D2O 的 PBS 和粘蛋白中，

厭氧孵育后利用 RACS 分選出一類可降解粘蛋白的菌群，其中包括

Muribaculaceae 科的多個(gè)新菌。

只要微生物細(xì)胞在拉曼光譜中有特定的峰，RACS 平臺(tái)就可以通

過相應(yīng)的參數(shù)對(duì)這一類細(xì)胞進(jìn)行分類。例如，Yun 等人利用 13C 和 15N

從口腔分離出五種不同類型的細(xì)菌。這些研究表明拉曼活細(xì)胞分選技

術(shù)在靶向識(shí)別和分離特定代謝過程中的關(guān)鍵微生物方面具有潛力。

5.4 反向基因組（特異性抗體）指導(dǎo)微生物分離

Cross 等人介紹了一種基于基因組信息設(shè)計(jì)和制備特異性抗體的

分離方法，通過熒光標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合細(xì)胞分選技術(shù)可從復(fù)雜微

生物群落中分離新的微生物，這一方法被稱為反向基因組學(xué)（reverse

genomics）。該方法使用特異性抗體，能夠有效地標(biāo)記靶細(xì)胞，同時(shí)

保留其培養(yǎng)活性(圖 2)。該方法流程如下,根據(jù)未培養(yǎng)的微生物基因組

數(shù)據(jù)的 MAGs 或 SAGs 信息確定感興趣的菌株,預(yù)測靶標(biāo)微生物基因

編碼的膜蛋白與細(xì)胞外的抗原表位，合成抗原蛋白后制備特異性抗體，

二、研究進(jìn)展 █

﹣31﹣

然后用熒光標(biāo)記抗體。被標(biāo)記的抗體與靶標(biāo)微生物的樣本結(jié)合，利用

熒光細(xì)胞分選技術(shù)從樣品中分離被熒光標(biāo)記的靶標(biāo)微生物細(xì)胞。該方

法可使靶細(xì)胞在整個(gè)分選過程中保持活性，可用于后續(xù)的培養(yǎng)和功能

驗(yàn)證等試驗(yàn)。

Cross 等人利用該方法從人唾液樣本中分離培養(yǎng)了

Saccharibacteria (TM7)的三個(gè)不同物種。作者利用唯一的 TM7 基因

組，基于 IMG 數(shù)據(jù)庫(https://img.jgi.doe.gov)注釋編碼膜蛋白的基因。

利用TMHMM v.2.0分析錨定跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域，排除假設(shè)的和短于100

個(gè)氨基酸的蛋白。剩余序列與從人類口腔微生物組數(shù)據(jù)庫中

(http://www.homd.org/)下載的所有口腔細(xì)菌的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)

分析。隨后分析候選靶標(biāo)序列跨膜結(jié)構(gòu)域的數(shù)量、預(yù)測的胞外結(jié)構(gòu)域

的數(shù)量、大小與豐度以及與免疫相關(guān)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。排在首位的是 PBP2，

PBP2 的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)和抗 PBP2 抗體與致病菌細(xì)胞表面結(jié)合的

研究均已被報(bào)道。利用 ABCpred59、BepiPred60、IEBD Analysis

Resource (http://tools.immuneepitope.org/bcell)和 Bio-Synthesis peptide

design tools (https://www.biosyn.com)對(duì)蛋白序列進(jìn)行抗原區(qū)域和親水

性分析。抗原肽通過商業(yè)途徑生物合成，在 C 端(PBP2)添加半胱氨

酸，純化后注射于兔體內(nèi)。HiTrap Protein A HP 抗體純化柱(GE BioSciences)純化 IgG。Alexa Fluor 488 Antibody labeling Kit (A20181)試

劑盒對(duì) IgG 熒光標(biāo)記。熒光標(biāo)記的抗體與樣品孵育后，利用流式細(xì)胞

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣32﹣

儀分選被標(biāo)記的靶標(biāo)微生物，隨后通過平板分離培養(yǎng)靶標(biāo)微生物。為

了測試該方法的適用性，作者選擇了一個(gè)沒有 3D 結(jié)構(gòu)和抗原-抗體試

驗(yàn)數(shù)據(jù)的蛋白質(zhì) CpsC。作者在口腔細(xì)菌基因組數(shù)據(jù)庫中沒有發(fā)現(xiàn)與

CpsC 同源性超過 30%的蛋白。Cross 等人首次分離培養(yǎng)了人口腔樣本

中豐度較低的 SR1/Absconditabbacteria。反向基因組學(xué)分離微生物的

方法對(duì)分離未培養(yǎng)的感興趣的微生物特別是生長緩慢、豐度低和稀有

的物種具有很大的應(yīng)用潛力。

基于反向基因組學(xué)的方法分離靶標(biāo)微生物的方法流程

5.5 靶向功能基因分離策略

二、研究進(jìn)展 █

﹣33﹣

宏基因組數(shù)據(jù)可以檢測功能基因的變異、低豐度和稀有物種，用

以分離攜帶靶標(biāo)基因的微生物。Ma 等人描述了一種基于宏基因組測

序數(shù)據(jù)分離培養(yǎng)攜帶靶標(biāo)基因微生物的方法。該方法使用帶有納米孔

的微流體裝置進(jìn)行，該裝置可將每個(gè)單菌隔開獨(dú)立生長，主要包括兩

個(gè)步驟:首先確定靶標(biāo)微生物的培養(yǎng)條件然后進(jìn)行分離。將樣品在生

長介質(zhì)中稀釋使在微流控芯片的每個(gè)孔中最多只有一個(gè)細(xì)胞。為了避

免一個(gè)孔中出現(xiàn)多個(gè)細(xì)胞，需保證一定數(shù)量孔是空的。培養(yǎng)一段時(shí)間

后，微流控芯片可將每個(gè)菌落分成 2 份，其中 1 份用于對(duì)靶標(biāo)基因進(jìn)

行 PCR，以確定靶標(biāo)微生物。將樣品置于芯片上進(jìn)行培養(yǎng)，然后通過

PCR 篩選，確定含有靶標(biāo)微生物的孔，從芯片的另一份對(duì)應(yīng)的孔中取

出樣品進(jìn)行富集培養(yǎng)（圖 3）。Ma 等人利用該方法分離培養(yǎng)了來自

人盲腸中來自瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）的一個(gè)新屬代表菌。這

種方法克服了不同微生物生長動(dòng)力學(xué)的偏差，試驗(yàn)裝置體積小可節(jié)約

試驗(yàn)材料，并可置于厭氧箱分離厭氧菌，比如腸道菌群。微體積培養(yǎng)

的難點(diǎn)是氣體基質(zhì)的提供。但是，最近出現(xiàn)的微液滴供氧新方法或許

可以應(yīng)用于微體積培養(yǎng)。

熒光原位雜交(FISH)標(biāo)記的樣品可以利用熒光激活細(xì)胞分選

(FACS)進(jìn)行分類以富集被標(biāo)記的細(xì)胞，因此可利用宏基因組序列信

息對(duì)目標(biāo)微生物設(shè)計(jì)探針，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)微生物的富集分離培養(yǎng)。然

而，標(biāo)準(zhǔn)的 FISH 程序需要對(duì)樣品進(jìn)行固定，使微生物失去活性無法

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣34﹣

進(jìn)行分離培養(yǎng)。有研究通過修改 FISH 程序，去除了固定的步驟，改

進(jìn)后的程序可保留微生物的活性，用于后續(xù)分離培養(yǎng)試驗(yàn)。Tan 等人

通過宏基因組測序數(shù)據(jù)設(shè)計(jì) FISH 探針，用于分離污水處理廠樣本中

的微生物。探針以 V6 的高可變區(qū)域序列為模板進(jìn)行設(shè)計(jì)，長度 33bp,

通過設(shè)計(jì)的探針和 FISH–FACS 成功的富集了一個(gè)鞘脂桿菌目

（Sphingobacteriales）的新細(xì)菌分類單元(UPWRP_1)。基于高可變區(qū)

域序列信息設(shè)計(jì)的探針可鑒定到菌株水平，結(jié)合 FISH 活細(xì)胞分選，

可以分離培養(yǎng)靶標(biāo)微生物。

一些抗生素通過直接與細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)結(jié)合發(fā)揮作用，因此可將其

作為細(xì)菌標(biāo)記探針用于分離特定種類的微生物。該方法已分別在體外

和體內(nèi)被應(yīng)用于鑒別不同的細(xì)菌種類。

此外，基因組編輯技術(shù)也可用于分離新的靶標(biāo)微生物。基于

MAGs 序列信息對(duì)特定基因進(jìn)行編輯，改造靶標(biāo)微生物基因組，結(jié)合

含有選擇性抗生素或底物的培養(yǎng)基，分離編輯后的靶標(biāo)微生物(圖 3)。

Rubin 等人通過編輯微生物群落中特定微生物的基因組并對(duì)其進(jìn)行分

離，從而驗(yàn)證了該方法的適用性。作者利用 VcDART 轉(zhuǎn)座子設(shè)計(jì)了

缺失 pyrF 基因的克雷伯菌（Klebsiella michiganensis）和假單胞菌

（Pseudomonas simiae）突變株。突變株包含攜帶兩種抗生素抗性基

因的轉(zhuǎn)座子，分別對(duì)鏈霉素、大幕霉素和青霉素耐藥。通過該方法，

作者成功富集了目標(biāo)微生物（豐度達(dá) 99%）。此外，對(duì)靶標(biāo)微生物的

二、研究進(jìn)展 █

﹣35﹣

乳糖同化基因進(jìn)行編輯，并在生長培養(yǎng)基中添加乳糖作為唯一碳源，

成功富集了靶標(biāo)微生物使其豐度達(dá)到 95%。基因編輯技術(shù)指導(dǎo)的富集

方法也具有很高的特異性，可以區(qū)分同一物種中的不同菌株，例如大

腸桿菌的亞群 2 和 3。

基于靶標(biāo)基因靶向分離微生物方法流程

6 挑戰(zhàn)與局限性

雖然已經(jīng)有許多研究利用宏基因組數(shù)據(jù)成功地分離和培養(yǎng)了靶

標(biāo)微生物，但想要分離更多的微生物，仍存在一些挑戰(zhàn)和局限性。反

向基因組（特異性抗體）為靶向分離培養(yǎng)微生物提供了一個(gè)新機(jī)會(huì)，

但該方法仍存在一些局限性。首先，有些微生物無法確定合適的胞外

抗原表位，可根據(jù)親緣關(guān)系相近物種的同源基因進(jìn)行預(yù)測，但該方法

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣36﹣

僅對(duì)部分微生物有效。其次，如果目標(biāo)膜蛋白的表達(dá)水平低則無法獲

得其抗體，可通過基因表達(dá)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)鑒定高表達(dá)量的膜蛋白。

最后，靶標(biāo)抗原表位如果存在翻譯后修飾如糖基化，可能會(huì)阻礙抗體

的識(shí)別。為了避免上述問題，進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)可以選擇多個(gè)抗原表位，或

者使用整個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域，但可能會(huì)降低特異性。

利用細(xì)胞分選方法分離靶標(biāo)厭氧微生物更具有技術(shù)挑戰(zhàn)。由于細(xì)

胞分選儀器較大，很難放入?yún)捬跸洌虼?，可開發(fā)在厭氧條件下使用

的熒光細(xì)胞分選儀器。分離到靶標(biāo)微生物后，需確定其合適的生長介

質(zhì)和培養(yǎng)條件。但是，微生物棲息的自然生態(tài)環(huán)境組分是復(fù)雜的，甚

至有些成份是未知的，有些微生物單靠基因組序列不能提供足夠的信

息來準(zhǔn)確地確定其生長所需的所有必要條件。例如，Lavy 等人根據(jù)

Poribacteria sp. WGA-4E 的基因組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)了一種培養(yǎng)基。雖然根據(jù)

基因組數(shù)據(jù)預(yù)測了該細(xì)菌門的代謝特性，比如以尿素為氮源，能同化

硫酸鹽，但根據(jù)這一信息設(shè)計(jì)的特定培養(yǎng)基并沒有捕獲到靶標(biāo)菌株。

Poribacteria 菌的生長除了上述所需的營養(yǎng)成分，可能還需要某些未

知的信號(hào)分子。將宏基因組學(xué)方法與培養(yǎng)組學(xué)、原位培養(yǎng)、單細(xì)胞分

離、析因試錯(cuò)法等相結(jié)合，將提高成功分離培養(yǎng)靶標(biāo)微生物的機(jī)會(huì)。

基于基因組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)目標(biāo)微生物的培養(yǎng)策略，很大程度上依賴于

提取的 DNA 質(zhì)量，但可能存在細(xì)胞裂解、DNA 提取不完全或 DNA

降解等問題，這可能會(huì)影響某些物種在宏基因組數(shù)據(jù)中的代表性。單

二、研究進(jìn)展 █

﹣37﹣

細(xì)胞基因組學(xué)是重建靶標(biāo)微生物基因組的另一種方法，但這需要更專

業(yè)的細(xì)胞分離、基因組擴(kuò)增、測序和分析技術(shù)。

7 結(jié)論

DNA 測序技術(shù)的快速發(fā)展揭示了自然界中存在大量尚未培養(yǎng)的

微生物。目前面臨的挑戰(zhàn)是利用這些數(shù)據(jù)指導(dǎo)未培養(yǎng)微生物的分離，

探索微生物在其自然棲息地的生態(tài)特征。宏基因組測序不僅揭示了微

生物組的種類和功能特征，還為分離和培養(yǎng)微生物提供了新的思路和

策略，具有很大的應(yīng)用潛力。隨著長讀長 DNA 測序技術(shù)的進(jìn)展、測

序深度的增加和生物信息學(xué)方法的更新，MAGs 的質(zhì)量不斷提高，使

基因注釋和代謝途徑預(yù)測更加準(zhǔn)確?；谶@些數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)特定培養(yǎng)基、

特異性抗體和靶基因或探針的培養(yǎng)方法，從不同環(huán)境中分離出多種微

生物。通過宏基因組數(shù)據(jù)指導(dǎo)微生物的分離方法，大大增加了成功培

養(yǎng)靶標(biāo)微生物的機(jī)會(huì)。然而，靶向分離和培養(yǎng)的過程往往是復(fù)雜的，

需要深入解析基因組數(shù)據(jù)來預(yù)測微生物的培養(yǎng)條件，分離或分選過程

涉及的先進(jìn)儀器和技術(shù)，有些微生物實(shí)驗(yàn)室不具備。靶向分離培養(yǎng)方

法可以節(jié)約目標(biāo)微生物的分離時(shí)間。目前面臨的挑戰(zhàn)是如何利用豐富

的宏基因組數(shù)據(jù)實(shí)現(xiàn)高通量靶向培養(yǎng)。結(jié)合一些先進(jìn)的新培養(yǎng)方法，

將有助于實(shí)現(xiàn)對(duì)未培養(yǎng)微生物分離培養(yǎng)的新突破。

（撰稿人：劉思佳，校稿人：張曉音）

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣38﹣

LIU SIJIA, CHRISTINA D. MOON, ZHENG NAN, SHARON

HUWS, ZHAO SHENGGUO, WANG JIAQI.Opportunities and

challenges of using metagenomic data to bring uncultured microbes into

cultivation.

Microbiome. 2022, 10(1):76.

二、研究進(jìn)展 █

﹣39﹣

2. 荷斯坦奶牛生乳總固形物含量的變化與瘤胃細(xì)菌群落有關(guān)

總?cè)楣腆w（TMS）是乳脂、乳蛋白、乳糖和礦物質(zhì)的總和，能夠

直接反映生乳的質(zhì)量，同時(shí)也是一些國家牛乳貿(mào)易的定價(jià)指標(biāo)。TMS

的前體物質(zhì)包括揮發(fā)性脂肪酸（VFA）、長鏈脂肪酸、氨基酸（AA）、

肽、葡萄糖、甘油等，這些物質(zhì)主要通過瘤胃微生物分解日糧降解而

產(chǎn)生。因此，瘤胃中 TMS 前體物的生成量與乳腺的攝取量之間存在

關(guān)系。因此，提高 TMS 含量是提高生乳質(zhì)量和奶牛生產(chǎn)效率的有效

措施。

影響 TMS 含量的因素有很多，如日糧、環(huán)境和動(dòng)物遺傳等。優(yōu)

質(zhì)粗飼料在全混合日糧（TMR）中的適當(dāng)比例是保證 TMS 含量的關(guān)

鍵因素。季節(jié)對(duì) TMS 存在一定影響，如夏季奶牛的 TMS 含量低于冬

季。Dechow 等人（2007）報(bào)道，雜交奶牛的 TMS 含量顯著高于荷斯

坦奶牛。同樣的品種，當(dāng)奶牛飼喂相同的飼料時(shí)，飼料轉(zhuǎn)化效率、產(chǎn)

奶量和乳蛋白產(chǎn)量存在較大的個(gè)體差異。了解導(dǎo)致這些個(gè)體差異的原

因?qū)τ谔岣?TMS 和牛奶質(zhì)量很重要。已有研究發(fā)現(xiàn)，這些個(gè)體差異

與瘤胃細(xì)菌和瘤胃發(fā)酵密切相關(guān)。例如，飼料轉(zhuǎn)化效率高的奶牛其埃

氏巨球菌的相對(duì)豐度顯著高于飼料轉(zhuǎn)化效率低的奶牛，而產(chǎn)奶量較低

的奶牛的鏈球菌、未分類腸桿菌科、反芻桿菌、密螺旋體和未分類類

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣40﹣

桿菌科相對(duì)豐度均較高，表明瘤胃細(xì)菌在飼料轉(zhuǎn)化為牛奶的過程中起

著關(guān)鍵作用。

本研究旨在探討瘤胃細(xì)菌與 TMS 含量之間的關(guān)系。我們選擇

TMS 含量高和低的奶牛，采用 16S rRNA 基因測序和實(shí)時(shí)定量 PCR

技術(shù)測定其瘤胃細(xì)菌群落的差異，并分析微生物與 TMS 含量的關(guān)系。

1 試驗(yàn)方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組和管理

本試驗(yàn)從 1500 多頭荷斯坦奶牛中挑選 45 頭體重、胎次（胎次為

1.30±0.74）、產(chǎn)奶天數(shù)（153±16d）和日產(chǎn)奶量（34±6kg）均相似的

健康泌乳奶牛，作為試驗(yàn)動(dòng)物。使用 MilkoScan FT120 測定所有動(dòng)物

的生乳樣品（生乳采集見下文），如乳蛋白質(zhì)、乳脂、乳糖和 TMS 含

量。根據(jù)先前的研究方法，將奶牛分為高 TMS（HS，TMS>平均數(shù)+0.7

SD）表型和低 TMS（LS，TMS<mean-0.7 SD）表型。本研究的目的

是探討在產(chǎn)奶量相近的奶牛中，瘤胃細(xì)菌與 TMS 之間的關(guān)系。產(chǎn)奶

量的巨大變化可能會(huì)對(duì) TMS 產(chǎn)生混淆影響。為了盡量減少兩組之間

除 TMS 之外的其他潛在影響因素，本試驗(yàn)去除了每組中產(chǎn)奶量極高

或極低的奶牛。最后，每組中保留 6 頭產(chǎn)奶量相似的奶牛（n=6）。

所有試驗(yàn)?zāi)膛＞S持在相同的飼養(yǎng)條件下，飼喂相同的日糧。TMR

由玉米青貯飼料、苜蓿干草、苜蓿青貯、玉米、豆粕、桔皮顆粒、膨

化大豆和 DDGS 等組成，精粗比為 64：36。所有奶牛單獨(dú)飼養(yǎng)，每

二、研究進(jìn)展 █

﹣41﹣

天分別在 07:00、13:00 和 18:00 飼喂，自由飲水。每天記錄奶牛的給

料量和剩料量，用于計(jì)算每頭奶牛的日采食量。每天在 06:30、12:30

和 17:30 使用自動(dòng)擠奶系統(tǒng)擠奶 3 次，每日產(chǎn)奶量由自動(dòng)擠奶系統(tǒng)記

錄。

1.2 樣品的采集

14 天飼養(yǎng)期結(jié)束后，采集生乳樣品和瘤胃液樣品。按照 4:3:3 的

比例將上午、下午和晚上的生乳樣品進(jìn)行混合，作為一天的樣品。每

頭奶牛的瘤胃液樣本（約 200 mL）在早晨擠奶后喂料前進(jìn)行采集，

使用口腔胃管插入法采集。使用 pH 計(jì)立即測定 pH 值。然后，通過

4 層紗布過濾瘤胃液，并將其等分到 6 個(gè)滅菌管（5 mL）中，儲(chǔ)存于

-80℃條件下，用于進(jìn)一步分析。

1.3 指標(biāo)的測定

取冷凍的瘤胃液樣品分別對(duì) VFA，氨態(tài)氮和微生物蛋白進(jìn)行測

定。另取一份樣品提取微生物總 DNA，并進(jìn)行質(zhì)量檢測。以樣品 DNA

為模板，用引物 341F (5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3')和 806R (5'-

GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')擴(kuò)增細(xì)菌 16S rRNA 基因的 V3-

V4 區(qū)域，并構(gòu)建文庫，然后于 Illumina Hiseq 2500 平臺(tái)進(jìn)行高通量測

序。針對(duì)上機(jī)測得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行生信分析，得到每個(gè)樣品中瘤胃細(xì)

菌的相對(duì)豐度。用數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析對(duì) HS 和 LS 組進(jìn)行差異分析，用熒

光定量 PCR 技術(shù)對(duì)部分差異細(xì)菌進(jìn)行定量分析。

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣42﹣

2 結(jié)果與討論

如表 1 所示所示，LS 奶牛的干物質(zhì)攝入量比 HS 低 11.0%，此

外，HS 組的粗蛋白（CP）攝入量、中性洗滌纖維（NDF）攝入量和

酸性洗滌纖維（ADF）攝入量均顯著高于 LS 組（P<0.01）。兩組之

間的產(chǎn)奶量無顯著差異（P=0.932）。HS 組 TMS 的含量和產(chǎn)量、乳

脂率、乳蛋白含量和脂蛋白比均顯著高于LS組。所有試驗(yàn)?zāi)膛５腡MS

含量在 10.4%到 14.1%之間變異，之前有研究曾報(bào)道過奶牛個(gè)體間飼

料利用效率、氮利用效率和乳蛋白產(chǎn)量均存在較大的個(gè)體差異，這與

本研究的結(jié)果如出一轍。從結(jié)果中可以看出，HS 組 TMS、乳脂率和

乳蛋白含量較高的原因可能歸因于奶牛的干物質(zhì)采食量、粗蛋白、中

性洗滌纖維和酸性洗滌纖維采食量較高。

表 1 HS 組和 LS 組采食量和乳成分的差異

二、研究進(jìn)展 █

﹣43﹣

兩組之間的 pH、NH3-N 和 MCP 濃度沒有顯著差異，HS 組的丙

酸和戊酸濃度顯著高于 LS 組（表 2）。TMS 的前體物在瘤胃中的產(chǎn)

生主要受日糧攝入量和瘤胃發(fā)酵的影響。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn) HS

組奶牛瘤胃總 VFA 濃度相對(duì)高于 LS 組奶牛，HS 組的 TMS 較高可

能是由于 VFA 濃度的差異，而 VFA 濃度的差異歸因于 DMI（包括

CP、NDF 和 ADF 攝入量）變化引起的發(fā)酵速率的差異。VFA 是 TMS

的主要前體，因此 VFA 濃度越高，TMS 含量越高，這也解釋了 HS

組奶牛乳脂含量顯著高于 LS 組的原因。此外，單個(gè)揮發(fā)性脂肪酸的

摩爾百分比沒有顯著變化，這表明瘤胃發(fā)酵模式?jīng)]有改變。pH 和 NH3-

N 的相似性表明，飼喂相同 TMR 的奶牛具有穩(wěn)定的酸堿環(huán)境。兩組

之間微生物蛋白的相似性解釋了兩組中乳蛋白沒有差異的原因。

表 2 HS 組和 LS 組瘤胃發(fā)酵發(fā)酵參數(shù)的差異