DOI:10.16605/j.cnki.1007-7847.2022.11.0229

斑馬魚 prkd1 基因在心臟早期發(fā)育過程中的作用

研究

李韻璇1

, 陳 宇2, 3

, 吳錦秋1

, 游詩琦1

, 李永青1

, 朱 平2, 3

, 吳秀山1, 3

, 江志鋼1*

,

王躍群1*

(1. 湖南師范大學(xué) 心臟發(fā)育研究中心 省部共建淡水魚類發(fā)育生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國(guó)湖南 長(zhǎng)沙 410081; 2. 廣東省

心血管病研究所 廣東省人民醫(yī)院 廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院, 中國(guó)廣東 廣州 510100; 3. 廣東省心臟病發(fā)病機(jī)制與精準(zhǔn)防治重點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)室, 中國(guó)廣東 廣州 510100)

摘 要: 為了探究蛋白激酶 D (protein kinase D, PKD; 又名 PRKD)家族典型成員 prkd1 基因?qū)υ缙谛呐K發(fā)育的

影響, 選用模式動(dòng)物斑馬魚為研究對(duì)象, 設(shè)計(jì)了嗎啉代反義寡核苷酸敲低實(shí)驗(yàn)。表型觀察結(jié)果顯示, prkd1 基因

敲低會(huì)導(dǎo)致斑馬魚心臟發(fā)育異常, 出現(xiàn)心包水腫、環(huán)化異常、心管線性化等畸形表型; 斑馬魚心率分析數(shù)據(jù)顯

示, 與野生型斑馬魚相比, prkd1 基因的敲低會(huì)導(dǎo)致早期斑馬魚心率降低。利用轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)受精

后 3 d (3 days post fertilization, 3 dpf)的斑馬魚對(duì)照組和敲低 prkd1 組進(jìn)行測(cè)序, 差異基因富集分析表明, prkd1

的敲低與心臟相關(guān)信號(hào)通路如心肌細(xì)胞的腎上腺素信號(hào)通路等顯著相關(guān)。進(jìn)一步通過 qRT-PCR 對(duì)高通量測(cè)

序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證, 并對(duì)早期心臟發(fā)育關(guān)鍵因子進(jìn)行檢測(cè), 結(jié)果顯示, 部分心血管相關(guān)基因顯著下調(diào), tbx5a、gata4

等心臟調(diào)控關(guān)鍵基因同樣顯著下調(diào)。這些表明 prkd1 基因可能通過調(diào)控心臟發(fā)育相關(guān)信號(hào)通路以及心臟發(fā)育

關(guān)鍵基因來影響早期心臟發(fā)育, 在早期心臟發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞: 心臟發(fā)育; prkd1 基因; 斑馬魚; 嗎啉代反義寡核苷酸(MO)

中圖分類號(hào): Q756 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號(hào): 1007-7847(2023)02-0095-09

Role of the prkd1 Gene in Early Cardiac Development in Zebrafish

LI Yunxuan1

, CHEN Yu2, 3

, WU Jinqiu1

, YOU Shiqi1

, LI Yongqing1

, ZHU Ping2, 3

,

WU Xiushan1, 3

, JIANG Zhigang1*

, WANG Yuequn1*

(1. The Center for Heart Development, State Key Laboratory of Freshwater Fish Development Biology, Hunan Normal University,

Changsha 410081, Hunan, China; 2. Guangdong Cardiovascular Institute, Guangdong Provincial People’s Hospital, Guangdong

Academy of Medical Sciences, Guangzhou 510100, Guangdong, China; 3. Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenesis,

Targeted Prevention and Treatment of Heart Disease, Guangzhou 510100, Guangdong, China)

收稿日期: 2022-11-17; 修回日期: 2022-12-06; 網(wǎng)絡(luò)首發(fā)日期: 2022-12-10

基金項(xiàng)目: 廣東省人民醫(yī)院院內(nèi)博士后進(jìn)站啟動(dòng)項(xiàng)目(BY012022004); 國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31872315); 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目

(2018YFA0108700, 2017YFA0105602); 國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)國(guó)際(地區(qū))合作與交流項(xiàng)目(81720108004)

作者簡(jiǎn)介: 李韻璇(1998— ), 女, 湖南婁底人, 碩士研究生; 李韻璇和陳宇對(duì)本文的貢獻(xiàn)相同, 為本文共同第一作者;

* 通信作者: 王躍群

(1964— ), 女, 湖南長(zhǎng)沙人, 博士, 教授, 主要從事心臟發(fā)育基因調(diào)控和心臟疾病發(fā)生的分子機(jī)制研究, E-mail: yuequnwang@hunnu.edu.cn; 江

志鋼(1982— )，男，湖南長(zhǎng)沙人，博士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事心臟發(fā)育方向的研究，E-mail: 270212729@qq.com。

Abstract: To investigate the role of the prkd1 gene, a typical member of the protein kinase D (PRKD) family,

in early heart development, zebrafish was used as an animal model in this study. Through prkd1 knockdown

with morpholino antisense oligo (MO), it was found that knockdown of prkd1 resulted in abnormal cardiac development, such as pericardial edema, cyclization disorder, cardiac tube linearization. Zebrafish heart rate

analysis indicated that, compared with the wild type, prkd1 knockdown zebrafish exhibited early arrhythmia.

High-throughput transcriptome sequencing was performed for zebrafish embryos at 3 days post fertilization

(dpf) in control and prkd1 knockdown groups. Differential gene enrichment analysis revealed that prkd1

knockdown was significantly associated with heart-related signaling pathways, such as the adrenergic signaling

第 27 卷 第 2 期 生命科學(xué)研究 災(zāi)燥造援27 暈燥援2

圓園23 年 4 月 蘊(yùn)蚤棗藻 雜糟蚤藻灶糟藻 砸藻澤藻葬則糟澡 Apr. 圓園23

窯遺傳與發(fā)育窯

生 命 科 學(xué) 研 究 圓園23 年

先天性心臟病作為人類心臟發(fā)育最常見的畸

形形式, 在世界范圍內(nèi)保持著居高不下的發(fā)病率

與死亡率[1]。公認(rèn)的先天性心臟病包括房室間隔缺

損、法洛四聯(lián)癥、主/肺動(dòng)脈瓣狹窄、血管錯(cuò)位等病

征[2]。研究表明, 遺傳因素是先天性心臟病發(fā)生的

主要原因[3]

, 因此, 對(duì)控制先天性心臟病發(fā)生的基

因展開功能研究十分有必要。

斑馬魚作為模式動(dòng)物, 有許多利于其用于心

臟疾病研究的特點(diǎn)。胚胎時(shí)期, 斑馬魚無色透明,

心臟特征清晰可見, 研究者僅通過普通光學(xué)顯微

鏡就可以直接對(duì)心臟和血液進(jìn)行觀察[4]。斑馬魚體

型小, 可通過被動(dòng)擴(kuò)散的方式使氧氣到達(dá)全身各

處組織, 從而保證胚胎發(fā)育過程中所需的氧氣供

應(yīng), 因此在胚胎發(fā)育的早期階段, 有嚴(yán)重心臟畸

形的個(gè)體也能存活數(shù)天時(shí)間[4-5]。斑馬魚后代數(shù)量

多, 有利于后續(xù)的遺傳和統(tǒng)計(jì)分析[6]。此外, 有研

究表明, 斑馬魚基因組序列與人類基因組序列具

有高達(dá) 70%的同源性[3]。這些獨(dú)特的天然優(yōu)勢(shì)使

得斑馬魚成為心血管研究領(lǐng)域的首選模式生物

之一。

prkd1 基因編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 D

(protein kinase D, PKD; 又名 PRKD)家族的成員

PRKD1, 該激酶在細(xì)胞增殖分化、血管生成、免疫

調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等多種生理過程中發(fā)

揮作用[7]。前期研究表明, PRKD1 基因與先天性心

臟病具有密切聯(lián)系[2, 7-10]

, 但其調(diào)控機(jī)制尚不明確,

有待深入探究。有研究報(bào)道, 域類組蛋白脫乙酰

酶(histone deacetylases, HDACs)與心臟肥大的抑

制相關(guān), PRKD1 能通過磷酸化心肌細(xì)胞中的HDAC5 刺激核輸出, 進(jìn)而增加心臟肥大相關(guān)因子的

轉(zhuǎn)錄活性; 此外, HDACs 的磷酸化會(huì)導(dǎo)致其與肌

細(xì)胞增強(qiáng)因子 2 (myocyte enhancer factor 2, MEF2)

的分離, 從而影響心臟發(fā)育[2, 11-12]。在針對(duì)人類先

天性心臟病家族病例的研究中, Massadeh 等[2]發(fā)現(xiàn)

了一種基于 PRKD1 的新型常染色體隱性突變,

該基因中的雙等位基因截?cái)嗤蛔兛赡軐?dǎo)致非綜合

征型先天性心臟病。心臟特異性 Prkd1 缺失的小

鼠會(huì)下調(diào)心臟肥大、纖維化等相關(guān)基因的激活; 而

且, 在慢性腎上腺素能或血管緊張素域處理的情

況下, 心臟特異性 Prkd1 缺失的小鼠表現(xiàn)出對(duì)心

臟肥大的抵抗, 這意味著 Prkd1 在心肌病與病理

性心臟重塑中具有重要作用[9-10]。Prkd1 完全敲除

小鼠純合致死, 其心臟表型尚無法確認(rèn)[2]。鑒于斑

馬魚胚胎心臟畸形的個(gè)體也能存活數(shù)天時(shí)間的特

點(diǎn), 斑馬魚 prkd1 基因的缺失可以用于研究早期

心臟發(fā)育過程, 而相關(guān)研究尚未見報(bào)道。因此, 本

研究旨在以斑馬魚嗎啉代反義寡核苷酸(morpholino antisense oligo, MO)敲低為研究模型, 探究

prkd1 對(duì)早期心臟發(fā)育的影響, 為人類先天性心

臟病發(fā)病機(jī)制的研究提供新的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 斑馬魚品系的養(yǎng)殖

本研究用到的 AB 品系野生型斑馬魚為本實(shí)

驗(yàn)室自行飼養(yǎng)、繁殖。根據(jù)國(guó)家斑馬魚中心養(yǎng)殖方

案, 本實(shí)驗(yàn)室將成魚飼養(yǎng)在 28.5 益循環(huán)水系統(tǒng)中,

pH 維持在 6.8~7.6。性成熟斑馬魚交配前一晚, 將

雌魚與雄魚以 2︰1 的性別比分別置于雜交缸的

隔板兩側(cè), 第二日一早喂食換水后, 給予光照, 將

隔板去除, 斑馬魚自然交配產(chǎn)卵。

1.2 MO 設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)選用的是翻譯抑制型嗎啉代反義寡核

苷酸, 由 Gene Tools 公司設(shè)計(jì)并合成。prkd1 基因

的 MO 序列和對(duì)照 MO 序列分別為: CGGATTAC原

CGGAGGTACGCTCAT 和 CCTCTTACCTCAGTTACAATTTAT。

1.3 斑馬魚胚胎顯微注射

胚胎受精后, 吸取處于 1 細(xì)胞期的胚胎, 均

勻排布在注射板上。用無菌水按照 1︰1 的比例稀

釋 prkd1-MO 樣品原液, 使 prkd1-MO 樣品濃度

pathway in cardiomyocytes. Additionally, the results of high-throughput sequencing were confirmed by qRTPCR, which showed that some genes associated with the cardiovascular system were markedly down-regulated.

Meanwhile, identification of the essential factors in early heart development revealed that key cardiac regulatory genes like tbx5a and gata4 were significantly down-regulated. These findings suggest that the prkd1

gene may affect early cardiac development by regulating cardiac development-related signal pathways and

key genes, and play an important role at the early stage of heart development.

Key words: cardiac development; prkd1; zebrafish; morpholino antisense oligo (MO)

（Life Science Research，2023，27（2）：095-103）

96

第 2 期 李韻璇等：斑馬魚 prkd1 基因在心臟早期發(fā)育過程中的作用研究

為 0.5 mmol/L, 隨后將其添加至注射針中, 并將注

射針安裝至顯微注射儀上。根據(jù) Xu 等[13]的方案,

將樣品注射進(jìn)胚胎中, 每個(gè)胚胎約注射 1 nL。將注

射后的胚胎收集到加有 E3 養(yǎng)殖水(60 mL 5 mol/L

NaCl, 10 mL 1 mol/L KCl, 20 mL 1 mol/L MgSO4,

2.94 g CaCl2·2H2O,1g 亞甲基藍(lán)粉末, 無菌水補(bǔ)

充至 1 L)的培養(yǎng)皿中, 放至 28.5 益培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

對(duì)照組(control-MO 組)處理同上。

1.4 死亡率分析

分別于受精后 12 h (12 hours post fertilization,

12 hpf)、24 h、36 h、48 h、72 h 對(duì)存活和死亡的

control-MO 組、prkd1-MO 組胚胎計(jì)數(shù)。死亡胚胎

數(shù)與總胚胎數(shù)的比值為死亡率, 利用 GraphPad

Prism 6 進(jìn)行后續(xù)分析與制圖。

1.5 顯微觀察

隨機(jī)收取注射 control-MO 和 prkd1-MO 的幼

魚, 在 48 h、72 h 時(shí)分別置于顯微鏡(Carl Zeiss AG

公司, 德國(guó))下觀察, 并對(duì)典型心臟畸形如心包水

腫、心管線性化等進(jìn)行拍照記錄以及統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 心率分析

隨機(jī)收取 48 hpf、72 hpf 時(shí)期的 control-MO

組和 prkd1-MO 組幼魚, 依次置于玻片上, 利用顯

微鏡的高速攝像頭對(duì)單條幼魚的心臟進(jìn)行拍照和

錄像。錄像以 16 bit 錄制 10 s, 隨后將原文件導(dǎo)入

SOHA 心率分析軟件進(jìn)行分析, 以橫坐標(biāo)、縱坐標(biāo)

為軸, 框選出心臟舒張的最大位置與收縮的最小

位置, 標(biāo)記心率峰值, 導(dǎo)出數(shù)值, 輸入 GraphPad

Prism 6 進(jìn)行后續(xù)分析與制圖。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR

分別隨機(jī)收集 24 hpf、48 hpf、72 hpf 時(shí)期的

control-MO 組與 prkd1-MO 組斑馬魚胚胎, 每管

30 顆。使用 TRIzol 法提取總 RNA, 隨后使用逆轉(zhuǎn)

錄酶(Takara 公司, 日本)將其反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。使

用 2伊 SYBR Green qRT-PCR Master Mix 試劑(Selleck 公司, 美國(guó))進(jìn)行 PCR 實(shí)驗(yàn), 總反應(yīng)體系為

10 滋L, 其中 2 伊 SYBR Green qRT -PCR Master

Mix 5 滋L, H2O 2.8 滋L, 模板 1 滋L, 正反向引物各

0.5 滋L, ROX 域 0.2 滋L。Quant Studio 6 實(shí)時(shí)熒光

定量 PCR 系統(tǒng)(Applied Biosystems 公司, 德國(guó))設(shè)

置的反應(yīng)程序?yàn)? 95 益預(yù)變性 120 s; 95 益變性

15 s、60 益退火 30 s, 循環(huán) 40 次; 溶解曲線程序。

Control-MO 組與 prkd1-MO 組靶基因的相對(duì)表達(dá)

量選用 2

-駐駐Ct 法計(jì)算, 并輸入 GraphPad Prism 6 進(jìn)

行后續(xù)分析與制圖。PCR 引物序列見表 1。

1.8 轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

隨機(jī)收取 72 hpf 時(shí)期的 control -MO 組和

prkd1-MO 組幼魚, 使用 TRIzol 法提取總 RNA 進(jìn)

行轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序。利用 NanoDrop 2000 檢測(cè)

所提 RNA 的濃度和純度, 采用瓊脂糖凝膠電泳

檢測(cè) RNA 的完整性, 采用 Agilent 2100 測(cè)定RNA

完整值(RNA integrity number, RIN)。文庫(kù)采用Illumina TruseqTM RNA Sample Prep Kit 方法構(gòu)建, 所

有樣品(每組 3 個(gè)重復(fù))送至上海派森諾生物科技

股份有限公司進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用 DESeq 工具對(duì)基因

進(jìn)行差異表達(dá)分析, 對(duì)差異表達(dá)分析結(jié)果中的顯

著差異基因集進(jìn)行統(tǒng)計(jì), 并對(duì)每個(gè)比較組的上調(diào)

差異基因和下調(diào)差異基因計(jì)數(shù)。使用 R 語言對(duì)所

有比較組的差異基因進(jìn)行雙向聚類分析, 根據(jù)同

一基因在不同樣品中的表達(dá)水平和同一樣品中不

同基因的表達(dá)模式, 采用歐幾里得(Euclidean)法計(jì)

算距離, 通過層次聚類最長(zhǎng)距離法進(jìn)行聚類。

基因本體論(Gene Ontology, GO; http://www.geneontology.org, 2022-11-16)是將全世界所有與基

因有關(guān)的研究結(jié)果進(jìn)行分類匯總的綜合數(shù)據(jù)庫(kù)。

本研究使用 top GO 進(jìn)行 GO 富集分析, 利用 GO

術(shù)語注釋的差異基因計(jì)算每個(gè)術(shù)語的基因列表和

基因數(shù)目, 通過超幾何分布方法計(jì)算 P-value (顯

著富集的標(biāo)準(zhǔn)為 P-value<0.05), 找出在整個(gè)基因

組背景下差異基因顯著富集的 GO 術(shù)語, 從而確

定差異基因行使的主要生物學(xué)功能。

京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(Kyoto Encyclopedia

of Genes and Genomes, KEGG; http://www.genome.

jp/kegg, 2022-11-16)是基因組破譯方面的公共數(shù)

據(jù)庫(kù)。本研究通過 KOBAS (http://kobas.cbi.pku.edu.

cn/home.do)獲取 KEGG 通路注釋信息, 使用 clusterProfiler 進(jìn)行 KEGG 富集分析, 利用 KEGG 通路

注釋的差異基因計(jì)算每個(gè)通路的基因列表和基因

數(shù)目, 通過超幾何分布方法計(jì)算 P-value (顯著富

集的標(biāo)準(zhǔn)為 P-value<0.05), 找出在整個(gè)基因組背

景下差異基因顯著富集的 KEGG 通路, 從而確定

差異基因行使的主要生物學(xué)功能。

2 結(jié)果

2.1 prkd1 基因敲低影響斑馬魚心臟發(fā)育

2.1.1 prkd1 敲低導(dǎo)致心臟畸形

分別將 control-MO 和 prkd1-MO 注射至 1 細(xì)

胞期的斑馬魚受精卵中, 培養(yǎng)至 24 hpf, 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)

顯示, 與 control-MO 對(duì)照組相比, prkd1-MO 處理

97

生 命 科 學(xué) 研 究 圓園23 年

表 1 熒光定量 PCR 引物序列

Table 1 Primers used for real-time fluorescence quantitative PCR analysis

Primer Sequence

actc1a

ryr2

cacng8b

cacna1da

tpm1

adrb1

atf2

akt3a

atp1b2a

myl2b

cacna2d3

cacna1fb

cacnb4a

calml4a

adcy1a

adcy2a

bcl2b

casp8

ctsbb

prkcg

si:ch73-55i23.1

cox8b

tbx5a

gata4

hand2

nkx2.5

茁-actin

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

Sense

Antisense

5憶ACTCCAGTCTTGCGCTACAA3憶

5憶TACCAACCATCACACCCTGG3憶

5憶AAGACGATGCTGTCTTGGGG3憶

5憶CTCTATGGAGCGCTGACTGG3憶

5憶CAACGGGTCACTGAGACCAA3憶

5憶TTCTCACACACCATGCCTGA3憶

5憶GCAACACAAACCCAGTTCGAG3憶

5憶AGCCGTGAAAGCATAGTCAAA3憶

5憶CACTCAGCGTCTCCGGTTTG3憶

5憶CACATCACCTTCAGCTGTTTCT3憶

5憶TACAGAGAAGCCAAACAGCA3憶

5憶TGTTGTAGAACCTTCCCTCAC3憶

5憶CTCTCTGCCTCCGTCCACTA3憶

5憶GTGCCGGACACGGGAACTAT3憶

5憶AGATCCCAACAAGAGACTTGG3憶

5憶GGTTTGAGCTGTGAACTCTTC3憶

5憶CCCTACAACGACACAGTCCA3憶

5憶TCCCAACTTTGTATTTCTTCGC3憶

5憶AGAGAAGCTTAAAGGTGCCGAT3憶

5憶GGTCTTTCTCCTCCCCGTGA3憶

5憶CTACGTCGACAGCGCACTTG3憶

5憶GTCAGGGTGCAACAGGAGAT3憶

5憶CTACTGCTCTACAGGCGGG3憶

5憶GGCTTCTGCTTAAGGGCTCA3憶

5憶CCTCCATATGATGTGGTTCC3憶

5憶CATATCTGTCACCTCGTATCC3憶

5憶GCTCACAGACAAAGAAGTGGATG3憶

5憶CCACTGTAGGAAGTGTGACCA3憶

5憶GTGGAGCCAGGATTTGGTCA3憶

5憶TCGTAACGCTCGTCTCTTGT3憶

5憶CCCTGGGATCAGATTCTGGC3憶

5憶TAACAGACGTTCCTGCTGACG3憶

5憶GCGCTTCAACGCAGTCATAG3憶

5憶CCACAAATGCTTCCCAACCG3憶

5憶AGACCAGGAACAAGGAGGCAG3憶

5憶CTGTAGTAATTGTGCCAGCCG3憶

5憶GTCAATTTCGACAATGTGCC3憶

5憶CGTTTGTGGAGTGTTTCACAG3憶

5憶CACCGATTTCATCTGGGGGA3憶

5憶TAGAGCAGTGAACCGCAGTG3憶

5憶ACATGCTGTACCTGCAAAGTCT3憶

5憶ATCCGTCAGCACCTGAGAAC3憶

5憶TCCGGCTTCAATCGCTCTTT3憶

5憶ATGCAATCACTTGCTCCCCA3憶

5憶AAACCACAAGATCACCCAG3憶

5憶TGCAGCTCCATATCATCAC3憶

5憶CGGGTGGGTTTATCCT3憶

5憶ATCGCCGACTGACCTT3憶

5憶GGACATTCTGGACAAAGATGAA3憶

5憶GCCAACCAGTTCTCCCTTTA3憶

5憶ATGCCATCCGGATCCTCTCT3憶

5憶TCAGATCTTACCCGGGTCT3憶

5憶GACCAGCTAGATCCAGACGC3憶

5憶GCTCCCCTGAATCCCAAAGC3憶

組的斑馬魚胚胎發(fā)育遲緩, 死亡率升高(圖 1)。隨

著胚胎發(fā)育至 48 hpf, 注射 prkd1-MO 的斑馬魚

胚胎可見明顯心臟畸形, 出現(xiàn)心包水腫、心管線性

化等缺陷表型(圖 2A~D); 發(fā)育至 72 hpf 時(shí), 相比

98

第 2 期

圖 1 敲低 prkd1 導(dǎo)致的斑馬魚胚胎死亡率及不同類型心臟畸形比例(72 hpf)的統(tǒng)計(jì)圖

(A) 斑馬魚胚胎死亡率; (B) 不同類型心臟畸形比例。PE: 心包水腫; CTL: 心管線性化; LD: 環(huán)化異常。n=3, *

: P<0.05, **: P<0.01,

***: P<0.001, ns: 無顯著變化。

Fig.1 Statistical chart of the mortality and proportion of different types of cardiac malformations (72 hpf) in zebrafish

embryos caused by prkd1 knockdown

(A) The embryonic mortality of zebrafish; (B) The rate of various types of heart malformations. PE: Pericardial edema; CTL: Cardiac tube linearization; LD: Looping disorder. n=3, *

: P<0.05, **: P<0.01, ***: P<0.001, ns: No significant change.

control-MO 對(duì)照組, prkd1-MO 組斑馬魚胚胎出

現(xiàn)環(huán)化異常等心臟畸形(圖 2E~H)。在顯微鏡下觀

察 72 hpf 時(shí)期 control-MO 組和 prkd1-MO 組斑

馬魚不同類型的心臟畸形并計(jì)數(shù), 結(jié)果顯示, 心

包水腫、心管線性化、環(huán)化異常這三類心臟畸形在

control-MO 組中出現(xiàn)的比例依次為 5.40%、1.51%

和 1.45%, 而其在 prkd1-MO 組中出現(xiàn)的比例顯

著增加, 依次為 88.50%、32.80%和 42.90% (圖1B)。

2.1.2 prkd1 敲低影響斑馬魚心率

為了探究 prkd1 的敲低是否會(huì)影響斑馬魚的

心率, 我們對(duì) 48 hpf、72 hpf 的 control-MO 組與

prkd1-MO 組幼魚進(jìn)行了心率檢測(cè)分析(圖 3)。經(jīng)

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn), 相比 control-MO 組, prkd1-MO

組幼魚表現(xiàn)出異常降低的心率。研究結(jié)果證明,

prkd1 的敲低不僅會(huì)導(dǎo)致心臟畸形, 同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致

斑馬魚心率降低。

2.2 prkd1 敲低對(duì)斑馬魚基因表達(dá)的調(diào)控

2.2.1 prkd1-MO 處理后的基因表達(dá)差異

為了探究 prkd1 影響早期心臟發(fā)育的下游靶

基因, 對(duì) 72 hpf 的 control-MO 組與 prkd1-MO 組

圖 2 prkd1 敲低導(dǎo)致的斑馬魚胚胎畸形表型

(A) 對(duì)照組 48 hpf 時(shí)期的心臟表型; (B~D) prkd1-MO 處理組 48 hpf 時(shí)期的心臟畸形表型, 依次為輕度、中度、重度; (E) 對(duì)

照組 72 hpf 時(shí)期的心臟表型; (F~H) prkd1-MO 處理組 72 hpf 時(shí)期的心臟畸形表型, 依次為輕度、中度、重度。心臟區(qū)域用

紅色虛線圈出; V: 心室, A: 心房; 標(biāo)尺=50 滋m。

Fig.2 Abnormal phenotype of zebrafish embryos caused by prkd1 knockdown

(A) Heart phenotype in control group at 48 hpf; (B~D) Mild, moderate and severe heart malformation phenotypes in prkd1-MO

group at 48 hpf; (E) Heart phenotype in control group at 72 hpf; (F~H) Mild, moderate and severe heart malformation phenotypes

in prkd1-MO group at 72 hpf. The area of the heart is circled with a red dotted line. V: Ventricle; A: Atrium. Scale bar = 50 滋m.

Control-MO Control-MO

prkd1-MO 0.3

0.2

0.1

0

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0

PE CTL LD

**

*

**

*

ns

***

***

***

(A) (B)

prkd1-MO

Control-MO prkd1-MO

李韻璇等：斑馬魚 prkd1 基因在心臟早期發(fā)育過程中的作用研究 99

生 命 科 學(xué) 研 究 圓園23 年

胚胎進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序, 分析了 prkd1 敲低后的

基因表達(dá)差異。樣品相關(guān)性檢測(cè)結(jié)果表明, 6 個(gè)樣

品間顯示出高度重復(fù)性(圖 4A)。基因差異表達(dá)結(jié)

果顯示, 本次共檢測(cè)到了 6 246 個(gè)發(fā)生顯著性變

化的基因, 其中, 3 913 個(gè)基因顯著下調(diào), 2 333 個(gè)

基因顯著上調(diào)(圖 4B)。

2.2.2 差異基因富集分析

為進(jìn)一步研究 prkd1 的生物學(xué)功能, 將發(fā)生

顯著性變化的 6 246 個(gè)基因進(jìn)行 GO 富集分析

(top 20), 結(jié)果顯示門控通道活性富集最為顯著(圖

5A)。此外, 被顯著富集的 GO 類別還包括離子通

道活性、離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性和電壓門控離子

通道活性等。

KEGG (top 30)富集分析顯示, 與 control-MO

組相比, prkd1 的敲低對(duì)真核生物的核糖體生物

圖 3 prkd1 敲低的斑馬魚胚胎心率分析統(tǒng)計(jì)圖

Fig.3 Statistical chart of heart rate of zebrafish em -

bryos caused by prkd1 knockdown

n=3, *

: P<0.05.

圖 4 prkd1-MO 處理組與對(duì)照組的差異表達(dá)基因

(A) 樣品相關(guān)性檢驗(yàn); (B) 差異基因聚類分析圖。藍(lán)色代表下調(diào), 紅色代表上調(diào)。

Fig.4 Differentially expressed genes between prkd1-MO group and control group

(A) Sample correlation test; (B) Cluster analysis of differential genes. Blue represents down-regulation and red represents upregulation.

prkd1 1

prkd1 2

prkd1 3

prkd1-MO

Control 1

Control 2

Control 3

Control-MO

Group

1.00

0.96

0.94

1.000 0 0.995 0 0.994 7 0.944 0 0.954 1 0.950 0

0.995 0 1.000 0 0.997 8 0.938 7 0.944 3 0.940 6

0.994 7 0.997 8 1.000 0 0.937 0 0.946 2 0.941 1

0.944 0 0.938 7 0.937 0 1.000 0 0.979 7 0.973 9

0.954 1 0.944 3 0.946 2 0.979 7 1.000 0 0.998 1

0.950 0 0.940 6 0.941 1 0.973 9 0.998 1 1.000 0

prkd1-MO

Control-MO

Group

1.5

1.0

0.5

0

-0.5

-1.0

-1.5

(A)

(B)

prkd1-MO

Control-MO

3

2

1

0

48 hpf 72 hpf

* *

100

第 2 期

發(fā)生以及 RNA 運(yùn)輸通路的影響最為顯著, 此外

其還影響了心肌細(xì)胞的腎上腺素能信號(hào)通路、心

肌收縮、血管平滑肌收縮、P53 信號(hào)通路和鈣離子

信號(hào)通路等(圖 5B)。

上述研究結(jié)果表明, prkd1 可能通過影響心

臟細(xì)胞相關(guān)的信號(hào)通路來影響心臟發(fā)育。

2.2.3 KEGG 富集結(jié)果中相關(guān)信號(hào)通路的驗(yàn)證

根據(jù) KEGG 富集分析結(jié)果, 選取心臟相關(guān)信

號(hào)通路如心肌收縮、心肌細(xì)胞的腎上腺素能信號(hào)

通路中有顯著變化的基因進(jìn)行驗(yàn)證。收取 72 hpf

胚胎進(jìn)行 qRT-PCR 檢測(cè), 結(jié)果顯示: 與 controlMO 組相比, prkd1-MO 組與心肌收縮有關(guān)的基因

如 ryr2、actc1a 和 cacna1fb 等均發(fā)生顯著變化, 其

中, ryr2 和 cacna1fb 顯著下調(diào), actc1a 顯著上調(diào),

這些基因同時(shí)也在心肌細(xì)胞的腎上腺素能信號(hào)通

路上; 此外, atp1b2a、cacng8b、cacna1da、cacna2d3、

tpm1、adrb1、atf2、akt3a、myl2b、adcy1a、adcy2a、bcl2b

和 calml4a 等心肌細(xì)胞的腎上腺素能信號(hào)通路相

關(guān)基因在 prkd1-MO 組也顯著下調(diào)(圖 6A)。這些

數(shù)據(jù)均與高通量測(cè)序結(jié)果相符。

圖 5 prkd1-MO 處理組與對(duì)照組的差異表達(dá)基因富集分析

Fig.5 Enrichment analysis of differentially expressed genes between prkd1-MO group and control group

-log10(P-value)

KEGG enrichment

Genetic information processing

Organismal systems

Environmental information processing

Metabolism

Cellular processes

Ribosome biogenesis in eukaryotes

RNA transport

RNA polymerase

Spliceosome

Proteasome

Aminoacyl-tRNA biosynthesis

Sulfur relay system

Base excision repair

Neuroactive ligand-receptor interaction

Calcium signaling pathway

Notch signaling pathway

Cell adhesion molecules (CAMs)

Phototransduction

Adrenergic signaling in cardiomyocytes

Cytosolic DNA-sensing pathway

Cardiac muscle contraction

Purine metabolism

Tyrosine metabolism

Arachidonic acid metabolism

Retinol metabolism

Primary bile acid biosynthesis

Fructose and mannose metabolism

Porphyrin and chlorophyll metabolism

Alanine, aspartate and glutamate metabolism

D-glutamine and D-glutamate metabolism

Linoleic acid metabolism

Pyrimidine metabolism

Alpha-Linolenic acid metabolism

P53 signaling pathway

Gap junction

0 1 234 5 678 9 10 1112 1314

(B)

Molecular function

GO enrichment

Biological process

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

(A)

Transmembrane transport

Metal ion transport

ncRNA processing

Ion transmembrane transport

Ion transport

Cation transmembrane transporter activity

Voltage-gated cation channel activity

Voltage-gated channel activity

Inorganic cation transmembrane transporter activity

Voltage-gated ion channel activity

Metal ion transmembrane transporter activity

Cation channel activity

Transporter activity

Transmembrane transporter activity

Inorganic molecular entity transmembrane transporter activity

Ion transmembrane transporter activity

Passive transmembrane transporter activity

Channel activity

Ion channel activity

Gated channel activity

-log10(P-value)

李韻璇等：斑馬魚 prkd1 基因在心臟早期發(fā)育過程中的作用研究 101

生 命 科 學(xué) 研 究 圓園23 年

圖 6 基于 KEGG 信號(hào)通路的基因相對(duì)表達(dá)量驗(yàn)證(72 hpf)

(A) 心肌細(xì)胞的腎上腺素能信號(hào)通路相關(guān)基因的 mRNA 相對(duì)表達(dá)量; (B) 細(xì)胞凋亡信號(hào)通路相關(guān)基因的 mRNA 相對(duì)表達(dá)

量; (C) 血管平滑肌收縮信號(hào)通路相關(guān)基因的 mRNA 相對(duì)表達(dá)量。n=3, *

: P<0.05, **: P<0.01, ***: P<0.001。

Fig.6 Verification of relative expression of genes based on KEGG signal pathways (72 hpf)

(A) Relative mRNA expression of adrenergic signaling pathway related genes in cardiomyocytes; (B) Relative mRNA expression of

apoptosis signaling pathway related genes; (C) Relative mRNA expression of vascular smooth muscle contraction signaling pathway related genes. n=3, *

: P<0.05, **: P<0.01, ***: P<0.001.

我們還對(duì)血管平滑肌收縮以及細(xì)胞凋亡信號(hào)

通路的關(guān)鍵基因進(jìn)行了檢測(cè), 結(jié)果顯示: 在prkd1-

MO 組中, 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因 casp8 顯著上調(diào),

ctsbb 顯著下調(diào)(圖 6B); 血管平滑肌收縮相關(guān)基因

prkcg、si:ch73-55i23.1 和 cox8b 均顯著下調(diào)(圖6C),

且它們均與高通量測(cè)序結(jié)果相符。

以上結(jié)果表明, prkd1 可能通過影響心肌收

縮和心肌細(xì)胞的腎上腺素能信號(hào)通路來影響心臟

發(fā)育, prkd1 敲低后其還可能通過抑制血管平滑

肌收縮相關(guān)的基因來抑制心臟血液的供給, 同時(shí)

細(xì)胞凋亡通路上相關(guān)基因的表達(dá)也受到影響。

2.2.4 早期心臟發(fā)育關(guān)鍵基因 mRNA 的相對(duì)表

達(dá)量變化

由上述結(jié)果可知, prkd1 會(huì)通過影響心臟相

關(guān)信號(hào)通路來影響心臟發(fā)育。為了進(jìn)一步探究

prkd1 是否在斑馬魚心臟發(fā)育的早期發(fā)揮作用,

收取 24 hpf 的 control-MO 組和 prkd1-MO 組斑

馬魚胚胎, 對(duì)其進(jìn)行早期心臟發(fā)育關(guān)鍵因子的相

對(duì)表達(dá)量檢測(cè)。qRT-PCR 數(shù)據(jù)顯示, 與 controlMO 組相比, 敲低 prkd1 后斑馬魚早期心臟發(fā)育

關(guān)鍵因子如 tbx5a、gata4、nkx2.5 和 hand2 均發(fā)生

顯著下調(diào)(圖 7), 這表明 prkd1 的敲低會(huì)影響早期

心臟發(fā)育關(guān)鍵基因的表達(dá)。

圖 7 早期心臟發(fā)育關(guān)鍵基因 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量變化

(24 hpf)

Fig.7 Relative mRNA expression changes of key genes

in early cardiac development (24 hpf)

n=3, ***: P<0.001.

prkd1-MO

Control-MO

tbx5a gata4 nkx2.5 hand2

1.5

1.0

0.5

0

*** *** *** ***

Control-MO

prkd1-MO

Control-MO

prkd1-MO

Control-MO

prkd1-MO

2.0

1.5

1.0

0.5

0

casp8 ctsbb prkcg si:ch73-55i23.1 cox8b

1.5

2.0

1.0

0.5

0

1.5

1.0

0.5

0

*** *** ***

***

***

*** ** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** ***

*

(A)

(B) (C)

102

第 2 期

3 討論

PRKD1 最初是蛋白激酶 C (protein kinase C,

PKC)家族的非典型成員, 后因其特殊的結(jié)構(gòu)特征

如不同的跨膜和 PH 結(jié)構(gòu)域以及氨基末端信號(hào)肽,

而被分至一個(gè)新的家族——PKD 家族[11, 14]。已有

研究表明, PRKD1 通過磷酸化心肌細(xì)胞中HDAC5

刺激其核輸出, 同時(shí)減少對(duì)肌細(xì)胞增強(qiáng)因子

MEF2 類轉(zhuǎn)錄因子及其靶基因的負(fù)調(diào)節(jié)作用, 增

加心臟肥大相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄活性, 從而降低心臟

特異性 Prkd1 缺失的小鼠抵抗外源性心臟肥大的

能力[9-12, 15-16]。2021 年, 研究人員在人類先天性心

臟病病例中檢測(cè)到了 PRKD1 的隱性突變, 患者

表現(xiàn)出肺動(dòng)脈狹窄、動(dòng)脈干和室間隔缺損的先天

性心臟病病征[2]。PRKD1 會(huì)與其他 PKD 家族成員

形成二聚體[17]

, 且有證據(jù)表明 PRKD1 定位于多蛋

白復(fù)合物[7]

, PRKD1 的缺失可能會(huì)破壞這些異構(gòu)體

從而導(dǎo)致病理性心臟重塑功能受阻。這一系列研

究表明, prkd1 與心臟疾病的發(fā)生具有密切關(guān)系,

prkd1 的缺失可能通過引起復(fù)雜的響應(yīng)機(jī)制來調(diào)

控心臟發(fā)育。

本文使用 MO 敲低斑馬魚 prkd1, 發(fā)現(xiàn)與對(duì)

照組相比, prkd1-MO 處理組的斑馬魚早期胚胎

死亡率升高(圖 1A), 且出現(xiàn)心包水腫、心管線性化、

環(huán)化異常等明顯心臟缺陷表型(圖 2)。對(duì) 72 hpf 時(shí)

期出現(xiàn)明顯心臟缺陷表型的斑馬魚比例進(jìn)行統(tǒng)

計(jì), 結(jié)果顯示, 與 control-MO 組相比, prkd1-MO

組出現(xiàn)心包水腫、心管線性化、環(huán)化異常的比例顯

著增加(圖 1B); 48 hpf、72 hpf 時(shí)期斑馬魚的心率

分析結(jié)果顯示, prkd1-MO 處理組的斑馬魚表現(xiàn)

出心率降低等異常(圖 3), 這些結(jié)果表明 prkd1 在

早期心臟發(fā)育中至關(guān)重要。為進(jìn)一步探究 prkd1

影響早期心臟發(fā)育的機(jī)制, 本研究選用 72 hpf 時(shí)

期的 control-MO 組和 prkd1-MO 組斑馬魚胚胎進(jìn)

行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序, 測(cè)序結(jié)果顯示, 共檢測(cè)到 6 246 個(gè)

發(fā)生顯著性變化的基因, 其中 3 913 個(gè)基因顯著

下調(diào), 2 333 個(gè)基因顯著上調(diào)。差異基因的 GO 和

KEGG 富集分析顯示, prkd1 基因的敲低會(huì)使心臟

相關(guān)的信號(hào)通路, 如心肌細(xì)胞的腎上腺素能信號(hào)

通路、心肌收縮、血管平滑肌收縮、細(xì)胞凋亡信號(hào)

通路、鈣離子信號(hào)通路等, 受到不同程度的影響

(圖 4~5)。通過 qRT-PCR 對(duì)差異基因進(jìn)行驗(yàn)證, 驗(yàn)

證結(jié)果顯示, prkd1 敲低后心肌細(xì)胞的腎上腺素

能信號(hào)通路、心肌收縮等信號(hào)通路的部分相關(guān)基

因均發(fā)生顯著變化(圖 6A), 這說明 prkd1 可能通過

影響心臟相關(guān)的信號(hào)通路來影響心臟發(fā)育; 同時(shí),

血管平滑肌收縮相關(guān)的差異基因顯著下調(diào)(圖 6C),

推測(cè) prkd1 敲低可能會(huì)通過抑制血管平滑肌收縮

相關(guān)的基因來抑制心臟血液的供給, 從而影響早

期心臟發(fā)育。此外, 本研究還對(duì)兩組斑馬魚胚胎

早期心臟發(fā)育關(guān)鍵因子的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了檢

測(cè), 發(fā)現(xiàn) prkd1 敲低后早期心臟發(fā)育關(guān)鍵因子

tbx5a、gata4、nkx2.5 和 hand2 均發(fā)生顯著下調(diào)(圖 7),

這表明 prkd1 的敲低會(huì)影響早期心臟發(fā)育關(guān)鍵基

因的表達(dá), 并且可能會(huì)通過調(diào)控這些關(guān)鍵因子的

表達(dá)來影響心臟發(fā)育。

綜上可知, 本文以斑馬魚為模型, 就 prkd1 基

因的敲低對(duì)早期心臟發(fā)育的影響進(jìn)行了初步探

究。然而, MO 敲低技術(shù)存在不可遺傳的局限性,

且 prkd1 影響早期心臟發(fā)育的分子機(jī)制仍有待進(jìn)

一步探究, 因此, 后續(xù)將在斑馬魚體內(nèi)敲除 prkd1

基因, 從而對(duì) prkd1 基因在早期心臟發(fā)育中的重

要作用展開深入探究。

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劉 香等：貴州苗族人群 MICA 和 MICB 基因多態(tài)性及單倍型分析

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