安 徽 科 技 學(xué) 院 學(xué) 報(bào)

第38卷 第2期 (總第177期) 2024年4月

目 次

動(dòng)物科學(xué)

平衡賴氨酸和蛋氨酸的低蛋白日糧對(duì)育雛期皖西白鵝血液生化和胸腺結(jié)構(gòu)的影響

…… 張 鑫, 張 康, 史文龍, 程 露, 胡倩倩, 李小金, 靳蒙蒙, 任 曼, 李升和(1)

褪黑素對(duì)牛卵巢顆粒細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的作用

………………………… 李 瑞, 鄭夢(mèng)浩, 王佳琪, 劉彥彥, 龐訓(xùn)勝, 劉文舉, 王淑娟(13)

安徽省部分地區(qū)山羊羔癱軟綜合征調(diào)查與分析……………… 汪來香, 郭大偉, 江喜春, 周金星(19)

血清4型禽腺病毒Fiber-1蛋白截短表達(dá)及多克隆抗體制備

……………… 羅昕雨, 趙 磊, 陳玉晴, 繆欣怡, 石家鑫, 顧有方, 李文超, 劉欣超(25)

G型產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定及其在雞壞死性腸炎發(fā)病模型中的應(yīng)用 …………… 孫 棟, 宋忠鋒,

倪君麗, 方肆云, 王定愛, 申翰欽, 嚴(yán)專強(qiáng), 戚南山, 孫銘飛, 顧有方(31)

植物科學(xué)

脲甲醛與尿素配比對(duì)盆栽玉米養(yǎng)分吸收及氮肥利用效率的影響

……………………………………………………………… 江鑫鑫, 吳中原, 方俊超, 李孝良(39)

銅陵白姜莖基腐的病原鑒定及其噬菌體的分離純化 …………………… 花 月, 汪菁森, 周 成(46)

不同類型除草劑對(duì)直播稻田碎米知風(fēng)草的活性及防效評(píng)價(jià)

……………………………………… 項(xiàng) 晶, 王 慧, 熊浩鈞, 李 誠, 程 睿, 畢亞玲(53)

食品藥品科學(xué)

食品級(jí)米糠粉開發(fā)工藝優(yōu)化及營(yíng)養(yǎng)消化特性

……………………………………… 顏 榕, 劉旭華, 孫強(qiáng)強(qiáng), 王俊穎, 楊麗萍, 翟立公(59)

滁菊米酒發(fā)酵工藝優(yōu)化 …………………………………………………… 林春寅, 李雅麗, 杜傳來(70)

工程技術(shù)

基于改進(jìn) YOLOv5算法的密集動(dòng)態(tài)目標(biāo)檢測(cè)方法

………………………………………………… 劉懿平, 何 歡, 彭 豐, 朱家旺, 江本赤(79)

基于改進(jìn) YOLOv5的草莓病害及養(yǎng)分狀況識(shí)別與檢測(cè)

………………………………………………… 劉蘇杭, 張 華, 朱婷倩, 吳 凡, 童 以(87)

鮮食玉米果穗的物理力學(xué)特性 …………………… 高朋飛, 張新偉, 易克傳, 苑鳳霞, 馬戰(zhàn)偉(95)

基于CFD的雙導(dǎo)輪液力變矩器流場(chǎng)模擬與試驗(yàn)研究 ………………… 李紹玲, 張春燕, 劉登水(103)

基于 Ansys的移動(dòng)式秸稈顆粒機(jī)車架穩(wěn)定性的有限元分析

…………………………………………………………… 彭 正, 姜春霞, 張立勇, 夏顯明(110)

(本期執(zhí)行編輯:顧文亮)

期刊基本參數(shù):CN34-1300/N*1984*b*A4*120*zh*p*$10*1000*15*2024-04

JOURNALOFANHUISCIENCE

ANDTECHNOLOGYUNIVERSITY

Vol.38No.2(Sum177)Apr.2024

CONTENTS

AnimalScience

EffectsoflowproteindietwithbalancedlysineandmethionineonbloodbiochemistryandthymusstructureofWanxiwhitegeeseatbroodingstage …… ZHANGXin, ZHANGKang, SHIWenlong,

CHENGLu, HUQianqian, LIXiaojin, JIN Mengmeng, REN Man, LIShenghe(1)

Roleofmelatoninonexpressionofgenesrelatedtoovariangranulosacelldevelopment

…………………………………… LIRui, ZHENG Menghao, WNAGJiaqi, LIUYanyan,

PANGXunsheng, LIU Wenju, WANGShujuan(13)

InvestigationandanalysisofFloppyKidSyndromeinsomeareasofAnhuiProvince

………………………… WANGLaixiang, GUODawei, JIANGXichun, ZHOUJinxing(19)

ShortenedexpressionandpolyclonalantibodypreparationofFiber-1proteinoffowladenovirusserotype4

…………………………………… LUOXinyu, ZHAOLei, CHENYuqing, MIAOXinyi,

SHIJiaxin, GUYoufang, LIWenchao, LIUXinchao(25)

IsolationandidentificationofClostridium perfringenstypeGanditsapplicationinthepathogenesis

modelofnecrotizingenteritisinchickens……………… SUNDong, SONGZhongfeng, NIJunli,

FANGSiyun, WANGDingai, SHEN Hanqin, YANZhuanqiang, QINanshan,

SUN Mingfei, GUYoufang(31)

PlantScience·GranariesinJianghuairegion

Effectsofureaformaldehydeandurearatioonnutrientuptakeandnitrogenuseefficiencyof

pottedmaize …………… JIANGXinxin, WUZhongyuan, FANGJunchao, LIXiaoliang(39)

IdentificationofpathogenandisolationandpurificationofphagefromstembaserotofTongling

whiteginger …………………………………… HUAYue, WANGJingsen, ZHOUCheng(46)

BioactivityandefficacyevaluationofdifferenttypesofherbicidesonEragrostisjaponica

indirect-seedingricefields …………………… XIANGJing, WANGHui, XIONGHaojun,

LICheng, CHENGRui, BIYaling(53)

ScienceofFoodandDrug

Optimizationofdevelopmentprocessandanalysisofnutritionaldigestioncharacteristicsofediblerice

branpowder …………………………………………… YANRong, LIUXuhua, SUNQiangqiang,

WANGJunying, YANGLiping, ZHAILigong(59)

OptimizationoffermentationtechnologyofChuzhouchrysanthemumricewine

…………………………………………………………… LINChunyin, LIYali, DUChuanlai(70)

EngineeringandTechnology

DensedynamictargetdetectionmethodbasedonimprovedYOLOv5algorithm

………………… LIUYiping, HEHuan, PENGFeng, ZHUJiawang, JIANGBenchi(79)

IndentificantionanddetectionofstrawberrydiseaseandnutrientbasedonimprovedYOLOv5

…………………… LIUSuhang, ZHANGHua, ZHUTingqian, WUFan, TONGYi(87)

Physicalandmechanicalpropertiesoffreshcornfruitears

………… GAOPengfei, ZHANGXinwei, YIKechuan, YUANFengxia, MAZhanwei(95)

FieldsimulationandexperimentstudyfordoublestatorshydraulictorqueconverterbasedonCFD

……………………………………………… LIShaoling, ZHANGChunyan, LIUDengshui(103)

FiniteelementanalysisofstabilityofmobilestrawpelletlocomotiveframebasedonAnsys

……………………… PENGZheng, JIANGChunxia, ZHANGLiyong, XIAXianming(110)

安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào),2024,38(2):1-12

JournalofAnhuiScienceandTechnologyUniversity

收稿日期:2023-12-23

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(31672502,31502137,31501968);安徽省科技重大專項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目(201903a06020002);安徽省高校學(xué)科

(專業(yè))拔尖人才學(xué)術(shù)資助項(xiàng)目(gxbjZD2020080);安徽省高校優(yōu)秀科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(2022AH010088);安徽省高校自然科學(xué)研

究項(xiàng)目(2022AH030146);安徽省地方鵝種基因庫;安徽省滁州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2022ZN002)。

作者簡(jiǎn)介:張?chǎng)?1999-),男,山西晉中人,碩士研究生,主要從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與健康研究,E-mail:3373300763@qq.com。

通信作者:李升和,教授,E-mail:lish@ahstu.edu.cn。

平衡賴氨酸和蛋氨酸的低蛋白日糧對(duì)育雛期

皖西白鵝血液生化和胸腺結(jié)構(gòu)的影響

張 鑫1, 張 康1, 史文龍1, 程 露1, 胡倩倩1,2,

李小金1,2, 靳蒙蒙1,2, 任 曼1,2, 李升和1,2*

(1.安徽科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,安徽 鳳陽 233100;

2.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)調(diào)控與健康安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 鳳陽 233100)

摘 要:目的:探究平衡賴氨酸和蛋氨酸的低蛋白日糧對(duì)育雛期皖西白鵝血液免疫指標(biāo)和胸腺結(jié)構(gòu)的影

響。方法:選用180只1日齡皖西白鵝作為研究對(duì)象,隨機(jī)分為6組,每組30只;試驗(yàn)采用3×2因子設(shè)計(jì)

(不同蛋白水平:20%、18%、16%,分別平衡賴氨酸、蛋氨酸),于14和28日齡分別采集血液和胸腺,研究

不同氨基酸平衡模式及蛋白水平對(duì)育雛期皖西白鵝血液免疫指標(biāo)以及胸腺結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果:14日齡

時(shí),D組 MCV、MCH 顯著高于 E、F 組(P<0.05);F 組血清 TP、ALB、AST 含量顯著高于 D、E 組

(P<0.05),D組 UA極顯著高于F組(P<0.01);A組 TG含量顯著高于B、C組(P<0.05);28日齡時(shí)

低蛋白組 ALP顯著高于高蛋白組。14與28日齡各組胸腺器官指數(shù)無顯著差異(P>0.05);結(jié)構(gòu)變化不

明顯(P>0.05)。結(jié)論:低蛋白日糧平衡氨基酸可以提高育雛期皖西白鵝的蛋白質(zhì)利用率,降低尿酸沉

積,且對(duì)胸腺發(fā)育沒有負(fù)面影響。

關(guān)鍵詞:蛋氨酸;賴氨酸;低蛋白日糧;血液指標(biāo);胸腺;皖西白鵝

中圖分類號(hào):S835 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1673-8772(2024)02-0001-12

開放科學(xué)(資源服務(wù))標(biāo)識(shí)碼(OSID): DOI:10.19608/j.cnki.1673-8772.2024.0201

Effectsoflowproteindietwithbalancedlysineandmethionineonblood

biochemistryandthymusstructureofWanxiwhitegeeseatbroodingstage

ZHANGXin1, ZHANGKang

1, SHIWenlong

1, CHENGLu1, HUQianqian1,2,

LIXiaojin1,2, JIN Mengmeng

1,2, REN Man1,2, LIShenghe1,2*

(1.CollegeofAnimalScience,AnhuiScienceandTechnologyUniversity,Fengyang233100,China;

2.AnhuiProvinceKeyLaboratoryofAnimalNutritionRegulationandHealth,Fengyang233100,China)

Abstract:Objective:Toexploretheeffectsoflowproteindietwithbalancedlysineandmethionineon

bloodbiochemistryandthymusstructureofWanxiwhitegeeseatbroodingstage.Methods:180one-day-

old Wanxiwhitegeese wererandomlydividedinto6groups with30geeseineach group.The

experimentuseda3×2factorialdesign(differentproteinlevels:20%,18%,16%,balancinglysineand

methionine,respectively).Bloodandthymuswerecollectedat14daysofageand28daysofage

respectivelytostudytheeffectsofdifferentaminoacidbalancepatternsandproteinlevelsonblood

indexesandthymusstructureofWanxiwhitegeeseatbroodingstage.Results:MCVand MCHin

14-day-oldGroupDweresignificantlyhigherthanthoseinGroupsEandF(P<0.05).Thecontentsof

serumTP,ALBandASTinGroupFweresignificantlyhigherthanthoseinGroupsDandE(P<0.05),and

theUAinGroupDwassignificantlyhigherthanthatinGroupF(P<0.01).TheTGcontentofGroup

AwassignificantlyhigherthanthatofGroupsBandC(P<0.05).ALPinthelowproteingroupwas

significantlyhigherthanthatinthehighproteingroupat28daysofage.Therewasnosignificant

differenceinthymusindexbetween14and28daysofage(P>0.05).Thestructuralchangeswerenot

significant(P>0.05).Conclusion:Alowproteindietwithbalancedaminoacidcanimproveprotein

availabilityanddecreaseuricaciddepositionofWanxiwhitegeeseinbroodingstage,andhasnonegative

effectonthymusdevelopment.

Keywords:Methionine;Lysine;Lowproteindiet;Bloodindex;Thymus;Wanxiwhitegeese

近年來,中國(guó)肉鵝養(yǎng)殖業(yè)呈穩(wěn)健發(fā)展的趨勢(shì),2021年肉鵝產(chǎn)值為522.6億元,比2020年上漲6.8%;

2022年中國(guó)商品鵝出欄量為4.68億只,肉鵝產(chǎn)值為526.73億元,比2021年上漲0.79%

[1-2],肉鵝產(chǎn)業(yè)的

發(fā)展空間巨大。中國(guó)鵝種資源豐富,皖西白鵝是其中肉絨兼用型的優(yōu)質(zhì)鵝種之一,具有耐粗飼、抗病力強(qiáng)、

耐寒耐熱、適應(yīng)力強(qiáng)等特點(diǎn),養(yǎng)殖量逐年增加。但迄今為止尚無統(tǒng)一的關(guān)于鵝營(yíng)養(yǎng)需要量和飼料配制的標(biāo)

準(zhǔn),這成了影響?zhàn)B殖業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵問題之一。

蛋白質(zhì)作為動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)需要的關(guān)鍵元素,是影響動(dòng)物生長(zhǎng)、繁殖、抗病的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。目前豆粕是養(yǎng)

殖業(yè)和飼糧行業(yè)最常用的蛋白原料,每年需要大量從國(guó)外進(jìn)口。動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)的需求實(shí)際上是對(duì)氨基酸

的需求[3-4]。2023年,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布了《飼用豆粕減量替代三年行動(dòng)方案》,提到應(yīng)用低蛋白日糧技術(shù),

配合使用合成氨基酸,減少飼料中的豆粕占比,提高飼料轉(zhuǎn)化率,做到節(jié)糧降耗。目前低蛋白日糧對(duì)鵝生

長(zhǎng)性能影響的研究較少,因此,研究不同蛋白水平以及配合氨基酸使用的日糧對(duì)鵝生產(chǎn)性能的影響具有重

要意義。本研究旨在研究不同蛋白質(zhì)水平下,平衡氨基酸的日糧對(duì)皖西白鵝血液指標(biāo)以及胸腺結(jié)構(gòu)的影

響,找出合適的日糧蛋白水平,為皖西白鵝的科學(xué)飼養(yǎng)提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼糧

選取180只體重相近的1日齡健康皖西白鵝,隨機(jī)分為6組,每組設(shè)置5個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)6只鵝。

采用雙因子試驗(yàn)設(shè)計(jì),A、B、C組為平衡賴氨酸組,日糧蛋白水平分別為20%、18%、16%;D、E、F組為平

衡蛋氨酸組,日糧蛋白水平分別為20%、18%、16%,飼糧營(yíng)養(yǎng)水平參考王寶維[5]的鵝營(yíng)養(yǎng)需要量,具體試

驗(yàn)方案見表1,基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表2。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

Table1 Experimentaldesign

分組

營(yíng)養(yǎng)水平處理/%

蛋白質(zhì)水平 氨基酸含量

備注

20%CP+Lys(A組) 20 Lys1.00,Met0.30

18%CP+Lys(B組) 18 Lys1.00,Met0.25

16%CP+Lys(C組) 16 Lys1.00,Met0.28

A、B、C組為平衡飼糧中賴氨酸水平

20%CP+Met(D組) 20 Lys1.00,Met0.50

18%CP+Met(E組) 18 Lys0.87,Met0.50

16%CP+Met(F組) 16 Lys0.73,Met0.50

D、E、F組為平衡飼糧中蛋氨酸水平

2 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

表2 試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

Table2 Experimentaldietcompositionandnutrientlevel(air-driedbasis)

項(xiàng)目 A B C D E F

原料/%

玉米 52.11 56.89 61.67 52.31 56.81 61.77

豆粕 30.00 24.00 18.00 29.60 24.00 18.00

麥麩 15.00 16.00 17.00 15.00 16.00 17.00

石粉 0.75 0.80 0.80 0.75 0.80 0.80

磷酸氫鈣 1.36 1.38 1.40 1.36 1.38 1.40

食鹽 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50

礦物元素預(yù)混料1 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05

維生素預(yù)混料2 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03

L-賴氨酸鹽酸鹽(98.5%) 0.00 0.15 0.35 - - -

DL-蛋氨酸(99%) - - - 0.20 0.23 0.25

氯化膽堿 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20

合計(jì) 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00

營(yíng)養(yǎng)水平3

粗蛋白/% 19.94 17.99 16.02 19.93 18.01 15.95

粗脂肪/% 3.05 3.14 3.21 3.05 3.14 3.25

代謝能/(MJ/kg) 11.79 11.79 11.69 11.77 11.78 11.81

能氮比 0.59 0.66 0.73 0.59 0.65 0.74

粗纖維/% 3.62 3.41 3.19 3.60 3.41 3.21

鈣/% 0.80 0.80 0.79 0.79 0.80 0.79

磷/% 0.76 0.77 0.75 0.77 0.77 0.76

賴氨酸/% 1.00 0.99 1.00 1.00 0.87 0.73

蛋氨酸/% 0.30 0.28 0.25 0.50 0.50 0.50

蘇氨酸/% 0.74 0.65 0.57 0.73 0.65 0.57

色氨酸/% 0.21 0.20 0.19 0.21 0.20 0.19

(蛋氨酸+胱氨酸)/% 0.56 0.57 0.58 0.75 0.86 0.90

注:1.礦物元素預(yù)混料為每千克飼糧提供:90mg鋅,80mg錳,80mg鐵,20mg銅,0.35mg碘;2.維生素預(yù)混料為每千克飼糧提供:

9000IU維生素A,3000IU維生素D3,24IU維生素E,3mg維生素B6,1.8mg維生素K3,5mg維生素B2,0.1mg維生素B12,40mg煙

酸,0.05mg生物素,15mgD-泛酸;3.代謝能和能氮比為計(jì)算值,其余為實(shí)測(cè)值。

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)期皖西白鵝采用網(wǎng)上平養(yǎng)、自由采食及飲水的方式,保持舍內(nèi)通風(fēng)以及圈舍的干凈衛(wèi)生。飼養(yǎng)管

理按照鵝場(chǎng)的常規(guī)制度進(jìn)行,按常規(guī)免疫程序進(jìn)行疫苗免疫,分別在14和28日齡每組每個(gè)重復(fù)選擇1只

鵝,稱體質(zhì)量后進(jìn)行靜脈采血,屠宰取樣。

1.3 生長(zhǎng)性能的測(cè)定

試驗(yàn)第14和28天空腹稱量體質(zhì)量,計(jì)算平均周體質(zhì)量。

1.4 血液指標(biāo)的測(cè)定

試驗(yàn)第14和28天,禁食12h后,翅下靜脈采血2管(一管為肝素鈉抗凝管,另一管為非抗凝管,每管

4mL)?？鼓苤械难簶悠肥褂肂C-200Vet獸用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀(北京曼程科技有限公司)測(cè)量

紅細(xì)胞數(shù)量(RBC)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白(MCH)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度

(MCHC)、紅細(xì)胞分布寬度(RDW)、白細(xì)胞數(shù)量(WBC)、血紅蛋白含量(HGB)、血小板數(shù)量(PLT)、紅細(xì)

胞比容(HCT)、平均血小板體積(MPV)、血小板分布寬度(PDW)、血小板比容(PCT)指標(biāo)。非抗凝管血

液樣品靜置30min后,使用低速冷凍離心機(jī)于3000r/min離心10~15min,提取上清,使用血清生化指

標(biāo)檢測(cè)試劑盒(上海科華生物工程股份有限公司)和卓越360全自動(dòng)血清生化分析儀(上?？迫A檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)

產(chǎn)品有限公司)測(cè)量血清甘油三脂(TG)、總膽固醇(TC)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白

(ALB)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、球蛋白(GLB)、白蛋白/球蛋白比(A/G)、Ca(鈣)、堿性磷酸酶(ALP)、尿素氮

(BUN)、尿酸(UA)、葡萄糖(GLU)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、總膽紅素(TB)、間接膽

紅素(IBIL)、CRE(肌酐)、CK(肌酸激酶)。

第38卷第2期 張 鑫,等:平衡賴氨酸和蛋氨酸的低蛋白日糧對(duì)育雛期皖西白鵝血液生化和胸腺結(jié)構(gòu)的影響 3

1.5 胸腺指數(shù)和胸腺組織結(jié)構(gòu)的觀察測(cè)定

試驗(yàn)第14和第28天,待屠宰鵝頸部放血致死,屠宰后取出胸腺,用濾紙吸除殘血,稱量剔除脂肪和結(jié)

締組織后的質(zhì)量,計(jì)算胸腺指數(shù)。

分別將14及28日齡的皖西白鵝胸腺組織置于4%多聚甲醛固定液中固定24h,之后流水沖洗24h,

經(jīng)梯度乙醇脫水和二甲苯透明后,用石蠟包埋組織,使用 RM2235石蠟輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(德國(guó)徠卡儀器有限公

司)以4μm的厚度切片。使用BX63正置熒光顯微鏡(日本 Olympus公司)觀察切片,每張切片選擇5個(gè)

視野,使用Image-ProPlus6.0軟件(美國(guó)Cybernetics公司)測(cè)量皮質(zhì)和髓質(zhì)面積,計(jì)算皮髓比。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS25.0分析軟件進(jìn)行雙因素方差分析,并采用Duncan’s進(jìn)行多重比較,試驗(yàn)數(shù)據(jù)

以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,以P<0.05作為差異顯著性判斷的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 日糧不同蛋白水平對(duì)育雛期皖西白鵝生長(zhǎng)性能的影響

表3為生長(zhǎng)性能結(jié)果,賴氨酸和蛋氨酸對(duì)0~2周齡皖西白鵝的平均周增質(zhì)量無顯著影響,而3~4周的

平衡賴氨酸組皖西白鵝平均周增質(zhì)量顯著高于平衡蛋氨酸組(P<0.05)。日糧蛋白水平對(duì)0~2周齡皖

西白鵝的平均周增質(zhì)量影響顯著,20%CP組平均周增質(zhì)量極顯著高于18%CP和16%CP組(P<0.01)。

氨基酸與蛋白質(zhì)水平對(duì)皖西白鵝仔鵝平均周增質(zhì)量未顯示交互作用(P<0.05)。

表3 不同氨基酸平衡模式及蛋白水平對(duì)育雛期皖西白鵝生長(zhǎng)性能的影響

Table3 Effectsofdifferentaminoacidbalancepatternsandproteinlevelsonthegrowth

performanceofWanxiwhitegeeseduringthebroodingperiod

項(xiàng)目

平均周增質(zhì)量/(g/(W·只))

0~2W 3~4W

A組 141.28 379.00

B組 118.52 385.58

C組 117.82 370.66

D組 141.52 344.37

E組 111.20 294.82

F組 113.88 372.94

SEM 4.16 19.01

氨基酸

LYS 125.87 378.41a

MET 122.20 337.38b

SEM 2.40 10.98

蛋白質(zhì)

20%CP 141.40A 361.69

18%CP 114.86B 340.20

16%CP 115.85B 371.80

SEM 2.94 13.44

P

氨基酸 0.291 0.014

蛋白質(zhì) <0.01 0.256

氨基酸*蛋白質(zhì) 0.666 0.067

注:同列數(shù)據(jù)上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05);上標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01);相同字母或無字母表示差異

不顯著(P≥0.05)。下同。

2.2 日糧不同蛋白水平對(duì)育雛期皖西白鵝血液指標(biāo)的影響

由表4~5可知,賴氨酸和蛋氨酸對(duì)14日齡皖西白鵝血液生理指標(biāo)無顯著影響,對(duì)28日齡皖西白鵝

血液RBC、MCV、MCH、PCT水平有顯著影響。與平衡賴氨酸組相比,平衡蛋氨酸組 RBC極顯著增高

(P<0.01),PCT極顯著降低(P<0.01),MCV 和 MCH 顯著降低(P<0.05)。比較日糧不同蛋白水平

可見,14日齡20%CP皖西白鵝RDW 高于18%和16%組(P<0.05)。不同氨基酸組和蛋白水平在14日

4 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

齡皖西白鵝血液 MCV和 MCH 指標(biāo)上發(fā)生交互作用。

表4 不同氨基酸平衡模式及蛋白水平對(duì)14日齡皖西白鵝血液生理指標(biāo)的影響

Table4 Effectsofdifferentaminoacidbalancepatternsandproteinlevelsonbloodphysiologicalindexesof14-day-oldWanxiwhitegeese

項(xiàng)目

WBC/

(109/L)

RBC/

(1012/L)

HGB/

(g/L)

HCT/

%

MCV/

fL

MCH/

pg

MCHC/

(g/L)

RDW/

%

PLT/

(109/L)

MPV/

fL

PDW/

%

PCT/

%

A 222.95 1.95 119.50 30.30 155.45a 61.05a 393.00 12.90 14.00 6.80 19.70 0.01

B 212.92 1.85 112.20 28.06 152.76a 61.12a 399.80 12.20 13.00 6.03 19.17 0.01

C 212.46 1.91 107.60 27.76 145.48a 56.24ab 387.20 12.24 18.20 6.18 19.36 0.01

D 219.68 2.04 109.00 28.78 141.53b 53.45b 290.50 14.43 13.75 5.65 19.05 0.01

E 213.58 1.88 112.25 28.45 152.15a 60.23ab 396.00 9.68 10.25 6.60 20.50 0.01

F 214.30 1.84 117.00 28.38 154.20a 63.36a 411.20 10.16 10.40 5.00 18.80 0.01

SEM 13.27 0.18 11.08 2.67 7.99 5.52 73.42 2.40 6.15 0.61 0.73 0.00

氨基酸

LYS 216.11 1.90 113.10 28.71 151.23 59.47 393.33 12.45 15.07 6.34 19.41 0.01

MET 215.85 1.92 112.75 28.54 149.29 59.01 365.90 11.42 11.47 5.75 19.45 0.01

SEM 6.08 0.08 4.91 1.22 2.96 2.02 28.84 0.84 2.57 0.37 0.53 0.00

蛋白質(zhì)

20%CP 221.31 1.99 114.25 29.54 148.49 57.25 341.75 13.66a 13.88 6.23 19.38 0.01

18%CP 213.25 1.86 112.23 28.26 152.46 60.67 397.90 10.94b 11.63 6.32 19.83 0.01

16%CP 213.38 1.88 112.30 28.07 149.84 59.80 399.20 11.20b 14.30 5.59 19.08 0.01

SEM 4.56 0.06 3.68 0.92 2.22 1.52 21.63 0.63 1.93 0.30 0.43 0.00

P

氨基酸 0.966 0.823 0.944 0.890 0.521 0.823 0.353 0.235 0.178 0.151 0.940 0.820

蛋白質(zhì) 0.538 0.425 0.941 0.626 0.555 0.436 0.262 0.048 0.620 0.255 0.520 0.659

氨基酸*

蛋白質(zhì) 0.946 0.715 0.295 0.774 0.024 0.028 0.243 0.170 0.474 0.149 0.289 0.865

表5 不同氨基酸平衡模式及蛋白水平對(duì)28日齡皖西白鵝血液生理指標(biāo)的影響

Table5 Effectsofdifferentaminoacidbalancepatternsandproteinlevelsonbloodphysiologicalindexesof28-day-oldWanxiwhitegeese

項(xiàng)目

WBC/

(109/L)

RBC/

(1012/L)

HGB/

(g/L)

HCT/

%

MCV/

fL

MCH/

pg

MCHC/

(g/L)

RDW/

%

PLT/

(109/L)

MPV/

fL

PDW/

%

PCT/

%

A 223.22 1.77 120.20 28.30 161.42 68.78 425.80 12.50 17.20 5.83 18.88 0.01

B 231.53 1.87 121.67 28.97 155.47 65.13 417.67 12.60 26.33 5.90 19.57 0.02

C 242.35 1.86 120.50 29.33 158.23 64.90 1159.25 11.08 39.00 5.90 18.95 0.04

D 234.60 2.14 122.00 31.40 147.85 57.23 387.50 12.18 17.00 6.25 19.08 0.01

E 227.95 1.99 112.75 29.65 149.38 56.98 379.75 11.50 16.75 5.73 18.65 0.01

F 229.92 2.11 107.40 28.86 137.74 51.18 1051.40 11.94 8.00 5.55 18.95 0.01

SEM 13.83 0.22 14.28 2.78 13.61 9.87 882.12 2.36 23.79 0.46 0.69 0.02

氨基酸

LYS 232.37 1.83B 120.79 28.86 158.37a 66.27A 667.57 12.06 27.51 5.88 19.13 0.02a

MET 230.82 2.08A 114.05 29.97 144.99b 55.13B 606.22 11.87 13.92 5.84 18.89 0.01b

SEM 5.65 0.07 5.96 1.18 4.85 3.39 370.81 1.05 9.85 0.23 0.35 0.01

蛋白質(zhì)

20%CP 228.91 1.95 121.10 29.85 154.64 63.00 406.65 12.34 17.10 6.04 18.98 0.01

18%CP 229.74 1.93 117.21 29.31 152.42 61.05 398.71 12.05 21.54 5.81 19.11 0.01

16%CP 236.14 1.98 113.95 29.09 147.98 58.04 1105.33 11.51 23.50 5.73 18.95 0.02

SEM 4.67 0.06 4.92 0.98 4.00 2.80 306.36 0.87 8.14 0.17 0.26 0.01

P

氨基酸 0.788 0.003 0.272 0.361 0.012 0.004 0.870 0.861 0.184 0.886 0.509 0.048

蛋白質(zhì) 0.510 0.858 0.598 0.855 0.503 0.466 0.213 0.793 0.852 0.503 0.920 0.353

氨基酸*

蛋白質(zhì) 0.217 0.431 0.557 0.438 0.506 0.808 0.996 0.751 0.411 0.338 0.347 0.162

表6~7為血生化蛋白指標(biāo)結(jié)果。比較賴氨酸組和蛋氨酸組可見,14日齡時(shí)平衡蛋氨酸組 A/G顯著

高于平衡賴氨酸組(P<0.05),28日齡時(shí),與平衡賴氨酸組相比,平衡蛋氨酸組 TP、GLB顯著降低(P<

0.05),ALP極顯著增高(P<0.01)。比較日糧不同蛋白水平可見,14日齡20%CP皖西白鵝 TP顯著低

第38卷第2期 張 鑫,等:平衡賴氨酸和蛋氨酸的低蛋白日糧對(duì)育雛期皖西白鵝血液生化和胸腺結(jié)構(gòu)的影響 5

于18%和16%組,18%CP皖西白鵝GLB顯著高于20%組(P<0.05),28日齡16%CP皖西白鵝CRE顯

著高于18%組。不同氨基酸組和蛋白水平在14日齡皖西白鵝血液TP、ALB、UA指標(biāo)上發(fā)生交互作用。

表6 不同氨基酸平衡模式及蛋白水平對(duì)14日齡皖西白鵝血清生化指標(biāo)的影響

Table6 Effectsofdifferentaminoacidbalancemodesandproteinlevelsonserumproteinindexesof14-day-oldWanxiwhitegeese

項(xiàng)目 TP/

(g/L)

ALB/

(g/L)

GLB/

(g/L)

(A/G)/

%

UA/

(μmol/L)

BUN/

(μmol/L)

CRE/

(μmol/L)

ALT/

(U/L)

AST/

(U/L)

ALP/

(U/L)

A組 31.60AaBbc 9.20AaBbc 22.40 0.41 561.80AaBb 1.85 5.20 26.00 71.20 1258.60

B組 33.40AaBb 9.40AaBbc 24.00 0.39 352.20AaBb 1.90 5.40 28.60 86.00 983.60

C組 30.40ABbc 8.60AaBbc 21.80 0.39 608.60AaBb 2.08 6.80 28.20 75.60 875.20

D組 28.80Bc 8.40Ba 20.40 0.41 685.00A 1.58 9.20 31.80 88.80 884.20

E組 33.00AaBb 9.60b 23.40 0.41 538.60a 2.05 5.20 23.00 57.40 873.40

F組 35.00Aa 10.80Ac 24.20 0.45 208.00Bb 1.08 9.40 27.40 88.80 920.80

SEM 3.20 1.09 2.28 0.03 244.89 0.93 3.67 7.71 12.35 368.12

氨基酸

LYS 31.80 9.07 22.73 0.40a 507.53 1.94 5.80 27.60 77.60 1039.13

MET 32.27 9.60 22.67 0.42b 477.20 1.57 7.93 27.40 78.33 892.80

SEM 0.69 0.21 0.52 0.01 51.34 0.24 0.90 2.05 7.13 96.79

蛋白質(zhì)

20%CP 30.20b 8.80 21.40b 0.41 623.40 1.71 7.20 28.90 80.00 1071.40

18%CP 33.20a 9.50 23.70a 0.40 445.40 1.98 5.30 25.80 71.70 928.50

16%CP 32.70a 9.70 23.00ab 0.42 408.30 1.58 8.10 27.80 82.20 898.00

SEM 0.85 0.26 0.64 0.01 62.87 0.30 1.11 2.51 8.73 118.54

P

氨基酸 0.638 0.090 0.928 0.021 0.680 0.292 0.108 0.945 0.943 0.296

蛋白質(zhì) 0.043 0.056 0.049 0.300 0.052 0.641 0.209 0.679 0.673 0.552

氨基酸*蛋白質(zhì) 0.016 0.002 0.062 0.145 0.005 0.407 0.407 0.290 0.141 0.460

表7 不同氨基酸平衡模式及蛋白水平對(duì)28日齡皖西白鵝血清生化指標(biāo)的影響

Table7 Effectsofdifferentaminoacidbalancemodesandproteinlevelsonserumproteinindexesof28-day-oldWanxiwhitegeese

項(xiàng)目 TP/

(g/L)

ALB/

(g/L)

GLB/

(g/L)

(A/G)/

%

UA/

(μmol/L)

BUN/

(μmol/L)

CRE/

(μmol/L)

ALT/

(U/L)

AST/

(U/L)

ALP/

(U/L)

A組 34.00 9.80 24.20 0.41 191.40 0.89 12.00 18.40 53.80 1004.80

B組 35.40 10.20 25.20 0.40 171.80 0.91 11.00 25.00 62.40 848.00

C組 36.00 10.20 25.80 0.40 238.00 0.97 11.20 30.80 85.20 858.20

D組 33.40 10.00 23.40 0.43 212.60 0.76 11.20 29.40 76.00 1067.80

E組 30.20 8.80 21.40 0.41 225.60 0.87 7.80 21.80 58.00 1302.00

F組 32.60 9.80 22.80 0.43 255.00 1.05 12.80 28.20 80.20 1578.80

SEM 1.41 0.43 1.09 0.02 23.53 0.09 1.07 5.71 18.02 169.88

氨基酸

LYS 35.13a 10.07 25.07A 0.40 200.40 0.92 11.40 24.73 67.13 903.67B

MET 32.07b 9.53 22.53B 0.43 231.07 0.90 10.60 26.47 71.40 1316.20A

SEM 0.81 0.25 0.63 0.01 13.58 0.05 0.62 3.30 10.41 98.08

蛋白質(zhì)

20%CP 33.70 9.90 23.80 0.42 202.00 0.82 11.60ab 23.90 64.90 1036.30

18%CP 32.80 9.50 23.30 0.41 198.70 0.89 9.40b 23.40 60.20 1075.00

16%CP 34.30 10.00 24.30 0.41 246.50 1.01 12.00a 29.50 82.70 1218.50

SEM 1.00 0.30 0.77 0.01 16.64 0.06 0.76 4.04 12.74 120.12

P

氨基酸 0.014 0.140 0.009 0.075 0.123 0.696 0.369 0.713 0.774 0.007

蛋白質(zhì) 0.571 0.477 0.659 0.771 0.097 0.104 0.049 0.505 0.433 0.537

氨基酸*蛋白質(zhì) 0.278 0.190 0.375 0.702 0.697 0.446 0.102 0.387 0.694 0.172

表8~9為血生化能量代謝指標(biāo)結(jié)果。賴氨酸和蛋氨酸對(duì)14日齡皖西白鵝血清Ca有顯著影響,平衡

蛋氨酸組Ca極顯著高于平衡賴氨酸組(P<0.01),對(duì)28日齡皖西白鵝血清能量代謝指標(biāo)無顯著影響。

比較日糧不同蛋白水平可見,14日齡20%CP皖西白鵝 TP、IBIL顯著高于16%組(P<0.05),28日齡

6 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

18%CP皖西白鵝GLU顯著高于16%組。不同氨基酸組和蛋白水平在14日齡皖西白鵝血液 TG指標(biāo)上

發(fā)生交互作用。

表8 不同氨基酸平衡模式及蛋白水平對(duì)14日齡皖西白鵝血清能量代謝指標(biāo)的影響

Table8Effectsofdifferentaminoacidbalancepatternsandproteinlevelsonserumenergymetabolismindexesof14-day-oldWanxiwhitegeese

項(xiàng)目 GLU/

(mmol/L)

TG/

(mmol/L)

TC/

(mmol/L)

HDL/

(mmol/L)

LDL/

(mmol/L)

IBIL/

(μmol/L)

TB/

(μmol/L)

CK/

(U/L)

Ca/

(mmol/L)

A組 10.16 4.53ab 7.84 2.43 2.49 4.70 6.42 1772.60 2.23

B組 10.26 1.71b 7.38 2.27 2.03 5.00 6.14 2346.80 2.26

C組 7.28 3.46a 7.73 1.68 2.67 3.52 4.70 1850.00 2.25

D組 8.06 4.12ab 8.26 2.16 2.33 6.18 7.00 1561.40 2.34

E組 8.86 3.68ab 7.23 1.70 2.24 4.82 5.88 1798.00 2.42

F組 9.12 1.23b 3.90 1.21 1.43 2.94 4.22 2757.00 2.47

SEM 2.06 2.09 3.72 0.82 1.03 1.73 1.87 503.28 0.14

氨基酸

LYS 9.23 3.23 7.65 2.13 2.40 4.41 5.75 1973.13 2.25B

MET 8.68 3.01 6.46 1.69 2.00 4.65 5.70 2038.80 2.41A

SEM 0.50 0.70 0.97 0.20 0.27 0.39 0.45 292.71 0.03

蛋白質(zhì)

20%CP 9.11 4.33 8.05 2.30 2.41 5.44a 6.71a 1642.00 2.29

18%CP 9.56 2.70 7.31 1.99 2.14 4.91a 6.01ab 2072.40 2.34

16%CP 8.20 2.34 5.81 1.45 2.05 3.23b 4.46b 2303.50 2.36

SEM 0.61 0.58 1.19 0.24 0.33 0.47 0.55 358.50 0.04

P

氨基酸 0.440 0.758 0.396 0.132 0.307 0.665 0.934 0.875 0.001

蛋白質(zhì) 0.293 0.064 0.412 0.061 0.725 0.018 0.025 0.429 0.363

氨基酸*蛋白質(zhì) 0.070 0.048 0.403 0.909 0.287 0.284 0.777 0.347 0.616

表9 不同氨基酸平衡模式及蛋白水平對(duì)28日齡皖西白鵝血清能量代謝指標(biāo)的影響

Table9 Effectsofdifferentaminoacidbalancepatternsandproteinlevelsonserumenergymetabolismindexesof28-day-oldWanxiwhitegeese

項(xiàng)目 GLU/

(mmol/L)

TG/

(mmol/L)

TC/

(mmol/L)

HDL/

(mmol/L)

LDL/

(mmol/L)

IBIL/

(μmol/L)

TB/

(μmol/L)

CK/

(U/L)

Ca/

(mmol/L)

A組 8.46 0.95 4.95 1.68 1.81 2.90 3.86 2268.00 2.40

B組 8.40 0.88 4.63 1.92 1.31 3.30 4.42 3073.60 2.50

C組 7.30 0.84 5.63 2.07 1.78 3.16 4.90 3495.60 2.45

D組 7.78 1.03 5.16 2.08 1.34 4.60 6.10 3590.80 2.38

E組 8.52 0.96 4.53 1.47 1.44 1.64 3.74 957.00 2.42

F組 7.18 1.18 4.53 1.81 1.50 1.96 3.74 4254.20 2.39

SEM 0.48 0.18 0.46 0.29 0.18 0.78 0.77 936.98 0.05

氨基酸

LYS 8.05 0.89 5.07 1.89 1.63 3.12 4.39 2945.73 2.45

MET 7.83 1.06 4.74 1.79 1.43 2.73 4.53 2934.00 2.40

SEM 0.28 0.10 0.27 0.16 0.10 0.45 0.44 540.97 0.03

蛋白質(zhì)

20%CP 8.12ab 0.99 5.06 1.89 1.58 3.75 4.98 2929.40 2.39

18%CP 8.46a 0.92 4.58 1.70 1.37 2.47 4.08 2015.30 2.46

16%CP 7.24b 1.01 5.08 1.94 1.64 2.56 4.32 3874.90 2.42

SEM 0.34 0.12 0.33 0.20 0.13 0.55 0.54 662.55 0.03

P

氨基酸 0.567 0.258 0.387 0.647 0.165 0.551 0.833 0.988 0.170

蛋白質(zhì) 0.048 0.853 0.485 0.666 0.317 0.210 0.488 0.161 0.312

氨基酸*蛋白質(zhì) 0.696 0.693 0.354 0.311 0.243 0.087 0.076 0.166 0.862

2.3 日糧不同蛋白水平對(duì)皖西白鵝胸腺指數(shù)的影響

由表10可知,賴氨酸和蛋氨酸、不同蛋白質(zhì)水平對(duì) 14 和 28 日齡的胸腺指數(shù)均無顯著差異

(P>0.05),不同氨基酸組和蛋白水平在14和28日齡皖西白鵝胸腺指數(shù)上未發(fā)生交互作用。14日齡

B組(18%蛋白質(zhì)平衡LYS)胸腺指數(shù)最高,28日齡E組(18%蛋白質(zhì)平衡 MET組)胸腺指數(shù)最高,平衡

第38卷第2期 張 鑫,等:平衡賴氨酸和蛋氨酸的低蛋白日糧對(duì)育雛期皖西白鵝血液生化和胸腺結(jié)構(gòu)的影響 7

蛋氨酸組的胸腺指數(shù)顯著高于平衡蛋氨酸組(P<0.05)。

表10 不同氨基酸平衡模式及蛋白水平對(duì)皖西白鵝胸腺指數(shù)的影響

Table10 EffectsofdifferentaminoacidbalancepatternsandproteinlevelsonthymusindexofWanxiwhitegeese

項(xiàng)目

14日齡

胸腺質(zhì)量/g 胸腺指數(shù)/(g/kg)

28日齡

胸腺質(zhì)量/g 胸腺指數(shù)/(g/kg)

A組 1.73 8.01 3.55 3.68

B組 2.53 11.82 3.08 3.20

C組 1.72 8.47 3.42 3.61

D組 2.00 9.95 3.58 3.89

E組 1.70 8.43 3.91 4.99

F組 1.85 8.91 4.12 4.36

SEM 0.71 3.51 0.94 1.18

氨基酸

LYS 2.00 9.44 3.35 3.50a

MET 1.85 9.10 3.87 4.41b

SEM 0.18 0.93 0.25 0.29

蛋白質(zhì)

20%CP 1.86 8.98 3.57 3.79

18%CP 2.12 10.13 3.49 4.10

16%CP 1.78 8.69 3.77 3.99

SEM 0.22 1.13 0.30 0.36

P

氨基酸 0.573 0.798 0.151 0.036

蛋白質(zhì) 0.549 0.642 0.804 0.821

氨基酸*蛋白質(zhì) 0.183 0.250 0.613 0.295

2.4 日糧不同水平蛋白質(zhì)對(duì)育雛期皖西白鵝胸腺結(jié)構(gòu)的影響

圖1~2為14和28日齡皖西白鵝胸腺組織的 HE染色切片圖。胸腺小葉分為髓質(zhì)和皮質(zhì),HE染色

后皮質(zhì)顏色較深,髓質(zhì)位于胸腺小葉中央,顏色較淺。由表11可知,賴氨酸和蛋氨酸、不同蛋白質(zhì)水平對(duì)

14和28日齡的胸腺皮質(zhì)面積、髓質(zhì)面積及皮髓比均無顯著差異(P>0.05),不同氨基酸組和蛋白水平在

14和28日齡皖西白鵝胸腺皮質(zhì)面積、髓質(zhì)面積及皮髓比上未發(fā)生交互作用。

圖1 14日齡皖西白鵝胸腺組織結(jié)構(gòu)(HE染色,×100)

Fig.1 Thymustissuestructureof14-day-oldWanxiwhitegeese(HEstaining,×100)

注:A為20%CP+Lys;B為18%CP+Lys;C為16%CP+Lys;D為20%CP+Met;E為18%CP+Met;F為16%CP+Met。下同。

圖2 28日齡皖西白鵝胸腺組織結(jié)構(gòu)(HE染色,×100)

Fig.2 Thymustissuestructureof28-day-oldWanxiwhitegeese(HEstaining,×100)

8 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

表11 不同氨基酸平衡模式及蛋白水平對(duì)皖西白鵝胸腺結(jié)構(gòu)的影響

Table11 EffectsofdifferentaminoacidbalancemodesandproteinlevelsonthymusstructureofWanxiwhitegeese

項(xiàng)目

14日齡

皮質(zhì)相對(duì)面積/% 髓質(zhì)相對(duì)面積/% 皮髓比

28日齡

皮質(zhì)相對(duì)面積/% 髓質(zhì)相對(duì)面積/% 皮髓比

A組 75.37 24.63 3.34 61.20 38.80 1.95

B組 61.25 38.75 2.50 74.42 25.58 3.53

C組 47.82 52.18 1.61 71.40 28.60 3.33

D組 50.71 49.29 1.17 87.40 12.60 6.94

E組 50.42 49.58 1.99 74.64 25.36 2.94

F組 40.04 59.96 0.69 85.00 15.00 5.79

SEM 0.21 0.21 0.75 0.14 0.14 0.75

氨基酸

LYS 61.42 38.58 2.48 69.06 30.94 2.94

MET 47.17 52.83 1.28 82.37 17.63 5.23

SEM 0.05 0.05 0.44 0.04 0.04 0.43

蛋白質(zhì)

20%CP 63.01 36.99 2.25 74.33 25.67 4.45

18%CP 55.84 44.16 2.25 74.62 25.38 3.24

16%CP 43.92 56.08 1.15 78.23 21.77 4.56

SEM 0.06 0.06 0.53 0.08 0.08 0.70

P

氨基酸 0.066 0.066 0.069 0.128 0.128 0.057

蛋白質(zhì) 0.136 0.136 0.291 0.894 0.894 0.507

氨基酸*蛋白質(zhì) 0.621 0.621 0.235 0.503 0.503 0.087

3 結(jié)論與討論

3.1 日糧不同蛋白水平對(duì)皖西白鵝生長(zhǎng)性能的影響

飼糧中粗蛋白的適宜添加對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育、健康狀態(tài)十分重要,過低的粗蛋白水平會(huì)使動(dòng)物生長(zhǎng)性能

下降,過高的粗蛋白水平又會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體受損以及生產(chǎn)成本的增加。Alagawany等[6]發(fā)現(xiàn)不同 CP

(18%和16%)和 ME(3000、2900和2800kcal/kg)水平對(duì)生長(zhǎng)性狀無顯著影響。Ashour等[7]發(fā)現(xiàn)飼糧

中添加16%的蛋白質(zhì)或蛋氨酸+胱氨酸(M+C)可提高埃及鵝在飼養(yǎng)期(12~24周齡)的體質(zhì)量。本試

驗(yàn)中各組的平均周增重并無顯著差異,說明平衡賴氨酸和蛋氨酸的低蛋白日糧可以滿足育雛期皖西白鵝

的正常生長(zhǎng)需要。

3.2 日糧不同蛋白水平對(duì)皖西白鵝血液生理生化指標(biāo)的影響

日糧血液生理指標(biāo)能夠反映動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)水平、機(jī)體代謝以及健康情況。RBC是高等動(dòng)物體內(nèi)血液運(yùn)輸

氧氣的主要媒介,也是機(jī)體的固有免疫細(xì)胞[8-9]。紅細(xì)胞相關(guān)參數(shù) HGB、MCV 和 MCH 常作為動(dòng)物體內(nèi)

鐵營(yíng)養(yǎng)的評(píng)價(jià)指標(biāo)。前人研究發(fā)現(xiàn)飼糧中添加氨基酸絡(luò)合鐵可以增加生長(zhǎng)育肥豬的 MCV和 MCH

[10-11]。

本試驗(yàn)中各組RBC和 HGB無明顯差異,但14日齡D、E、F組(平衡蛋氨酸組)的 MCV 和 MCH 有顯著

差異。李曼曼等[12]研究發(fā)現(xiàn),20%和24%蛋白組的14日齡雁鵝盲腸微生物中雙歧桿菌數(shù)量少于16%蛋

白組,雙歧桿菌可以促進(jìn)鐵和維生素D的吸收。鐵吸收不良引起的紅細(xì)胞體積變小可能是D組 MCV和

MCH 顯著降低的原因。而賴氨酸可以促進(jìn)血紅蛋白合成,因此賴氨酸平衡組的 MCV和 MCH 并沒有顯

著差異。免疫細(xì)胞在動(dòng)物機(jī)體中擔(dān)任著重要的角色,本試驗(yàn)中各組 WBC、PLT、MPV、RDW 等指標(biāo)均無

第38卷第2期 張 鑫,等:平衡賴氨酸和蛋氨酸的低蛋白日糧對(duì)育雛期皖西白鵝血液生化和胸腺結(jié)構(gòu)的影響 9

顯著差異,說明日糧蛋白水平對(duì)皖西白鵝血液免疫細(xì)胞的影響不明顯。

血清生化指標(biāo)可以反映動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的代謝過程。蛋白代謝指標(biāo)可以評(píng)價(jià)機(jī)體對(duì)蛋白質(zhì)的利用情況,

TP和 ALB可以反映肝的健康程度。White等[13]研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的限制攝入會(huì)導(dǎo)致 ALB下降,本試驗(yàn)

平衡賴氨酸組中C組TP和 ALB低于 A、B組,與前人結(jié)果一致。而平衡蛋氨酸組中F組 TP、ALB顯著

高于D、E組,這可能是因?yàn)榈鞍彼嵩谔囟ǖ那闆r下可以轉(zhuǎn)化為合成蛋白質(zhì)所需的半胱氨酸[14],滿足了雛

鵝對(duì)蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)需要,同時(shí)低蛋白飼糧可以提高蛋白質(zhì)的利用率[15-16]。AST和 ALT可以參與蛋白質(zhì)

的代謝,反映動(dòng)物機(jī)體合成或代謝蛋白質(zhì)的情況,本試驗(yàn)中各組 AST和 ALT無顯著差異,馮蕾等[17]發(fā)現(xiàn)

低蛋白日糧添加賴氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和異亮氨酸可以維持 ALT和 AST的穩(wěn)定,與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

UA是禽類蛋白質(zhì)代謝的終產(chǎn)物,可以反映對(duì)飼糧中蛋白質(zhì)利用和氨基酸比例平衡情況[18]。14日齡時(shí)

D組UA含量顯著高于18%、16%蛋白組,陳彬等[19]發(fā)現(xiàn)不同能量蛋白水平組皖西白鵝UA無顯著差異,

徐茂森等[20]發(fā)現(xiàn)15%蛋白組皖西白鵝 UA顯著低于16%蛋白組。本試驗(yàn)結(jié)果表明高蛋白對(duì)14日齡皖

西白鵝的 UA含量影響顯著,這與前人研究結(jié)果一致[21-24]。

能量代謝指標(biāo)可以評(píng)價(jià)機(jī)體內(nèi)葡萄糖、脂肪代謝情況,TG通過機(jī)體肝臟合成,其含量高低反映禽類

脂肪組織發(fā)育及脂肪沉積程度[25]。TC是指血液中多種脂蛋白所含膽固醇的總和,TG、TC是反映血脂水

平的一個(gè)常用指標(biāo)。李琴等[26]對(duì)肉仔鵝的研究發(fā)現(xiàn) TG 水平會(huì)隨粗蛋白水平的升高而下降。宋瓊莉

等[27]研究發(fā)現(xiàn),日糧粗蛋白質(zhì)水平越低,肉雞血清中 TC含量越低,TG含量越高。本研究發(fā)現(xiàn),14日齡

高蛋白組皖西白鵝TG顯著高于低蛋白組(P<0.05),這可能是雛鵝對(duì)脂肪的沉積程度較高而導(dǎo)致的。

而隨著日齡的增加,脂肪組織的發(fā)育逐漸減慢,因此28日齡各組TG水平無顯著差異。

3.3 日糧不同蛋白水平對(duì)皖西白鵝胸腺指數(shù)的影響

胸腺是機(jī)體重要的免疫器官,可以產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞以及激素類物質(zhì)[28]。胸腺指數(shù)的高低可粗略估計(jì)

其免疫功能的強(qiáng)弱[29],胸腺相對(duì)質(zhì)量越小表明其免疫能力越弱[30]。本試驗(yàn)中,平衡賴氨酸和蛋氨酸的低

蛋白日糧對(duì)14和28日齡皖西白鵝胸腺指數(shù)的影響不顯著。劉書鋒等[31]研究發(fā)現(xiàn)馬岡鵝在采食補(bǔ)充氨

基酸的低蛋白飼糧后各組胸腺指數(shù)差異不顯著。石天虹等[32]研究發(fā)現(xiàn)19%、18%以及17%蛋白水平飼

糧對(duì)汶上蘆花公雞的免疫器官指數(shù)無顯著影響。張思軒等[33]研究發(fā)現(xiàn)不同類型低蛋白質(zhì)飼糧對(duì)肉雞免

疫器官指數(shù)無顯著影響。夏偉光等[34]發(fā)現(xiàn)飼喂低蛋白氨基酸平衡飼糧對(duì)150日齡清遠(yuǎn)麻雞免疫器官指

數(shù)無顯著影響。曾曉閣等[35]研究發(fā)現(xiàn)不同蛋白水平對(duì)22~42日齡肉仔雞免疫器官指數(shù)無顯著影響。

免疫器官的發(fā)育對(duì)禽類免疫功能十分重要[36]。家禽的胸腺是一個(gè)分葉狀的淋巴器官,位于頸的兩

側(cè),與頸靜脈平行[37]。它是皖西白鵝重要的中樞免疫器官,有增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能、調(diào)節(jié)免疫平衡、抗感染

等作用[38]。胸腺表面的被膜深入到實(shí)質(zhì)將其分為大量不完整的胸腺小葉[39]。胸腺小葉中,皮質(zhì)主要支

架由上皮網(wǎng)狀細(xì)胞構(gòu)成,其體積較大,細(xì)胞質(zhì)的染色較淡,其間由大量的淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞充滿,這也是

皮質(zhì)染色較深的主要原因[40]。髓質(zhì)相對(duì)于皮質(zhì)中的淋巴細(xì)胞較少,所以染色相對(duì)于皮質(zhì)較淺。皮質(zhì)與髓

質(zhì)的面積比可以反映胸腺細(xì)胞的功能狀態(tài)。金光明等[41]研究發(fā)現(xiàn),添加1.0g/kg的半胱胺能夠促進(jìn)雞

胸腺和法氏囊的發(fā)育,增強(qiáng)雞的免疫功能。冉瑞圖等[42]研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1能顯著提高衰老大鼠的胸

腺指數(shù)和皮髓比。本研究表明,不同蛋白水平日糧平衡賴氨酸、蛋氨酸并未導(dǎo)致皖西白鵝的胸腺產(chǎn)生實(shí)質(zhì)

性的變化,大體形態(tài)的外觀變化不是很明顯,并未發(fā)現(xiàn)出血點(diǎn)和器官腫大等現(xiàn)象,高倍鏡下可見淋巴細(xì)胞

組成及結(jié)構(gòu)也未發(fā)現(xiàn)顯著改變,表明低蛋白日糧平衡氨基酸可以維持胸腺的正常生長(zhǎng)發(fā)育。

綜上,14和28日齡的皖西白鵝需要注意蛋白質(zhì)的供應(yīng),飼料中適宜的蛋白質(zhì)對(duì)于鵝的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)

重要。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),日糧粗蛋白質(zhì)為16%平衡蛋氨酸時(shí),14和28日齡皖西白鵝的血液指標(biāo)較好,胸

腺形態(tài)無明顯變化。本研究可以為育雛期皖西白鵝的營(yíng)養(yǎng)需要提供一定的參考。

10 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

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(責(zé)任編輯:顧文亮)

12 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào),2024,38(2):13-18

JournalofAnhuiScienceandTechnologyUniversity

收稿日期:2023-09-13

基金項(xiàng)目:安徽省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2008085MC94);安徽省高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目(KJ2021A0869);安徽省重點(diǎn)研究與開發(fā)計(jì)

劃項(xiàng)目(202204c06020076)。

作者簡(jiǎn)介:李瑞(1997-),男,安徽合肥人,碩士研究生,主要從事動(dòng)物繁殖研究,E-mail:765404465@qq.com。

通信作者:王淑娟,副教授,E-mail:wangshujuan2012@hotmail.com。

褪黑素對(duì)牛卵巢顆粒細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的作用

李 瑞1, 鄭夢(mèng)浩1, 王佳琪1, 劉彥彥1, 龐訓(xùn)勝1, 劉文舉2, 王淑娟1*

(1.安徽科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,安徽 鳳陽 233100;

2.安徽科技學(xué)院 生命與健康科學(xué)學(xué)院,安徽 鳳陽 233100)

摘 要:目的:探究褪黑素對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響。方法:不同濃度的褪黑素(0、10-3、

10-5、10-7、10-9、10-11 mol/L)分別處理顆粒細(xì)胞24、48、72h后提取細(xì)胞總 RNA,采用 Real-timePCR

檢測(cè)抗氧化(GPX4、SOD1)、發(fā)育(EGFR、DNMT1a、FSHR)和 TGFβ家族(BMP6)相關(guān)基因的表達(dá)。

結(jié)果:不同濃度褪黑素處理24、48、72h對(duì)抗氧化(GPX4、SOD1)、發(fā)育(EGFR、DNMT1a、FSHR)和

TGFβ家族(BMP6)相關(guān)基因的表達(dá)均有促進(jìn)或抑制作用(P<0.05),高濃度褪黑素(10-3 mol/L)在

48h對(duì)GPX4、SOD1 的促進(jìn)效果最顯著(P <0.05);高濃度褪黑素(10-3 mol/L)不影響 EGFR、

DNMT1a的表達(dá),其他濃度褪黑素均促進(jìn)EGFR、DNMT1a的表達(dá)(P<0.05);低濃度褪黑素(10-11 mol/L)

顯著抑制FSHR 的表達(dá)(P<0.05);褪黑素對(duì)于BMP6 的表達(dá)在24h為促進(jìn)作用(P<0.05),48h時(shí)抑

制其表達(dá)(P<0.05),72h時(shí)高濃度褪黑素(10-3 mol/L)和低濃度褪黑素(10-11 mol/L)無顯著作用,其

他濃度為促進(jìn)作用(P<0.05)。結(jié)論:褪黑素可以通過促進(jìn)抗氧化相關(guān)基因(GPX4、SOD1)、發(fā)育相關(guān)基

因(EGFR、DNMT1a)和TGFβ家族(BMP6)相關(guān)基因的表達(dá),抑制FSHR 的表達(dá)來保護(hù)顆粒細(xì)胞,抑制

其凋亡。

關(guān)鍵詞:褪黑素;牛;卵巢顆粒細(xì)胞;發(fā)育相關(guān)基因

中圖分類號(hào):S814 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1673-8772(2024)02-0013-06

開放科學(xué)(資源服務(wù))標(biāo)識(shí)碼(OSID): DOI:10.19608/j.cnki.1673-8772.2024.0202

Roleofmelatoninonexpressionofgenesrelatedto

ovariangranulosacelldevelopment

LIRui1, ZHENG Menghao1, WNAGJiaqi1, LIUYanyan1,

PANGXunsheng

1, LIU Wenju2, WANGShujuan1*

(1.CollegeofAnimalScience,AnhuiScienceandTechnologyUniversity,Fengyang233100,China;

2.CollegeofLifeandHealthSciences,AnhuiScienceandTechnologyUniversity,Fengyang233100,China)

Abstract:Objective:Toinvestigatetheeffectofmelatoninontheexpressionofdevelopment-related

genesinovariangranulosacells.Methods:TotalcellularRNA wasextractedaftertreatinggranulosa

cellswithdifferentconcentrationsofmelatonin(0,10-3,10-5,10-7,10-9,and10-11 mol/L)for24,

48,72 h,respectively,andthe expression ofgenesrelatedto antioxidant (GPX4,SOD1),

developmental(EGFR,DNMT1a,andFSHR),andTGFβfamily(BMP6)wasdetectedbyreal-time

PCR.Results:Differentconcentrationsofmelatoninpromotedorinhibitedtheexpressionofantioxidant

(GPX4,SOD1),developmental(EGFR,DNMT1a,FSHR),andTGFβfamily (BMP6)-related

genesat24,48,72h(P<0.05),andahighconcentrationofmelatonin(10-3 mol/L)hadthemost

significant(P<0.05)promotionaleffectonGPX4,SOD1,andSOD1at48h.Thehighconcentration

ofmelatonin(10-3 mol/L)hadthemostsignificant(P<0.05)promotionaleffectonGPX4andSOD1

at48h(P<0.05).SOD1at48h.Highconcentrationmelatonin(10-3 mol/L)hadthemostsignificant

effectonGPX4andSOD1 (P<0.05).Highconcentrationmelatonin(10-3 mol/L)didnotaffectthe

expressionofEGFRandDNMT1a,andallotherconcentrationsofmelatoninpromotedtheexpression

ofEGFR andDNMT1a (P <0.05),andlowconcentration melatonin (10-11 mol/L)significantly

inhibitedtheexpressionofFSHR (P<0.05),andtheeffectofmelatoninonBMP6expressionat24h

waspromotional(P<0.05).ExpressionofBMP6at24h(P<0.05)andinhibiteditsexpressionat

48h(P<0.05).At72h,thehighconcentrationofmelatonin(10-3 mol/L)andthelowconcentration

ofmelatonin (10-11 mol/L)didnothaveanysignificanteffect,andtheotherconcentrationshada

promotionaleffect (P <0.05).Conclusion:Melatonincanprotectgranulosacellsandinhibittheir

apoptosisbypromotingtheexpressionofantioxidant-relatedgenes (GPX4,SOD1),developmentrelatedgenes (EGFR,DNMT1a),and TGFβfamily (BMP6)-relatedgenes,andinhibitingthe

expressionofFSHR.

Keywords:Melatonin;Bovine;Ovariangranulosacells;Development-relatedgenes

剛出生母牛的卵巢中大約有130000個(gè)原始卵泡,然而99%原始卵泡最終閉鎖,只有不到1%的原始

卵泡能夠發(fā)育成熟并最終排卵,主要由于卵泡中的顆粒細(xì)胞凋亡引起的[1]。褪黑素在抑制顆粒細(xì)胞凋亡、

調(diào)控顆粒細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)具有重要的作用,探究不同濃度的褪黑素在不同作用時(shí)間對(duì)顆粒細(xì)胞發(fā)育

相關(guān)基因的影響,可為褪黑素的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。顆粒細(xì)胞分泌多種激素和調(diào)控因子,可通過旁分泌的

形式調(diào)控卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟。褪黑素除了通過下丘腦-垂體-性腺軸影響動(dòng)物的繁殖功能外,還可以

通過直接作用于卵巢,影響卵巢的功能,褪黑素調(diào)節(jié)卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞發(fā)育和顆粒細(xì)胞的功能在牛[2]、豬[3]

和小鼠[4]上均有報(bào)道。褪黑素介入牛卵母細(xì)胞的成熟、卵泡和胚胎的發(fā)育。褪黑素可以清除自由基,減少

內(nèi)源性ROS來保護(hù)顆粒細(xì)胞的完整性[5],進(jìn)而抑制卵泡發(fā)育過程中顆粒細(xì)胞的凋亡。褪黑素通過抑制促

凋亡基因的表達(dá)和促進(jìn)抑凋亡基因的表達(dá)來調(diào)控牛顆粒細(xì)胞的凋亡,并且可以促進(jìn)顆粒細(xì)胞分泌孕酮,因

此褪黑素通過不同的機(jī)制來影響顆粒細(xì)胞的功能。顆粒細(xì)胞對(duì)維持卵巢正常功能和卵泡發(fā)育具有重要的

作用,其在發(fā)育過程中分泌的激素及一系列生長(zhǎng)因子對(duì)卵母細(xì)胞的發(fā)育具有重要的調(diào)控作用,顆粒細(xì)胞的

增殖、分化和凋亡會(huì)決定卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟,并且顆粒細(xì)胞的凋亡會(huì)誘導(dǎo)卵泡閉鎖的起始和影響卵母

細(xì)胞的質(zhì)量[6]。褪黑素對(duì)于顆粒細(xì)胞相關(guān)基因的調(diào)控已有一定的驗(yàn)證,但是對(duì)于不同濃度的褪黑素在各

個(gè)時(shí)間段對(duì)于發(fā)育相關(guān)基因的調(diào)控研究較少。本研究探究不同濃度的褪黑素(0、10-3、10-5、10-7、10-9、

10-11 mol/L)在24、48、72h對(duì)抗氧化(GPX4、SOD1)、發(fā)育(EGFR、DNMT1a、FSHR)和TGFβ(轉(zhuǎn)化生

長(zhǎng)因子β)家族相關(guān)基因(BMP6)的表達(dá)水平的調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

牛卵巢采集于蚌埠市(中國(guó)安徽)某屠宰場(chǎng),總RNA提取試劑盒、PCR反應(yīng)試劑盒購于天根生化科技

有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;RT-PCR反應(yīng)試劑盒、相關(guān)引物由生工生

14 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 顆粒細(xì)胞的分離培養(yǎng)

將從屠宰場(chǎng)收集的60對(duì)牛卵巢放入38℃含有青霉素(100IU/mL)、鏈霉素(100μg/mL)的生理鹽水中

保存,并在3h內(nèi)返回實(shí)驗(yàn)室。采用無菌針穿刺的方法從直徑3~6mm的卵泡中抽取卵泡液,在1500r/min

下離心5min,收集細(xì)胞,用PBS沖洗吹勻沉淀細(xì)胞再次離心。將細(xì)胞轉(zhuǎn)入至含有10%胎牛血清、青霉素

(50IU/mL)和鏈霉素(50μg/mL)的DMEM 培養(yǎng)液中,混勻后接種到孔徑60mm 的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。顆

粒細(xì)胞最后放在37℃,含5% CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞處理

利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板測(cè)定細(xì)胞濃度,按照1×105 個(gè)細(xì)胞/孔轉(zhuǎn)至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板上,然后添加含有不同

濃度褪黑素(0、10-3、10-5、10-7、10-9、10-11 mol/L)的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),每個(gè)濃度3組,分別培養(yǎng)24、48、

72h,每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 顆粒細(xì)胞總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

根據(jù)總RNA提取試劑盒的說明書進(jìn)行顆粒細(xì)胞總 RNA的提取,提取后的總 RNA 采用 RevertAid

FirstStrandcDNA試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,cDNA 反應(yīng)體系為1.5μgRNA 模板、1.5μLOligo

(dT)18primer、加RNasefreeddH2O至18μL,然后加6μL5×ReactionBuffer、1.5μL20U/μLRiboLockRNaseInhibitor、3μL10mmol/LdNTPMix、1.5μLRevertAidM-MuLVRT(200U/μL),總體積

為30μL?；旌暇鶆蚝?在42℃下孵育60min,70℃下孵育5min,25℃孵育30min,獲得產(chǎn)物保存于

-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 Real-timePCR

利用Primer6.0設(shè)計(jì)相關(guān)基因的引物(表1),以cDNA 為模板,測(cè)定發(fā)育(EGFR、DNMT1a、

FSHR)、抗氧化(GPX4、SOD1)、TGF-β家族(BMP6)相關(guān)基因的表達(dá),采用10μL反應(yīng)體系(5.0μL含綠色

熒光的2×MixBuffer,2μLcDNA,0.5μL10mmol/L正、反引物,ddH2O補(bǔ)充),反應(yīng)程序如表2所示。

表1 試驗(yàn)引物

Table1 Primersusedinpresentstudy

基因 序列 引物長(zhǎng)度/bp 退火溫度/℃

β-actin 5'-CATCGGCAATGAGCGGTTCC-3' 145 60

5'-CCGTGTTGGCGTAGAGGTCC-3'

GPX4 5'-TGTGCTCGCTCCATGCACGA-3' 224 60

5'-CCTGGCTCCTGCCTCCCAA-3'

SOD1 5'-GCTGTACCAGTGCAGGTCCTCA-3' 228 61

5'-CATTTCCACCTCTGCCCAAGTC-3'

BMP6 5'-TACGCTGCCAACTACTGTGAC-3' 153 60

5'-GATGGCGTTCAGTTTCGTG-3'

DNMT1a 5'-ACGAATGGTGGATTGCTGGT-3' 197 60

5'-CACGTCTTCGTAGGTGGAGTC-3'

EGFR 5'-CACTCATGCTCTATGACCCTACC-3' 176 60

5'CTCACCGATTCCTATTCCGTTAC-3'

FSHR 5'-GAAGAAAGCAGGTGGATGGA-3' 126 60

5'-GGCAGAGGAAAACTCCGTTA-3'

表2 熒光定量PCR反應(yīng)程序

Table2 Reactionprogramofreal-timePCR

反應(yīng)步驟 溫度/℃ 時(shí)間/s 循環(huán)次數(shù) 熒光信號(hào)

預(yù)孵育 95 30 1 無

95 5

擴(kuò)增 63 20 45 在延伸階段結(jié)束時(shí)

72 20

熔解曲線 60 25 1 在溫度緩慢升高過程中

冷卻 40 10 1 無

第38卷第2期 李 瑞,等:褪黑素對(duì)牛卵巢顆粒細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的作用 15

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

利用LightCycler480軟件分析Real-timePCR數(shù)據(jù),用2-ΔΔCT 方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。采用SPSS11.5進(jìn)

行單因素方差分析,結(jié)果以3次測(cè)定的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示(P<0.05為差異顯著)。

2 結(jié)果分析

2.1 褪黑素對(duì)抗氧化相關(guān)基因表達(dá)的影響

與對(duì)照組對(duì)比,不同濃度褪黑素處理24、48、72h,低濃度(10-11 mol/L)在72h對(duì)GPX4 基因的影響

不顯著(圖1),其他濃度及時(shí)間段對(duì)GPX4 和SOD1 基因 mRNA表達(dá)均有促進(jìn)作用(P<0.05)。高濃度

褪黑素(10-3 mol/L)在48h對(duì)GPX4 和SOD1 表達(dá)促進(jìn)作用最為顯著(P<0.05)。

圖1 不同濃度褪黑素處理24、48、72h對(duì)GPX4、SOD1mRNA 表達(dá)的影響

Fig.1 EffectsofdifferentconcentrationsofmelatoninonGPX4,SOD1 mRNAexpressionat24,48,72h

2.2 褪黑素對(duì)發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比,除高濃度褪黑素(10-3 mol/L)在48h時(shí)對(duì)DNMT1a 的表達(dá)作用不顯著外,其他濃

度的褪黑素在各時(shí)間段均促進(jìn) DNMT1a 的表達(dá)(P<0.05),并且同一時(shí)間不同濃度的褪黑素之間

DNMT1a的表達(dá)差異不顯著(圖2)。高濃度褪黑素(10-3 mol/L)在各時(shí)間段對(duì)EGFR 的表達(dá)均沒有影

響,在24h時(shí),低濃度褪黑素(10-11 mol/L)對(duì)EGFR mRNA的促進(jìn)作用明顯高于其他濃度(P<0.05),

在與72h時(shí)比較,差異不顯著(圖2)。在24h時(shí),較低褪黑素濃度不影響FSHR 的表達(dá),但是隨著作用

時(shí)間的延續(xù),低濃度褪黑素(10-11 mol/L)顯著抑制FSHR 的表達(dá)(P<0.05)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在48h時(shí),較

低濃度的褪黑素對(duì)于DNMT1a、EGFR 的表達(dá)促進(jìn)和FSHR 的表達(dá)抑制均優(yōu)于高濃度的褪黑素水平。

圖2 不同濃度褪黑素處理24、48、72h對(duì)DNMT1a、EGFR、FSHR mRNA表達(dá)的影響

Fig.2 EffectsofdifferentconcentrationsofmelatoninonDNMT1a,EGFR,FSHR mRNAexpressionat24,48,72h

16 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

2.3 褪黑素對(duì)TGF-β超家族基因表達(dá)的影響

褪黑素處理顆粒細(xì)胞后對(duì)BMP6 基因的表達(dá)存在時(shí)間差異性(圖3)。添加褪黑素24h后,顯著促進(jìn)

BMP6的表達(dá)(P<0.05),促進(jìn)作用與濃度存在正比關(guān)系,濃度越高,BMP6 表達(dá)量越高;48h時(shí),顆粒細(xì)

胞中BMP6 的表達(dá)則不同于24h,褪黑素抑制其表達(dá)水平,且褪黑素濃度越高,BMP6 表達(dá)水平越低

(P<0.05);褪黑素作用72h時(shí),褪黑素濃度過高(10-3 mol/L)或者濃度過低(10-11 mol/L)對(duì)BMP6 的

表達(dá)沒有顯著影響,其他濃度褪黑素組的BMP6 的表達(dá)顯著升高(P<0.05)。在整個(gè)褪黑素的添加過程

中,低濃度褪黑素(10-11 mol/L)對(duì)于BMP6 的表達(dá)沒有影響。

圖3 不同濃度褪黑素處理24、48、72h對(duì)BMP6 mRNA表達(dá)的影響

Fig.3 EffectsofdifferentconcentrationsofmelatoninonBMP6 mRNAexpressionat24,48,72h

3 結(jié)論與討論

卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和成熟以及排卵是生殖的重要過程[7]。然而,卵泡發(fā)育過程是復(fù)雜的,許

多因素都參與了卵巢卵泡生成過程,例如遠(yuǎn)距內(nèi)分泌和局部自分泌、旁分泌系統(tǒng),以及顆粒細(xì)胞等[8]。顆

粒細(xì)胞在卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟過程中發(fā)揮著重要作用,顆粒細(xì)胞可以產(chǎn)生許多生長(zhǎng)因子,并分泌一些

激素例如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、雌激素、孕酮、雌二醇等,其均介導(dǎo)卵泡的發(fā)育和卵母細(xì)胞的成熟。同時(shí),顆粒細(xì)

胞的凋亡可引發(fā)卵泡閉鎖,卵泡閉鎖主要是顆粒細(xì)胞發(fā)生大規(guī)模凋亡的一個(gè)過程,而從形態(tài)學(xué)變化來看,

顆粒細(xì)胞凋亡的發(fā)生遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于卵泡閉鎖的發(fā)生,而卵泡閉鎖的現(xiàn)象只有在卵泡中的凋亡顆粒細(xì)胞達(dá)到一

定程度時(shí)才能觀察到[9]。因此,顆粒細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是卵泡閉鎖的引發(fā)劑,探究顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)卵

泡的發(fā)育具有重要意義。

顆粒細(xì)胞的發(fā)育首先是受自身的發(fā)育相關(guān)基因的調(diào)控,其次就是受到活性氧(ROS)水平的影響,一

定水平的ROS對(duì)于細(xì)胞發(fā)育具有促進(jìn)作用,但在高濃度下,會(huì)使細(xì)胞中的氧化還原狀態(tài)向氧化應(yīng)激轉(zhuǎn)變,

會(huì)損害線粒體氧化磷酸化,降低線粒體 DNA 拷貝數(shù),導(dǎo)致線粒體產(chǎn)生 ATP的能力下降[10]。SOD1 和

GPX4 的表達(dá)是細(xì)胞抗氧化功能的一個(gè)重要指標(biāo),其活性越高意味著抗氧化能力越強(qiáng),SOD1 和GPX4 的

協(xié)同作用可以把細(xì)胞中的超氧化物陰離子轉(zhuǎn)化為 H2O 和 O2

[11]。褪黑素可以直接進(jìn)入細(xì)胞與 ROS結(jié)

合,清除細(xì)胞中的ROS發(fā)揮抗氧化的作用,同時(shí),褪黑素可以與其特異性受體相結(jié)合,增強(qiáng)抗氧化酶的活

性,上調(diào)抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)[12]。褪黑素對(duì)顆粒細(xì)胞的抗氧化作用已在家禽[13]、牛[14]、鼠[15]中被證

實(shí),其可以通過上調(diào)卵巢中GPX3、SOD2、PRDX3 的表達(dá)量增強(qiáng)顆粒細(xì)胞的抗氧化能力,這與本研究相

一致。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),在24h時(shí),不同濃度褪黑素對(duì)GPX4、SOD1 的影響差異性不大,但是在48h和

72h時(shí)高濃度的褪黑素(10-3 mol/L)極顯著的提高了GPX4 和SOD1 的表達(dá)。

在卵泡發(fā)育過程中DNMT1a、EGFR 和FSHR 對(duì)顆粒細(xì)胞功能具有重要的調(diào)節(jié)作用[5],本研究結(jié)果

表明,褪黑素可調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞中 DNMT1a、EGFR 和FSHR 的表達(dá),研究發(fā)現(xiàn)除了高濃度褪黑素

(10-3 mol/L),其他濃度的褪黑素在24、48、72h時(shí)對(duì)DNMT1a和EGFR 表達(dá)均有促進(jìn)作用。褪黑素除

了對(duì)顆粒細(xì)胞中DNMT1a和EGFR 產(chǎn)生作用,還對(duì)牛胚胎發(fā)育[16]、綿羊卵母細(xì)胞成熟中的DNMT1a

表達(dá)和綿羊卵丘細(xì)胞中的EGFR 產(chǎn)生相同的作用[17]。添加褪黑素會(huì)抑制顆粒細(xì)胞FSHR 的表達(dá),

FSHR 參與FSH 功能發(fā)揮,一定水平的FSH 可通過PINK1-Parkin信號(hào)通路來抑制線粒體自噬來保護(hù)

顆粒細(xì)胞存活,但是 FSH 的增加會(huì)激活 Pkahin酶導(dǎo)致 GSK-3β(糖原合成酶激酶-3)活性下調(diào),誘導(dǎo)

NF-κB(核因子κB)通路失活,從而激活細(xì)胞凋亡[18]。BMP6 的表達(dá)對(duì)于顆粒細(xì)胞的增殖周期和凋亡沒

第38卷第2期 李 瑞,等:褪黑素對(duì)牛卵巢顆粒細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的作用 17

有直接的影響,但是可上調(diào)顆粒細(xì)胞中CYP2A4 和CYP19A1 的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)顆粒細(xì)胞中E2 和孕酮的

分泌,促進(jìn)卵巢的發(fā)育[19-20]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高濃度褪黑素的添加在24h時(shí)可以顯著增強(qiáng)BMP6 的表達(dá),之

后會(huì)呈現(xiàn)抑制的現(xiàn)象可能是存在機(jī)體自身的負(fù)反饋調(diào)節(jié),72h后,高濃度(10-3 mol/L)和低濃度褪黑素

(10-11 mol/L)對(duì)BMP6 的表達(dá)沒有影響,其他濃度均顯著促進(jìn)其表達(dá)。

本研究驗(yàn)證了褪黑素對(duì)于卵巢顆粒細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因的影響,結(jié)果表明,不同濃度的褪黑素可以通過

促進(jìn)抗氧化相關(guān)基因(GPX4、SOD1)、發(fā)育相關(guān)基因(EGFR、DNMT1a)和TGFβ家族(BMP6)基因的表

達(dá),來減少氧化應(yīng)激對(duì)顆粒細(xì)胞功能的影響,刺激顆粒細(xì)胞的發(fā)育成熟,同時(shí)抑制FSHR 的表達(dá),保護(hù)顆

粒細(xì)胞抑制其凋亡。

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(責(zé)任編輯:顧文亮)

18 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào),2024,38(2):19-24

JournalofAnhuiScienceandTechnologyUniversity

收稿日期:2023-07-25

基金項(xiàng)目:安徽省高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目(KJ2020A086)。

作者簡(jiǎn)介:汪來香(1997-),女,安徽石臺(tái)人,碩士研究生,主要從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)生理研究,E-mail:1749609644@qq.com。

通信作者:周金星,教授,E-mail:zhoujx@ahstu.edu.cn。

安徽省部分地區(qū)山羊羔癱軟綜合征調(diào)查與分析

汪來香1, 郭大偉3, 江喜春4, 周金星1,2*

(1.安徽科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,安徽 鳳陽 233100;

2.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)調(diào)控與健康安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 鳳陽 233100;

3.安徽綠墅牧業(yè)有限公司,安徽 利辛 236700;

4.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所,安徽 合肥 230031)

摘 要:目的:調(diào)查安徽省部分地區(qū)山羊羔癱軟綜合征的發(fā)病情況。方法:通過問卷調(diào)查和實(shí)地走訪,分別

對(duì)安徽省9個(gè)地級(jí)市75家山羊養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行調(diào)查。結(jié)果:75家山羊養(yǎng)殖場(chǎng)中,有37.33%的養(yǎng)殖場(chǎng)在春季

發(fā)病,有29.34%的養(yǎng)殖場(chǎng)在冬季發(fā)病,且出生后4~15d羔羊發(fā)病率最高,占發(fā)病羔羊的66.67%,山羊

羔癱軟綜合征的羔羊死亡率可達(dá)20%~60%。夏秋季節(jié)少發(fā)或偶發(fā)。結(jié)論:根據(jù)調(diào)查結(jié)果,建議加強(qiáng)對(duì)

妊娠母羊妊娠期管理,科學(xué)配制妊娠期母羊的飼料,提高母羊及羔羊的管理水平,通過對(duì)母羊適當(dāng)放牧、增

加運(yùn)動(dòng)、定期免疫和驅(qū)蟲、加強(qiáng)分娩前后的環(huán)境和管理,可減少山羊羔癱軟綜合征的發(fā)病率。

關(guān)鍵詞:羔羊;癱軟綜合征;山羊

中圖分類號(hào):S852.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1673-8772(2024)02-0019-06

開放科學(xué)(資源服務(wù))標(biāo)識(shí)碼(OSID): DOI:10.19608/j.cnki.1673-8772.2024.0203

InvestigationandanalysisofFloppyKidSyndrome

insomeareasofAnhuiProvince

WANGLaixiang

1, GUODawei3, JIANGXichun4, ZHOUJinxing

1,2*

(1.CollegeofAnimalScience,AnhuiScienceandTechnologyUniversity,Fengyang233100,China;

2.AnhuiProvinceKeyLaboratoryofAnimalNutritionRegulationandHealth,Fengyang233100,China;

3.AnhuiLvshuAnimalHusbandryCo.,Ltd.,Lixin236700,China;

4.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,AnhuiAcademyofAgriculturalScience,Hefei230031,China)

Abstract:Objective:ToinvestigatetheincidenceofFloppyKidSyndrome(FKS)insomeareasofAnhui

Province.Methods:75Goatfarmswereinvestigatedthroughquestionnairesandfieldvisitsin9citiesof

AnhuiProvince.Results:TheincidencerateofFKSwas37.33%inspring,and29.34%inwinter,and

theincidenceageswerehighestin4—15d,accountingfor66.67%ofthesicklambs,thedeathrateof

FKSlambsreached20%—60%.Rareoroccasionaloccurrencewasinsummerandautumn.Conclusion:

Accordingtothesurvey,itwaspredictedthattheincidenceofFKScanbereducedbystrengtheningthe

managementofpregnantewesduringpregnancy,scientificallypreparingthefeedforpregnantewes,

improvingthemanagementofewesandlambs,andbyproperlygrazingewes,increasingexercise,regular

immunization,anddeworming,strengtheningenvironmentandmanagementbeforeandafterchildbirth.

Keywords:Lambs;FloppyKidSyndrome(FKS);Goats

中國(guó)綿羊、山羊品種資源豐富,分布范圍廣。隨著中國(guó)畜牧業(yè)集約化水平的日益提升,養(yǎng)羊業(yè)也將成

為中國(guó)經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)的新亮點(diǎn)。安徽省養(yǎng)羊業(yè)歷史悠久,具有豐富的飼草資源和農(nóng)村勞動(dòng)力資源,具有發(fā)展肉

用山羊產(chǎn)業(yè)的明顯優(yōu)勢(shì)[1-2]。然而近年來山羊羔癱軟綜合征(FloppyKidSyndrome,FKS)嚴(yán)重阻礙著養(yǎng)

羊業(yè)發(fā)展。山羊羔癱軟綜合征與代謝性酸中毒有關(guān)[3-4],發(fā)病特征為軟癱、搖擺無力、腹脹、腹瀉、食欲下

降、運(yùn)動(dòng)障礙等,發(fā)病率較高,不及時(shí)治療的羔羊死亡迅速,給養(yǎng)羊戶造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5]。歐洲、北美

洲一些國(guó)家也相繼報(bào)道了山羊羔癱軟綜合征在本國(guó)的一些發(fā)病情況[6-10]。對(duì)于該發(fā)病原因,歐洲、北美洲

一些學(xué)者根據(jù)臨床表現(xiàn),分別從大腸桿菌、A 型產(chǎn)氣莢膜梭菌、隱孢子蟲等病原的感染,以及羔羊的飼養(yǎng)

管理方面進(jìn)行了研究,其結(jié)果仍有待進(jìn)一步證實(shí)。根據(jù)以上相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,患有癱軟綜合征的羔羊均表現(xiàn)

為厭食、嗜睡、肌肉張力下降、不吮乳、癱軟。目前中國(guó)對(duì)山羊羔癱軟綜合征的相關(guān)報(bào)道較少,本研究對(duì)安

徽省部分地區(qū)山羊養(yǎng)殖場(chǎng)山羊羔癱軟綜合征進(jìn)行調(diào)查,并對(duì)調(diào)查信息匯總、統(tǒng)計(jì)分析,總結(jié)出山羊羔癱軟

綜合征發(fā)病原因,并制定具有針對(duì)性的預(yù)防措施,為預(yù)防山羊羔癱軟綜合征的發(fā)生提供參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查對(duì)象

調(diào)查對(duì)象為安徽省安慶市、池州市、宣城市、馬鞍山市、六安市、蚌埠市、亳州市、宿州市、阜陽市等9個(gè)

地級(jí)市75家山羊養(yǎng)殖場(chǎng),調(diào)查其羔羊癱軟綜合征發(fā)病情況。調(diào)查對(duì)象分布區(qū)域及調(diào)查養(yǎng)殖場(chǎng)數(shù)量如圖1

所示。

圖1 安徽省部分地區(qū)山羊羔癱軟綜合征調(diào)查區(qū)域及養(yǎng)殖場(chǎng)數(shù)分布

Fig.1 SurveyareaanddistributionmapofthenumberofbreedingfarmsforFKSinsomeregionsofAnhuiProvince

注:數(shù)字代表該區(qū)域內(nèi)被調(diào)查的養(yǎng)殖場(chǎng)數(shù)。

20 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

1.2 調(diào)查方法

通過對(duì)安徽省9個(gè)地區(qū)75家山羊養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行問卷調(diào)查和現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查,調(diào)查養(yǎng)殖場(chǎng)的存欄量、養(yǎng)殖方式、

養(yǎng)殖模式、發(fā)病季節(jié)、發(fā)病癥狀、發(fā)病時(shí)間、發(fā)病數(shù)、死亡數(shù)、常用治療藥物以及治療效果等指標(biāo)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

對(duì)75份問卷調(diào)查涉及的養(yǎng)殖方式、養(yǎng)殖模式、發(fā)病季節(jié)、發(fā)病癥狀、發(fā)病時(shí)間、發(fā)病數(shù)、死亡數(shù)進(jìn)行統(tǒng)

計(jì),利用SPSS軟件對(duì)各地區(qū)平均發(fā)病率、平均死亡率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 安徽省部分地區(qū)山羊養(yǎng)殖場(chǎng)山羊羔癱軟綜合征發(fā)病癥狀、用藥情況

由表1可見,調(diào)查的9個(gè)地區(qū)山羊羔癱軟綜合征的發(fā)病癥狀基本一致,主要表現(xiàn)為四肢癱軟、無法站

立、食欲下降等。常用的治療藥物主要為維生素類、多糖類及部分抗生素,但治療效果都不明顯。

表1 安徽省部分地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)山羊羔癱軟綜合征發(fā)病癥狀、用藥情況

Table1 SymptomsandmedicationstatusofFKSinsomeareasofAnhuiProvince

地區(qū) 發(fā)病癥狀 常用治療藥 治療效果

安慶市

四肢癱軟、肌無力、嚴(yán)重的腿癱、無法站

立、呼吸困難、精神沉郁、心跳遲緩

維生素 D、頭孢噻呋鈉、土霉素、多酶片、維生素 C、葡萄糖酸鈣、青

霉素

不明顯

池州市 四肢癱軟、無法站立 葡萄糖酸鈣鋅口服液、癱軟靈 不明顯

宣城市 癱軟、無法站立、食欲下降

葡萄糖多維礦物質(zhì)混合液、鈣中鈣口服液、維生素 D膠性鈣、維生

素B12

不明顯

馬鞍山市 四肢癱軟、無法站立 維生素D、青霉素、葡萄糖酸鈣 不明顯

六安市 癱軟、腹脹、無法站立、軟癱、不食 維生素C、維生素B1、維生素B2、葡萄糖酸鈣、鈣磷制劑 不明顯

蚌埠市 無法站立、四肢癱軟 維生素 A、維生素D、葡萄糖酸鈣 不明顯

亳州市

癱軟、呼吸急促、搖擺、渾身無力、吃不住

奶、體溫偏高、心跳加快

青霉素、頭孢、林可霉素、安片西林奈、軟癱靈、葡萄糖酸鈣鋅口服

液、黃芪多糖、慶大霉素

不明顯

宿州市

無法直立行走、體質(zhì)虛弱、癱軟、四肢無

力、腹瀉

維生素D膠性鈣、復(fù)合維生素B、羔羊犢牛癱軟強(qiáng)壯液、慶大霉素、

鈣鐵鋅片

不明顯

阜陽市 四肢癱軟、搖擺無力 葡萄糖酸鈣、慶大霉素、恩諾沙星注射液 不明顯

2.2 安徽省部分地區(qū)山羊養(yǎng)殖場(chǎng)山羊羔癱軟綜合征發(fā)病及死亡情況

由圖2所示,安徽省各地區(qū)山羊養(yǎng)殖場(chǎng)都有發(fā)病情況,各地區(qū)山羊養(yǎng)殖場(chǎng)羔羊平均發(fā)病率為0.4%~

6%,亳州市與其他各市之間差異顯著(P<0.05),安慶市、宣城市、馬鞍山市、蚌埠市、宿州市、阜陽市之間

無顯著差異(P>0.05),該病在大規(guī)模山羊養(yǎng)殖場(chǎng)羔羊發(fā)病率較高,小規(guī)模養(yǎng)殖戶的羔羊發(fā)病率較低。

由圖3所示,各地區(qū)山羊養(yǎng)殖場(chǎng)羔羊平均死亡率為20%~60%,六安市和池州市、亳州市之間差異顯

著(P<0.05),安慶市、宣城市、馬鞍山市、蚌埠市、宿州市、阜陽市之間無顯著差異(P>0.05),該病在大

規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)死亡率較低。

圖2 安徽省部分地區(qū)山羊養(yǎng)殖場(chǎng)羔羊平均發(fā)病率

Fig.2 Averageincidencerateoflambsingoatfarms

insomeareasofAnhuiProvince

注:肩標(biāo)字母相同表示差異不顯著(P>0.05),肩標(biāo)字母不

同表示差異顯著(P<0.05)。

圖3 安徽省部分地區(qū)山羊養(yǎng)殖場(chǎng)羔羊平均死亡率

Fig.3 Averagemortalityrateoflambsingoatfarms

insomeregionsofAnhuiProvince

注:無肩標(biāo)字母或肩標(biāo)字母相同表示差異不顯著(P>0.05),

肩標(biāo)字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

第38卷第2期 汪來香,等:安徽省部分地區(qū)山羊羔癱軟綜合征調(diào)查與分析 21

2.3 安徽省部分地區(qū)山羊養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖方式

由圖4可知,此次調(diào)查的安徽省部分地區(qū)山羊養(yǎng)殖場(chǎng)主要以圈養(yǎng)、放養(yǎng)和半牧半舍的飼養(yǎng)方式進(jìn)行飼

養(yǎng)。其中圈養(yǎng)的養(yǎng)殖場(chǎng)66家,占88%;放養(yǎng)的養(yǎng)殖場(chǎng)5家,占6.67%;半牧半舍的養(yǎng)殖場(chǎng)4家,占5.33%。

調(diào)查結(jié)果顯示,圈養(yǎng)是安徽省山羊養(yǎng)殖場(chǎng)主要飼養(yǎng)方式。

2.4 安徽省部分地區(qū)山羊養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖模式

由圖5可知,此次調(diào)查的安徽省部分地區(qū)山羊養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)模式有2種,分別為自繁自養(yǎng)和專業(yè)育肥,

其中自繁自養(yǎng)的養(yǎng)殖場(chǎng)66家,占88%;專業(yè)育肥的養(yǎng)殖場(chǎng)9家,占12%。調(diào)查結(jié)果顯示,自繁自養(yǎng)是安徽

省山羊養(yǎng)殖場(chǎng)主要養(yǎng)殖模式。

圖4 安徽省部分地區(qū)山羊養(yǎng)殖方式統(tǒng)計(jì)

Fig.4 Statisticalchartofgoatbreedingmethods

insomeregionsofAnhuiProvince

圖5 安徽省部分地區(qū)山羊養(yǎng)殖模式統(tǒng)計(jì)

Fig.5 Statisticalchartofgoatbreedingpatterns

insomeregionsofAnhuiProvince

2.5 安徽省部分地區(qū)山羊養(yǎng)殖場(chǎng)飼料來源

由圖6可知,此次調(diào)查的安徽省部分地區(qū)山羊養(yǎng)殖場(chǎng)飼料來源有3種,自配飼料來源的養(yǎng)殖場(chǎng)49家,

占65.33%;購買飼料來源的養(yǎng)殖場(chǎng)14家,占18.67%;自配+購買飼料來源的養(yǎng)殖場(chǎng)12家,占16%。調(diào)

查結(jié)果顯示,自配飼料是安徽省山羊養(yǎng)殖場(chǎng)主要飼料來源。

2.6 安徽省部分地區(qū)山羊養(yǎng)殖場(chǎng)山羊羔癱軟綜合征發(fā)病階段

由圖7可知,此次調(diào)查的安徽省部分地區(qū)新生山羊羔癱軟綜合征在1~3d發(fā)病的養(yǎng)殖場(chǎng)有16家,占

21.33%;4~15d發(fā)病的養(yǎng)殖場(chǎng)有50家,占66.67%;16~55d發(fā)病的養(yǎng)殖場(chǎng)有9家,占12%。調(diào)查結(jié)果

顯示,出生后4~15d是安徽省山羊羔癱軟綜合征發(fā)病的主要階段。

圖6 安徽省部分地區(qū)山羊養(yǎng)殖場(chǎng)飼料來源統(tǒng)計(jì)

Fig.6 Statisticalchartoffeedsourcesforgoatfarms

insomeregionsofAnhuiProvince

圖7 安徽省部分地區(qū)山羊養(yǎng)殖場(chǎng)山羊羔癱軟綜合征發(fā)病階段統(tǒng)計(jì)

Fig.7 StatisticalchartoftheincidencestagesofFKSingoatfarms

insomeregionsofAnhuiProvince

2.7 安徽省部分地區(qū)山羊養(yǎng)殖場(chǎng)山羊羔癱軟綜合征發(fā)病季節(jié)

由圖8可知,此次調(diào)查的安徽省部分地區(qū)山羊羔癱軟綜合征春季發(fā)病的養(yǎng)殖場(chǎng)28家,占37.33%;夏季

發(fā)病的養(yǎng)殖場(chǎng)9家,占12%;秋季發(fā)病的養(yǎng)殖場(chǎng)10家,占比13.33%,冬季發(fā)病的養(yǎng)殖場(chǎng)22家,占29.34%,常

年發(fā)病的養(yǎng)殖場(chǎng)6家,占8%。調(diào)查結(jié)果顯示,春、冬季節(jié)是安徽省山羊羔癱軟綜合征發(fā)病的主要季節(jié)。

圖8 安徽省部分地區(qū)山羊養(yǎng)殖場(chǎng)山羊羔癱軟綜合征發(fā)病季節(jié)統(tǒng)計(jì)

Fig.8 StatisticalchartofseasonalincidenceofFKSingoatfarmsinsomeareasofAnhuiProvince

22 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

3 結(jié)論與討論

3.1 發(fā)病因素

3.1.1 養(yǎng)殖規(guī)模因素 調(diào)查分析得知,亳州市羔羊平均發(fā)病率與其他各市之間差異顯著(P<0.05),亳州

市羔羊平均死亡率也相對(duì)較低。在相對(duì)較大規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)羔羊平均發(fā)病率較高,但山羊羔羊平均死亡率較

低,其主要原因是大規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖標(biāo)準(zhǔn)和管理制度相對(duì)完善,可以保證產(chǎn)品的質(zhì)量和安全,能更好地控

制養(yǎng)殖過程中的多種因素,如溫度、飼料、飲水、疫病等,從而提高養(yǎng)殖效率,減少養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)。小規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)

養(yǎng)殖制度和管理制度不完善,存在飼喂不合理、優(yōu)質(zhì)草料不足、消毒意識(shí)差、防范意識(shí)差等現(xiàn)象,導(dǎo)致羔羊

發(fā)病后死亡率較高[11]。

3.1.2 飼料因素 調(diào)查發(fā)現(xiàn)山羊養(yǎng)殖場(chǎng)飼料來源有3種(自配、購買、自配+購買),大部分養(yǎng)殖場(chǎng)都采用

自配飼料,但不同規(guī)模、不同羊群對(duì)飼料的要求也不同,養(yǎng)殖戶在自配飼料時(shí)因缺乏專業(yè)知識(shí)導(dǎo)致飼料出

現(xiàn)質(zhì)量安全、比例失衡、儲(chǔ)存不當(dāng)?shù)葐栴},再將飼料長(zhǎng)期飼喂給妊娠母羊可能會(huì)出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)缺失或營(yíng)養(yǎng)不足,

從而在母羊分娩后可能會(huì)引起山羊羔癱軟綜合征的發(fā)生[12]。為提高母羊妊娠率,在妊娠后期要保證飼料

充足,為妊娠母羊提供全價(jià)飼料,保持營(yíng)養(yǎng)均衡。需要補(bǔ)充適量的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素、微量元素等物

質(zhì),若維生素、礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)、微量元素長(zhǎng)期缺失或攝入不足,不僅會(huì)影響妊娠母羊的健康也會(huì)影響胎兒

的健康,從而導(dǎo)致山羊羔癱軟綜合征的發(fā)生[13]。若母羊采用舍飼管理,長(zhǎng)期攝入的青綠多汁飼料和青貯

飼料少,也不利于母羊營(yíng)養(yǎng)均衡。所以在自配飼料時(shí)要根據(jù)山羊的生長(zhǎng)階段進(jìn)行科學(xué)配制。在合理科學(xué)

配制飼料的同時(shí),加工和儲(chǔ)存飼料的設(shè)施條件也要達(dá)標(biāo)。大多數(shù)養(yǎng)殖場(chǎng)自配飼料的生產(chǎn)條件較差,飼料加

工設(shè)備不達(dá)標(biāo),儲(chǔ)存條件簡(jiǎn)陋,管理粗放,都會(huì)導(dǎo)致飼料發(fā)生霉變 ,再將霉變的飼料飼喂給羔羊很可能會(huì)

導(dǎo)致發(fā)病。

3.1.3 季節(jié)因素 根據(jù)調(diào)查,該病主要發(fā)生于山羊羔羊,且一年四季都有發(fā)生,但山羊羔癱軟綜合征在春

季、冬季發(fā)病較多,特別是圈養(yǎng)母羊所產(chǎn)羔羊發(fā)病率較高。冬季羊群活動(dòng)量小,陽光照射少,補(bǔ)飼跟不上,

長(zhǎng)時(shí)間圈養(yǎng),減少了羊群的戶外運(yùn)動(dòng)量,造成妊娠母羊體質(zhì)下降,最終對(duì)胎兒的正常發(fā)育造成影響,是導(dǎo)致

冬季羔羊發(fā)病率高的主要原因。春季發(fā)病主要因?yàn)槿焉锬秆蛟诙静捎萌︷B(yǎng)方式,且飼料營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)單一,

使得出生羔羊營(yíng)養(yǎng)不良、體質(zhì)較差,導(dǎo)致山羊羔癱軟綜合征高發(fā)。母羊妊娠階段對(duì)維生素及微量元素的需

求較高,若在飼養(yǎng)過程這部分營(yíng)養(yǎng)需求無法得到有效滿足,其乳汁營(yíng)養(yǎng)含量也會(huì)隨之降低,最終導(dǎo)致山羊

羔癱軟綜合征發(fā)病概率上升[14]。

3.1.4 環(huán)境管理因素 根據(jù)調(diào)查,羔羊在出生后4~15d發(fā)病數(shù)最多,大部分為突然發(fā)病,發(fā)病早期體溫

正?；蛘呱愿?。在羔羊管理過程中發(fā)現(xiàn),山羊羔癱軟綜合征常表現(xiàn)為同一窩多只羔羊同時(shí)發(fā)生或相繼發(fā)

生。母羊妊娠期間管理粗放,羊舍飼養(yǎng)密度大,運(yùn)動(dòng)量少,母羊體質(zhì)虛弱,羔羊出生后體溫調(diào)節(jié)能力差,抗

病力低,產(chǎn)房衛(wèi)生不佳,羊舍溫度過低,羊舍環(huán)境較差,羔羊沒吃好初乳,疫病防治措施沒到位,沒有做到定

期驅(qū)蟲等,這些都會(huì)導(dǎo)致新生羔羊發(fā)病。

3.2 預(yù)防措施

3.2.1 母羊妊娠管理 母羊妊娠前期采用放牧飼養(yǎng)與人工飼喂相結(jié)合的方法進(jìn)行飼喂管理,放牧可增加

山羊的太陽光照射量、活動(dòng)量以及采食種類多樣性,可以促進(jìn)體內(nèi)鈣磷的吸收與轉(zhuǎn)化[15]。因此,科學(xué)配制

妊娠期母羊飼料,既要保證飼料原料的質(zhì)量,混料均勻,又要注意配方的科學(xué)性。不同飼養(yǎng)階段飼料配方

不同,要根據(jù)母羊體況適當(dāng)補(bǔ)充礦物質(zhì)和維生素等營(yíng)養(yǎng)成分。在母羊妊娠期適當(dāng)增加精飼料供給量,粗飼

料可逐漸更換為嫩草優(yōu)質(zhì)飼草,嚴(yán)禁飼喂發(fā)霉變質(zhì)的飼料。在合理科學(xué)配制飼料的同時(shí),加工和儲(chǔ)存飼料

的設(shè)施條件要達(dá)標(biāo),飼料原料存放要合理,防止飼料發(fā)酵腐敗產(chǎn)生霉菌毒素。同時(shí),養(yǎng)殖戶應(yīng)提高飼料安

全意識(shí),記錄好飼料配制時(shí)間,一旦飼料出現(xiàn)任何異?？呻S時(shí)查找記錄解決問題[16]。

3.2.2 母羊綜合管理 調(diào)查得知,春冬季節(jié)是山羊羔癱軟綜合征發(fā)病率較高的季節(jié),因此,首先要對(duì)圈養(yǎng)

的母羊適當(dāng)放牧以提高個(gè)體的抵抗力,加大太陽光照射量和母羊運(yùn)動(dòng)量。其次可在冬季枯草期通過飼喂

人工種植飼草解決青草不足帶來的營(yíng)養(yǎng)攝入不全問題,如飼喂人工種植的黑麥草。再次在春冬季節(jié)定期

第38卷第2期 汪來香,等:安徽省部分地區(qū)山羊羔癱軟綜合征調(diào)查與分析 23

對(duì)母羊接種疫苗,預(yù)防由于氣溫不穩(wěn)定帶來的各種疾病及并發(fā)癥。同時(shí),定期給母羊進(jìn)行驅(qū)蟲,通過母羊

群體的綜合管理,減少山羊羔癱軟綜合征的發(fā)生。

3.2.3 羔羊管理 首先加強(qiáng)分娩過程管理,分娩前后飼養(yǎng)員必須做好產(chǎn)房的環(huán)境消毒,確保地面清潔、干

燥,定時(shí)清理羊糞,分娩操作前對(duì)相關(guān)用具進(jìn)行消毒,減少病原微生物污染。其次分娩后即刻對(duì)母羊乳房

和乳頭進(jìn)行消毒處理,保證羔羊盡快吃到初乳,并對(duì)羔羊臍帶進(jìn)行消毒。再次確保羔羊舍保溫設(shè)施完備避

免吹風(fēng) ,如關(guān)好羊舍門窗、鋪干草增加保溫性能等,保證羔羊體質(zhì)健康來減少山羊羔癱軟綜合征的發(fā)生。

3.3 結(jié)論

山羊羔癱軟綜合征發(fā)病突然,在較大規(guī)模的養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病率較高,但死亡率較低。新生羔羊在4~15d

發(fā)病數(shù)最多,不及時(shí)治療死亡率較高,死亡率為20%~60%。該病一年四季均可發(fā)生,但在春、冬季發(fā)病

較多。通過加強(qiáng)對(duì)妊娠母羊妊娠期管理、提高母羊及羔羊的管理水平,可減少山羊羔癱軟綜合征的發(fā)病

比例。

參考文獻(xiàn):

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(責(zé)任編輯:顧文亮)

24 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào),2024,38(2):25-30

JournalofAnhuiScienceandTechnologyUniversity

收稿日期:2023-10-12

基金項(xiàng)目:農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站/廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(YDWS202104);安

徽省高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目(2022AH051641);安徽省自然科學(xué)基金(1908085QC116);安徽科技學(xué)院人才引進(jìn)項(xiàng)目

(DKYJ201902)。

作者簡(jiǎn)介:羅昕雨(1998-),女,江蘇淮安人,碩士研究生,主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究,E-mail:972994329@qq.com。

通信作者:劉欣超,副教授,E-mail:liuxch@ahstu.edu.cn。

血清4型禽腺病毒Fiber-1蛋白截短表達(dá)

及多克隆抗體制備

羅昕雨1,2, 趙 磊1,2, 陳玉晴1,2, 繆欣怡1,2,

石家鑫1,2, 顧有方1,2, 李文超1,2, 劉欣超1,2*

(1.安徽科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,安徽 鳳陽 233100;

2.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)調(diào)控與健康安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 鳳陽 233100)

摘 要:目的:制備血清4型禽腺病毒(FAdV-4)Fiber-1 基因截短蛋白多克隆抗體,為FAdV-4病的診斷、

檢測(cè)及致病機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。方法:對(duì) FAdV-4 的 CH/AHMC/2015 分離株 Fiber-1 基因序列

(MG148335.1:30459-31754)進(jìn)行信號(hào)肽、疏水性和抗原決定簇分析,截取具有較高免疫原性的片段,設(shè)計(jì)

合成特異性引物,以 CH/AHMC/2015分離株基因組 DNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增,獲得截短Fiber-1

(sFiber-1)基因片段,將其連接至原核表達(dá)載體pET-32a,驗(yàn)證后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)中,誘導(dǎo)表

達(dá)sFiber-1蛋白。純化后的蛋白與佐劑乳化后免疫SD大鼠,制備多克隆抗體,并測(cè)定多克隆抗體效價(jià)。

用 Western-blot檢測(cè)抗體免疫原性。結(jié)果:成功構(gòu)建了sFiber-1的原核表達(dá)載體,獲得 FAdV-4 的

sFiber-1重組蛋白,經(jīng)SDS-PAGE鑒定,重組sFiber-1蛋白大小約為52kDa,主要以包涵體形式表達(dá);間

接ELISA法測(cè)得sFiber-1多克隆抗體效價(jià)為1∶213;Westernblot結(jié)果顯示制備的多克隆抗體能特異性

識(shí)別出重組sFiber-1蛋白。結(jié)論:本研究成功表達(dá)了FAdV-4的重組sFiber-1蛋白,制備了具有較高免疫

活性的sFiber-1多克隆抗體,可為FAdV-4的檢測(cè)及診斷奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:血清4型禽腺病毒;Fiber-1 基因;重組蛋白;多克隆抗體

中圖分類號(hào):S855.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1673-8772(2024)02-0025-06

開放科學(xué)(資源服務(wù))標(biāo)識(shí)碼(OSID): DOI:10.19608/j.cnki.1673-8772.2024.0204

Shortenedexpressionandpolyclonalantibodypreparationof

Fiber-1proteinoffowladenovirusserotype4

LUOXinyu1,2, ZHAOLei1,2, CHENYuqing

1,2, MIAOXinyi1,2,

SHIJiaxin1,2, GUYoufang

1,2, LIWenchao1,2, LIUXinchao1,2*

(1.CollegeofAnimalScience,AnhuiScienceandTechnologyUniversity,Fengyang233100,China;

2.AnhuiProvinceKeyLaboratoryofAnimalNutritionRegulationandHealth,Fengyang233100,China)

Abstract:Objective:TopreparethepolyclonalantibodyagainstshortenedFiber-1 (sFiber-1)proteinof

fowladenovirusserotype4(FAdV-4),andtoprovideatoolforthedetectionanddiagnosisofFAdV-4.

Methods:Thesignalpeptide,hydrophobicityandantigendeterminationoftheFibre-1genesequenceof

CH/AHMC/2015isolateofFAdV-4 (MG148335.1:30459-31754)wereanalyzed,andthefragments

withhighimmunogenicitywereinterceptedandthespecificprimersweredesignedandsynthesized.The

DNAofCH/AHMC/2015isolatewasamplifiedtoobtainthesFiber-1fragment,whichwasclonedinto

pET-32a,andtransformedintotheCOMPETENTcellBL21toexpresssFiber-1protein.Thepurified

sFiber-1proteinemulsifiedwithadjuvantwasusedtoimmunizerats.Polyclondantibodywasprepared,

thetiterofpolyclonalantibody wasanalyzedbyELISA,andtheimmunogenicityofsFiber-1 was

analyzedbyWesternblot.Results:ThesFiber-1prokaryoticexpressionvectorwasconstructedtoobtain

recombinantsFiber-1proteinofFAdV-4.SDS-PAGEshowedthatsFiber-1proteinwasmainlyexpressed

ininclusionbodieswithamolecularweightof52kDa.ThetiterofsFiber-1antibodywas1∶213.

Western-blotresultsdisplayedthatrecombinantsFiber-1proteincanberecognizedbytheobtained

antibody.Conclusion:Inthisstudy,recombinantsFiber-1proteinofFAdV-4wassuccessfullyexpressed

andsFiber-1polyclonalantibodywithhighimmuneactivitywasprepared,whichcouldlayafoundation

forthediagnosisanddetectionofFAdV-4.

Keywords:Fowladenovirusserotype4;Fiber-1;Recombinantprotein;Polyclonalantibody

禽腺病毒(Fowladenvirus,FAdV)包括眾多血清型[1]。其中,肝炎-心包積液綜合征是血清4型禽腺

病毒(FAdV-4)感染的主要癥狀,且其具有高致病性和高傳染性的特點(diǎn),3~10周齡的雞、鴨、鵝最為易感,

死亡率可達(dá)10%~80%

[2-3]。種禽和產(chǎn)蛋雞群感染FAdV-4后死亡率一般不超過10%,但可引起產(chǎn)蛋率

下降10%~30%

[4]。

1987年,FAdV-4感染首次報(bào)道于巴基斯坦[4]。隨后該病迅速蔓延至美國(guó)、印度、南非、加拿大、韓國(guó)、

新西蘭、墨西哥、伊拉克、智利、日本、俄羅斯等國(guó)家[5]。2015年之前,我國(guó)偶爾有個(gè)別FAdV-4病例報(bào)道,

當(dāng)時(shí)未引起重視,但自2015年6月以來,山東、安徽、河南、廣東等省份家禽密集養(yǎng)殖地區(qū)呈現(xiàn)FAdV-4暴

發(fā)性流行的趨勢(shì),死亡率達(dá)到30%~70%,給我國(guó)家禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6-10]。

目前,對(duì)FAdV-4病尚無有效治療方法,因此研制FAdV-4病的診斷方法對(duì)于防控該病具有重要意

義。FAdV-4病毒的Fiber-1蛋白位于病毒粒子表面,具有特異性的抗原決定簇,參與病毒增殖、組裝、擴(kuò)

散及宿主特性的選擇[11-12]。本研究截取Fiber-1蛋白抗原性較好的第114~424氨基酸(sFiber-1)片段進(jìn)

行原核表達(dá),并制備sFiber-1多克隆抗體,為FAdV-4檢測(cè)方法的建立及其致病機(jī)制等的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株和載體 FAdV-4的CH/AHMC/2015分離株由家禽疫病防控監(jiān)測(cè)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存,

pET-32a載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要菌株及試劑 大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自通用生物(安徽)股份有限公司;BamHI

和HindIII、T4DNA連接酶、膠回收試劑盒、Taq酶、質(zhì)粒小提試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限

公司;預(yù)染180kDa蛋白 Marker、考馬斯亮藍(lán)染色液、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、PEG20000、HRP

標(biāo)記的羊抗鼠IgG均購自北京索萊寶科技有限公司;病毒 DNA 提取試劑盒購自美國(guó)奧美嘉生物技術(shù)

公司。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 2只成年雌性SD大鼠,購自白湖博源實(shí)驗(yàn)用品公司。

1.2 方法

1.2.1 FAdV-4病毒DNA提取 根據(jù) OMEGAE.Z.N.A.ViralDNAKit說明書,提取FAdV-4安

26 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

徽分離株CH/AHMC/2015的基因組DNA,置于-20℃冰箱備用。

1.2.2 sFiber-1 序列選取及PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì) 根據(jù) GenBank中收錄的CH/AHMC/2015分離株的

Fiber-1 基因全序列(MG148335.1:30459-31754),利用在線軟件SignalP-5.0分析其是否有信號(hào)肽;利用

TMHMM-2.0預(yù)測(cè)序列的跨膜區(qū);利用在線分析工具(http://www.detaibio.com/tools)預(yù)測(cè)Fiber-1的

抗原決定簇。根據(jù)生物信息分析結(jié)果,截取 Fiber-1蛋白抗原性較好的第114~424氨基酸片段,用

PrimerPremier5.0設(shè)計(jì)引物,引物序列為F:5'-CGCGGATCCATGGCCACTAAGCAAGCCAAC-3',R:

5'-CCCAAGCTTTTAGGGGCCCGGAGCATT-3',其中,下劃線處為BamH I和 HindIII酶切位點(diǎn),由

生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3 序列片段擴(kuò)增 以安徽分離株 CH/AHMC/2015的基因組 DNA 為模板,擴(kuò)增sFiber-1 序列。

PCR反應(yīng)的退火溫度為60℃,其余反應(yīng)條件參考說明書。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物,并回收

大小與目的片段一致的片段,置于-20℃保存。

1.2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用BamH Ι和HindIII對(duì)pET-32a載體和目的片段進(jìn)行雙酶切,雙酶切產(chǎn)物

經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,切取與預(yù)期大小一致的片段進(jìn)行膠回收,用T4DNA連接酶連接回收的目的

片段與線性化pET-32a載體,構(gòu)建pET-32a-sFiber-1重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)[13]。陽性克隆經(jīng)

擴(kuò)大培養(yǎng)后,提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定,驗(yàn)證正確的質(zhì)粒進(jìn)一步進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.5 sFiber-1重組蛋白的表達(dá)鑒定及純化 將測(cè)序驗(yàn)證過的菌液接入培養(yǎng)基培養(yǎng),當(dāng)菌液 OD600 值達(dá)

到0.5~0.7時(shí),收集未誘導(dǎo)的菌液后加入IPTG,37℃、170r/min誘導(dǎo)蛋白表達(dá),分別在誘導(dǎo)1.5、3.0、

4.5h后收集菌液,將收集到的菌液離心后留沉淀菌體,加入適量 PBS和5×蛋白上樣緩沖液煮沸

10min,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,分析重組蛋白表達(dá)情況。以最佳條件誘導(dǎo)1L菌液,離心后用PBS重懸菌

體沉淀,在冰上超聲破碎,破碎3s,冷卻4s,每次工作5min,超聲5~6次后離心,收集上清液和沉淀,沉

淀用包涵體溶解液重懸,上清液和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳以確定重組蛋白在菌體中的分布情

況[14]。最后依次用6、4、2、0mol/L尿素對(duì)包涵體蛋白進(jìn)行復(fù)性,用PEG20000濃縮復(fù)性蛋白后,測(cè)定蛋

白濃度,保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 sFiber-1多克隆抗體的制備 免疫前從眼眶后靜脈叢采集大鼠血液,分離血清作為陰性血清對(duì)

照,按1∶1的比例混合乳化弗氏完全佐劑與sFiber-1蛋白(2.3mg/mL),背部皮下多點(diǎn)免疫SD大鼠,每

只免疫500μg蛋白。在一免后的14、21、28d加強(qiáng)免疫,加強(qiáng)免疫時(shí)將sFiber-1蛋白與弗氏不完全佐劑

按1∶1比例充分乳化,每只免疫500μg蛋白,第4次免疫7d后對(duì)大鼠進(jìn)行眼眶采血,血液4℃靜置過夜

后離心分離血清,作為sFiber-1多克隆抗體,保存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 抗體效價(jià)的測(cè)定 ELISA方法測(cè)定大鼠抗FAdV-4sFiber-1蛋白多克隆抗體的效價(jià)。用包被液

稀釋sFiber-1蛋白,包被ELISA板,每孔100ng,4℃過夜。后續(xù)試驗(yàn)的孵育溫度均為37℃,每次孵育后

用PBST洗滌3次。用含5%脫脂奶粉的封閉液進(jìn)行封閉,每孔200μL,封閉1h;將sFiber-1多克隆抗體

按1∶2~1∶218 的梯度進(jìn)行稀釋,作為一抗,孵育1h;加入 HRP標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG(1∶6000稀

釋),孵育1h;加入底物顯色液TMB避光孵育15min,用20% H2SO4 終止反應(yīng),用酶標(biāo)儀讀取OD450 值。

當(dāng)某孔的 OD450 值為后一孔 OD450 值的2倍及以上時(shí),該孔的稀釋倍數(shù)則為多克隆抗體的效價(jià)[15],同時(shí)

設(shè)置大鼠陰性血清對(duì)照試驗(yàn)。

1.2.8 多克隆抗體的 Westernblot鑒定 將重組sFiber-1蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后,轉(zhuǎn)印至PVDF

膜,用5%脫脂奶粉封閉1h后洗滌3次,用sFiber-1多克隆抗體(1∶100)4℃孵育過夜;洗滌后,加入

HRP標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG(1∶3000),37℃孵育1h后洗滌3次,最后加入 DAB顯色液顯色,觀察

結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 sFiber-1序列擴(kuò)增及原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以FAdV-4安徽分離株CH/AHMC/2015的 DNA 為模版,PCR擴(kuò)增sFiber-1 序列后,經(jīng)瓊脂糖凝

第38卷第2期 羅昕雨,等:血清4型禽腺病毒Fiber-1蛋白截短表達(dá)及多克隆抗體制備 27

膠電泳檢測(cè),獲得與目的片段大小933bp一致的條帶(圖1)。將擴(kuò)增到的sFiber-1 序列連接至原核表達(dá)

載體pET-32a,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a-sFiber-1,重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切,獲得933bp大小的目標(biāo)序列和線性

化載體片段(圖2)。測(cè)序驗(yàn)證sFiber-1 的重組載體構(gòu)建正確。

圖1 sFiber-1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

Fig.1 AgarosegelelectrophoresisiofsFiber-1PCRproducts

注:M 為DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000;1為sFiber-1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖2 重組質(zhì)粒pET-32a-sFiber-1雙酶切(BamHΙ和HindIII)鑒定結(jié)果

Fig.2 Resultsofdoubledigestion(BamH ΙandHindIII)

ofrecombinantplasmidpET-32a-sFiber-1

注:M 為DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000;1為pET-32a-sFiber-1雙酶切產(chǎn)物。

2.2 重組蛋白的表達(dá)及可溶性鑒定

使用IPTG誘導(dǎo)含陽性重組表達(dá)質(zhì)粒的菌液,經(jīng)誘導(dǎo)后菌體能夠表達(dá)重組sFiber-1蛋白,大小約為

52kDa,且誘導(dǎo)4.5h后的菌液表達(dá)sFiber-1重組蛋白的效果最佳(圖3)。將IPTG誘導(dǎo)后的菌液超聲破

碎,離心后的沉淀及上清液分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳,如圖4所示,重組蛋白sFiber-1主要以包涵體形式

表達(dá)。

圖3 SDS-PAGE分析pET-32a(+)-sFiber-1的時(shí)相表達(dá)

Fig.3 SDS-PAGEanalysisoftheexpressionof

pET-32a(+)-sFiber-1indifferenttime

注:M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn);1~4分別為pET-32a(+)-sFiber-1

誘導(dǎo)4.5、3、1.5、0h。

圖4 SDS-PAGE分析pET-32a(+)-sFiber-1的蛋白分布情況

Fig.4 SDS-PAGEanalysisoftheexpression

ofpET-32a(+)-sFiber-1inE.coli

注:M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn);1為pET-32a(+)-sFiber-1誘導(dǎo)后的

超聲上清蛋白;2為pET-32a(+)-sFiber-1誘導(dǎo)后的包涵體沉淀。

2.3 多克隆抗體的效價(jià)測(cè)定

以重組蛋白sFiber-1為包被抗原,利用間接ELISA方法測(cè)定sFiber-1多克隆抗體效價(jià),結(jié)果表明本

研究制備的sFiber-1多克隆抗體效價(jià)為213。

2.4 多克隆抗體的 Western-blot分析

Westernblot分析顯示,FAdV-4的sFiber-1重組蛋白能夠被制備的sFiber-1多克隆抗體識(shí)別,條帶

大小為52KDa,與目的條帶一致(圖5),而陰性血清無法識(shí)別sFiber-1重組蛋白。

28 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

圖5 抗sFiber-1多克隆抗體的 Westernblot分析

Fig.5 WesternblotanalysisofthepolyclonalantibodyofsFiber-1

注:M 為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn);1為抗sFiber-1多克隆抗體識(shí)別sFiber-1重組蛋白的 Westernblot分析;2為大鼠陰性空白血清識(shí)別sFiber-1重組蛋白的 Westernblot分析。

3 結(jié)論與討論

近年來,血清4型禽腺病毒已成為一種危害養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的重要病毒,其主要危害3~10周齡的禽類,

給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,但目前仍缺少有效的防治措施,因而進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)和診斷可為該

病的防控提供參考[16]。目前該病毒的主要診斷方法有ELISA檢測(cè)、血清中和試驗(yàn)、分子生物學(xué)檢測(cè)、病

毒分離培養(yǎng)等。上述方法中,病毒分離法檢測(cè)周期相對(duì)較長(zhǎng),步驟復(fù)雜,對(duì)人員要求高,分子生物學(xué)檢測(cè)方

法成本相對(duì)較高,而ELISA檢測(cè)方法具有快速、高效、安全便捷、特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn),更適用于臨

床檢測(cè)[17]。

FAdV-4的衣殼蛋白主要包括 Hexon、Penton、Fiber-1和 Fiber-2等4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白,其中 Hexon、

Fiber-1和Fiber-2在FAdV-4的感染和致病等方面具有重要的作用,但目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于FAdV-4的病原

檢測(cè)及抗體的制備主要針對(duì) Hexon與Fiber-2蛋白[18-19]。謝泉[20]建立了基于 Hexon蛋白的ELISA檢測(cè)

方法,但檢出率不高。Pan等[21]用FAdV-4病毒作為包被抗原,建立了一種 ELISA 方法,但無法特異性

檢測(cè)FAdV-4。

Mase等[22]對(duì)FAdV-4的Fiber-1核苷酸序列進(jìn)行分析,顯示Fiber-1的核苷酸序列可區(qū)分不同的禽

腺病毒血清型。因而,本研究以Fiber-1為目標(biāo)蛋白,通過在線生物信息分析軟件預(yù)測(cè)Fiber-1蛋白的信

號(hào)肽、跨膜區(qū)和抗原決定簇的分布,截取其具有較好免疫原性的片段進(jìn)行表達(dá),成功構(gòu)建了pET-32asFiber-1表達(dá)載體,獲得了重組sFiber-1蛋白,經(jīng)免疫大鼠制備了多克隆抗體,效價(jià)檢測(cè)表明本研究制備

的多克隆抗體效價(jià)較高,當(dāng)稀釋213 倍后仍能識(shí)別抗原。此外,我們進(jìn)一步通過 Westernblot分析sFiber-1

多克隆抗體的免疫原性,結(jié)果顯示,sFiber-1多克隆抗體能夠特異性的識(shí)別重組sFiber-1蛋白,而陰性血

清無法識(shí)別sFiber-1蛋白,進(jìn)一步表明本研究制備的sFiber-1多克隆抗體免疫原性較高。

綜上,本研究制備了重組sFiber-1蛋白和具有較高免疫活性的多克隆抗體,研究結(jié)果可為建立具有較

好特異性的血清4型禽腺病毒的ELISA檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ),為血清4型禽腺病毒病的防控提供參考。

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(責(zé)任編輯:顧文亮)

30 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào),2024,38(2):31-38

JournalofAnhuiScienceandTechnologyUniversity

收稿日期:2023-11-21

基金項(xiàng)目:廣東省重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2023B0202150001);廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金(2021B1515120006);廣東省科技計(jì)劃

項(xiàng)目(2021B1212050021,2023B1212060040);豬禽種業(yè)全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(2023QZ-NK05,2022GZ07);廣州市科技計(jì)

劃項(xiàng)目(2023B04J0137,2023A04J0789);云浮市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2022020202);科技創(chuàng)新戰(zhàn)略專項(xiàng)資金(高水平農(nóng)科院建設(shè))

(202110TD,202122TD,R2020PY-JC001,R2019YJ-YB3010,R2020PY-JG013,R2020QD-048,R2021PY-QY007,R2023PYJG018);廣東省現(xiàn)代 農(nóng) 業(yè) 產(chǎn) 業(yè) 技 術(shù) 體 系 創(chuàng) 新 團(tuán) 隊(duì) 建 設(shè) 專 項(xiàng) (2022KJ119);廣 東 省 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 院 協(xié) 同 創(chuàng) 新 中 心 項(xiàng) 目

(XTXM202202)。

作者簡(jiǎn)介:孫棟(1999-),男,山東威海人,碩士研究生,主要從事動(dòng)物寄生蟲病研究,E-mail:1453120592@qq.com。

通信作者:顧有方,教授,E-mail:youfanggu@163.com。

G型產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定及其

在雞壞死性腸炎發(fā)病模型中的應(yīng)用

孫 棟1,2, 宋忠鋒1,2, 倪君麗1,2, 方肆云3, 王定愛3,

申翰欽3, 嚴(yán)專強(qiáng)3, 戚南山2, 孫銘飛2, 顧有方1*

(1.安徽科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)調(diào)控與健康安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 鳳陽 233100;

2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物衛(wèi)生研究所,廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部禽流感等家禽重大疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510640;

3.溫氏食品集團(tuán)股份有限公司,廣東 新興 527400)

摘 要:目的:探討不同誘導(dǎo)因素對(duì)雞壞死性腸炎(Necroticenteritis,NE)的誘發(fā)效果,以便建立雞壞死

性腸炎的發(fā)病模型。方法:以安徽省某規(guī)?；u場(chǎng)采集的病雞腸道樣品中分離出的 G 型產(chǎn)氣莢膜梭菌

(Clostridiumperfringens,C.perfringens)(CPG-AH5株)為病原菌,分析單獨(dú)或聯(lián)合感染毒害艾美耳

球蟲對(duì)在飼喂高蛋白飼料(添加魚粉)和不飼喂高蛋白飼料條件下,誘發(fā)雞壞死性腸炎的影響。結(jié)果:無誘

導(dǎo)因素時(shí),1.1×109CFU/mL劑量下CPG-AH5株感染可造成腸道損傷(平均病變?cè)u(píng)分為1.5±0.85分);單

一誘導(dǎo)因素(魚粉或球蟲)不能有效促進(jìn)CPG-AH5株的感染,腸道病變與無誘導(dǎo)因素條件下無顯著性提

高(2.0±1.15、2.4±1.08,P>0.05);多個(gè)誘導(dǎo)因素(魚粉和球蟲)聯(lián)合誘導(dǎo)可有效促進(jìn)CPG-AH5株的

感染,與無誘導(dǎo)因素和單一誘導(dǎo)因素相比腸道病變顯著性提高(3.6±0.52,P<0.001)。結(jié)論:魚粉和球

蟲聯(lián)合誘導(dǎo)可顯著促進(jìn)G型產(chǎn)氣莢膜梭菌的感染,提高腸道病變。本研究建立了一種雞壞死性腸炎發(fā)病

模型,有利于對(duì)雞壞死性腸炎發(fā)病機(jī)制的研究,為疫苗及藥物的后續(xù)研發(fā)和篩選評(píng)價(jià)提供了新的技術(shù)

支撐。

關(guān)鍵詞:壞死性腸炎;G型產(chǎn)氣莢膜梭菌;毒害艾美耳球蟲;發(fā)病模型

中圖分類號(hào):S855.1+2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1673-8772(2024)02-0031-08

開放科學(xué)(資源服務(wù))標(biāo)識(shí)碼(OSID): DOI:10.19608/j.cnki.1673-8772.2024.0205

IsolationandidentificationofClostridiumperfringenstypeGandits

applicationinthepathogenesismodelofnecrotizingenteritisinchickens

SUNDong

1,2, SONGZhongfeng

1,2, NIJunli1,2, FANGSiyun3, WANGDingai3,

SHEN Hanqin3, YANZhuanqiang

3, QINanshan2, SUN Mingfei2, GUYoufang

1*

(1.AnhuiProvincialKeyLaboratoryofAnimalNutritionRegulationandHealth,CollegeofAnimalScience,

AnhuiScienceandTechnologyUniversity,Fengyang233100,China;

2.KeyLaboratoryofLivestockDiseasePreventionofGuangdongProvince,

KeyLaboratoryofAvianInfluenzaandOtherMajorPoultryDiseasesPreventionandControl,

MinistryofAgricultureandRuralAffairs,InstituteofAnimalHealth,

GuangdongAcademyofAgriculturalSciences,Guangdong510640,China;

3.WensFoodstuffGroupCo.,Ltd.,Xinxing527400,China)

Abstract:Objective:Thisstudyinvestigatestheinfluenceofvariousinducingfactorsontheinductionof

necroticenteritis(NE)inchickens,aimingtoestablishapathogenesismodelfornecrotizingenteritisin

chickens.Methods:ThisstudyusedClostridiumperfringenstypeG(C.perfringens),specificallythe

CPG-AH5strainisolatedfromtheintestinalsamplesofdiseasedchickenscollectedfromalarge-scale

poultryfarminAnhuiProvince,asthepathogentoanalyzetheeffectsofeithersingleorco-infection

withEimeriaspp.oninducingnecroticenteritisinchickens,underconditionsofbeingfedahighproteindiet(withfishmealadded)andnotbeingfedahigh-proteindiet.Results:Intheabsenceof

inducingfactors,aninoculationwithadoseof1.1×109 CFU/mLoftheCPG-AH5straincancause

intestinaldamage(withanaveragelesionscoreof1.5±0.85).Singleinducingfactors(eitherfishmeal

orcoccidia)donoteffectivelyenhancetheinfectionbytheCPG-AH5strain,andthereisnosignificant

increaseinintestinallesionscomparedtoconditionswithoutinducingfactors(2.0±1.15,2.4±1.08,

P>0.05).However,thecombinationofmultipleinducingfactors(fishmealandcoccidia)effectively

promotestheinfectionbytheCPG-AH5strain,withasignificantincreaseinintestinallesionscompared

toboththeabsenceofinducingfactorsandthepresenceofsingleinducingfactors(3.6±0.52,P<0.001).

Conclusion:Thecombinedinductionoffish mealandcoccidiasignificantlyenhancestheinfectionby

ClostridiumperfringenstypeG,increasingintestinallesions.Thisstudyhasestablishedamodelfor

necroticenteritisinchickens,whichisbeneficialforresearchingthepathogenesisofnecroticenteritisin

chickensandprovidesnewtechnicalsupportforthesubsequentresearchanddevelopment,andselection

evaluationofvaccinesanddrugs.

Keywords:Necroticenteritis;ClostridiumperfringenstypeG;Eimerianecatrix;Diseasemodel

產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種革蘭氏陽性厭氧芽孢桿菌,廣泛分布于土壤和腐爛有機(jī)物的環(huán)境中,是人和多種

動(dòng)物腸道正常菌群中的一員[1]。產(chǎn)氣莢膜梭菌可產(chǎn)生20多種毒素并誘發(fā)特征性壞死性腸炎病變[2]。依

據(jù)主要毒素α、β、ε、ι、CPE和壞死性腸炎B樣(necroticenterocolitisB-like,NetB)編碼基因的攜帶情況將

產(chǎn)氣莢膜梭菌分為 A-G7種毒素。其中G型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生α和 NetB毒素[3]。

雞壞死性腸炎(NecroticEnteritis,NE)是禽類中高發(fā)的腸道疾病,在全球養(yǎng)禽業(yè)普遍發(fā)生,每年造成

約60億美元的經(jīng)濟(jì)損失[4]。中國(guó)在2020年前主要通過在飼料中添加抗生素和抗生素類生長(zhǎng)促進(jìn)劑

(AntimicrobialGrowthPromoter,AGP)的方式來防控壞死性腸炎。但臨床抗生素的過度使用導(dǎo)致耐藥

菌株大量出現(xiàn),世界范圍內(nèi)對(duì)抗生素生長(zhǎng)促進(jìn)劑的限制使用政策出臺(tái),中國(guó)已于2020年在食品動(dòng)物飼料

中推行減抗替抗的策略[5]。G型產(chǎn)氣莢膜梭菌是雞壞死性腸炎的主要致病菌,是近年來發(fā)現(xiàn)的新型毒素

型菌株,國(guó)外流行較廣,但國(guó)內(nèi)對(duì)G型產(chǎn)氣莢膜梭菌的流行情況以及是否能引發(fā)雞壞死性腸炎的研究報(bào)

道較少。因此建立理想的發(fā)病模型將有利于雞壞死性腸炎病理學(xué)機(jī)制和防控技術(shù)的研究。雞壞死性腸炎

的主要誘導(dǎo)因素包括使用高蛋白飼料,如魚粉與玉米飼料(1∶1)和球蟲共感染等[6]。劉少冰等[7]、Mohiuddin等[8]前期研究了雞壞死性腸炎發(fā)病模型的建立,發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氣莢膜梭菌的接種劑量在每只雞大于8.0×

108CFU/mL時(shí),可出現(xiàn)典型壞死性腸炎的病變。本研究針對(duì)雞壞死性腸炎發(fā)病模型的接種劑量和誘導(dǎo)

32 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

因素進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化,詳細(xì)分析1株臨床分離的 G型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株生化特性及其分泌毒素特點(diǎn),并

研究分別聯(lián)合高蛋白飼料或接種毒害艾美耳球蟲等不同誘因后對(duì)于雞壞死性腸炎發(fā)病模型建立的穩(wěn)定

性,研究結(jié)果將為后續(xù)產(chǎn)氣莢膜梭菌性腸炎病疫苗和藥物的研制和篩選提供新的模型基礎(chǔ),同時(shí)為產(chǎn)氣莢

膜梭菌的致病機(jī)制研究提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1日齡未接種疫苗的SPF雛雞,購自新興大華農(nóng)禽蛋有限公司。SPF雛雞飼養(yǎng)在廣

東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所隔離動(dòng)物舍內(nèi),所有試驗(yàn)雞在飼養(yǎng)前,對(duì)環(huán)境進(jìn)行甲醛熏蒸消毒,雞群自

由采食和飲水。

1.1.2 蟲株 毒害艾美耳球蟲檢驗(yàn)株(Eimeirianecatrix 韶關(guān)株,ENSG株)由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物

衛(wèi)生研究所寄生生物學(xué)研究室保存。

1.1.3 病料來源 從安徽省某規(guī)?；u場(chǎng)采集的病雞腸道樣品放在冰盒中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 主要試劑 胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂培養(yǎng)基(TryptoseSulfiteCycloserineAgarBase,TSC)、

液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(FluidThiolglycollateMedium,FTG)、革蘭氏染色液等均購于廣東環(huán)凱微生物科

技有限公司;生化鑒定管購自青島海博生物技術(shù)有限公司;合成的G型產(chǎn)氣莢膜梭菌 NetB毒素陽性質(zhì)粒

(NetB片段與pMD18-Teasy克隆載體連接)參考 Mohiuddin等[8]研究方法,由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)

生研究所寄生生物學(xué)研究室保存。

1.1.5 主要儀器 隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司);2.5L厭氧罐(日本三菱瓦斯化學(xué)株式

會(huì)社);超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司);Quantitativereal-timepolymerasechainreaction(BIORAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理與增菌 本研究從安徽省某規(guī)模化雞場(chǎng)采集的病雞腸道樣品,經(jīng)密封塑料袋保存,在低

溫條件下運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室。參考PraveenKumar等[9]方法,在超凈工作臺(tái)中無菌操作剪取10cm 腸道樣品

于裝有已滅菌處理過的液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基的試管中。將試管置于37℃恒溫培養(yǎng)箱,加入?yún)捬醮?

在厭氧罐中厭氧培養(yǎng)24h。在超凈工作臺(tái)中用接種環(huán)蘸取增菌培養(yǎng)后的菌液,采用平板劃線法在TSC上

進(jìn)行三區(qū)劃線,將培養(yǎng)皿置于37℃恒溫培養(yǎng)箱,加入?yún)捬醮?在厭氧罐中厭氧培養(yǎng)24h。用接種環(huán)挑取

TSC瓊脂培養(yǎng)基上的黑色單菌落置于50μL的滅菌ddH2O中制成菌液,革蘭氏染色后鏡檢觀察其形態(tài)。

1.2.2 分離菌生化特性測(cè)定 在超凈工作臺(tái)中,挑取經(jīng)過純培養(yǎng)的單菌落接種FTG培養(yǎng)基中37℃厭氧

培養(yǎng)24h后,吸取50μL菌液接種到葡萄糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇、蔗糖、山梨醇等不同生化鑒定管中,

37℃恒溫培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng)24~28h,觀察并記錄發(fā)酵情況。

1.2.3 熒光定量PCR鑒定產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素類型 參考陳祥杰等[10]分型鑒定方法,使用熒光定量PCR

對(duì)所分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行毒素分型鑒定[11](擴(kuò)增引物見表1)。在超凈工作臺(tái)中用接種環(huán)挑取 TSC

瓊脂培養(yǎng)基上的單菌落于100μLddH2O中,混勻后取1μL作為熒光定量PCR的模板,剩下全部加入至

FTG培養(yǎng)基中。熒光定量 PCR 反應(yīng)體系為10μL:5μLTBGreenPremix,PrimerF(3μmol/L)和

PrimerR(3μmol/L)各1μL,1μL菌液模板,ddH2O補(bǔ)足至10μL。熒光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性

30s;95℃變性15s;60℃退火和延伸30s,39個(gè)循環(huán);熔解曲線程序?yàn)?5℃10s,65℃5s,95℃5s。

表1 產(chǎn)氣莢膜梭菌熒光定量PCR引物序列

Table1 PrimersequenceoffluorescencequantitativePCRofC.perfringens

毒素基因 上游引物(5'-3') 下游引物(5'-3') 片段大小/bp

plc GATGGAAAAATTGATGGAAC CATGCATGTTCTCTTTTAAAAT 136

cpb TATTCCTAAAAATACAATTTCTC CTGTAAATTTTGTATCCCATGA 212

etx TTAGTTTATCGGATACAGTAAAT ATAATCTTATTTTATTCCTGGTG 242

tpeL GCGATTATGAAACTATTATATGGTA TAACTTCCATTCTTTCTCTATA 168

cpe GATAGCTTAGGAAATATTGATCAAG GTAAATTAAGCTTTTGAGTCCA 217

netB TGAGACTAAGGACGGTTATAATA TTGATATTCAACTATTATTACAGAT 214

第38卷第2期 孫 棟,等:G型產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定及其在雞壞死性腸炎發(fā)病模型中的應(yīng)用 33

1.2.4 菌種的保存 在超凈工作臺(tái)中,將鑒定為G型產(chǎn)氣莢膜梭菌(命名為CPG-AH5)的菌液與滅菌后

5%甘油按1∶1比例混合后,保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 雞壞死性腸炎發(fā)病模型的建立 參照劉少冰等[7]、Mohiuddin等[8]前期關(guān)于雞壞死性腸炎發(fā)病模

型的建立方法,產(chǎn)氣莢膜梭菌的接種劑量為1.1×109CFU/(mL·只),球蟲接種劑量為5.0×103 個(gè)/(mL·

只),高蛋白飼料為魚粉配制成高于40%蛋白含量的小麥基礎(chǔ)飼料(以小麥為基礎(chǔ)的粗蛋白含量18%的飼料

與含68%蛋白的魚粉按1∶1的比例混合)?；诒狙芯壳捌陬A(yù)試驗(yàn)對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌接種劑量的摸索,發(fā)現(xiàn)

CPG-AH5株產(chǎn)氣莢膜梭菌在接種劑量為1.1×109CFU/(mL·只)時(shí)可出現(xiàn)典型壞死性腸炎的病變。鑒于

此,本研究動(dòng)物發(fā)病模型實(shí)驗(yàn)詳細(xì)設(shè)計(jì)如下:1日齡未接種疫苗的SPF雛雞80只,隨機(jī)分為8組,每組

10只。G1~G4 組各試驗(yàn)雞試驗(yàn)期間全程飼喂以小麥為基礎(chǔ)的飼料(粗蛋白含量不低于18%),G5~G8 組

各試驗(yàn)雞于1~7日齡飼喂以小麥為基礎(chǔ)的飼料(粗蛋白含量不低于18%),于8日齡至試驗(yàn)結(jié)束飼喂以

小麥為基礎(chǔ)的高蛋白飼料(以小麥為基礎(chǔ)的粗蛋白含量18%的飼料與含68%蛋白的魚粉按1∶1的比例

混合),均自由采食和飲水。其中G1 與G5 組為產(chǎn)氣莢膜梭菌感染組,各試驗(yàn)雞分別于14~17日齡每天

灌服1次以1.1×109CFU/mL為劑量的CPG-AH5株產(chǎn)氣莢膜梭菌;G2 與G6 組為ENSG株球蟲誘導(dǎo)組,各

試驗(yàn)雞于9日齡灌服1次以5.0×103 個(gè)/mL為劑量的ENSG株孢子化卵囊;G3 與G7 組為CP+EN組,各

試驗(yàn)雞分別于9日齡灌服1次以5.0×103 個(gè)/mL為劑量的ENSG株孢子化卵囊,并于14~17日齡每天

灌服1次以1.1×109CFU/mL為劑量的CPG-AH5株產(chǎn)氣莢膜梭菌;G4 與 G8 組各試驗(yàn)雞為空白對(duì)照

組,各試驗(yàn)雞于9日、14~17日齡各灌服1次1mLPBS。G1~G8 試驗(yàn)各組于20日齡各取10只試驗(yàn)雞

進(jìn)行剖檢取樣,均自由采食和飲水。

1.2.6 攻毒菌株的制備 取凍存的CPG-AH5菌株接種到FTG培養(yǎng)基中,37℃恒溫厭氧培養(yǎng)過夜后,

按1∶100的比例重新接種到FTG培養(yǎng)基中,37℃恒溫厭氧培養(yǎng)12h,分光光度計(jì)測(cè)其 OD600nm 值,采用

10倍等比稀釋法進(jìn)行計(jì)數(shù)檢測(cè),每個(gè)稀釋度取100μL用涂布器分別涂布在 TSC瓊脂培養(yǎng)基上,每個(gè)稀

釋度重復(fù)3次,待菌液吸收后,置于厭氧罐中,37℃恒溫厭氧培養(yǎng)24h進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)(根據(jù)《中國(guó)獸藥典》

2015版,取40~200個(gè)菌落數(shù)為準(zhǔn))。按上述步驟培養(yǎng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所需用量的新鮮菌液,將培養(yǎng)好的菌液經(jīng)

過富集或稀釋制成1.1×109CFU/mL,用于攻菌試驗(yàn)。

1.2.7 剖檢病變觀察與評(píng)分 按照實(shí)驗(yàn)室剖檢程序,無菌操作采集試驗(yàn)雞的十二指腸、空腸、盲腸,用已

滅菌消毒后的剪刀、鑷子將雞的十二指腸、空腸和盲腸剪開,觀察雞腸道剖檢病變,評(píng)分并拍照,病變?cè)u(píng)

分[8](表2)。

表2 病變?cè)u(píng)分

Table2 Lesionscore

病變程度 評(píng)分

無明顯病變 0

腸黏膜充血 1

小灶性壞死或潰瘍(1~5個(gè)病灶) 2

局灶性壞死或潰瘍(6~15個(gè)病灶) 3

局灶性壞死或潰瘍(16個(gè)或更多病灶) 4

注:每只雞腸道各評(píng)分區(qū)最大值為腸道總評(píng)分。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用IBMSPSSStatistics23軟件,對(duì)各個(gè)組處理的評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行雙因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 疑似產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長(zhǎng)狀態(tài)及細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察

疑似產(chǎn)氣莢膜梭菌在TSC培養(yǎng)基上生長(zhǎng)為光滑的黑色單菌落,疑似產(chǎn)氣莢膜梭菌液體增菌實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)

生大量氣泡(圖1)。分離菌株染色鏡檢呈革蘭氏陽性菌,呈現(xiàn)短粗桿狀、兩端鈍圓(圖2)。

生化鑒定結(jié)果顯示疑似產(chǎn)生莢膜梭菌可發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖,可液化明膠,硝酸鹽還原試

驗(yàn)結(jié)果為陽性,不發(fā)酵甘露醇,硫化氫試驗(yàn)結(jié)果為陰性,與產(chǎn)氣莢膜梭菌生化特性相同(表3)。

34 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

圖1 疑似產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離培養(yǎng)

Fig.1 IsolatedculturesuspectedtobeC.perfringens

注:a圖為疑似產(chǎn)氣莢膜梭菌在TSC培養(yǎng)基上的菌落形態(tài);

b圖為FTG培養(yǎng)基上細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)。

圖2 菌株革蘭氏染色

Fig.2 StrainGramstain

表3 分離菌株生化鑒定結(jié)果

Table3 Biochemicalidentificationresultsoftheisolate

生化鑒定管 結(jié)果

葡萄糖 +

蔗糖 +

麥芽糖 +

乳糖 +

明膠 +

硝酸鹽還原 +

甘露醇 -

硫化氫還原 -

注:“+”為陽性;“-”為陰性。

2.2 熒光定量PCR鑒定結(jié)果

參考陳祥杰等的分型鑒定方法,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),對(duì)plc、cpb、etx、tpeL、cpe和netB 毒

素基因進(jìn)行鑒定。根據(jù)G型產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性質(zhì)粒各毒素基因?qū)?yīng)的 Tm 值確定產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基

因Tm值,進(jìn)而確定分離菌株類型,結(jié)果顯示plc毒素基因 Tm 值為77.5℃時(shí)峰值與陽性質(zhì)粒相同,為

CPA陽性(圖3);netB 毒素基因Tm值為77.5℃時(shí)峰值與陽性質(zhì)粒相同,為netB 陽性(圖4);未檢測(cè)到

cpb、etx、cpb和tpeL 毒素基因,均為陰性。陽性質(zhì)粒的netB 和plc毒素基因 Tm 值鑒定結(jié)果為77.5℃

(圖5~6)。在安徽省某規(guī)?；u場(chǎng)分離的病雞腸道樣品中,plc和netB 毒素基因Tm值鑒定為77.5℃,

峰值與陽性質(zhì)粒相同,鑒定為一株G型產(chǎn)氣莢膜梭菌。

圖3 plc毒素基因熒光定量PCR鑒定結(jié)果

Fig.3 Identificationresultsofplctoxingenebyreal-timePCR

注:左圖為分離產(chǎn)氣莢膜梭菌的plc毒素基因擴(kuò)增曲線;右圖為分離產(chǎn)氣莢膜梭菌的plc毒素基因溶解曲線。

圖4 netB 毒素基因熒光定量PCR鑒定結(jié)果

Fig.4 IdentificationofnetBtoxingenebyreal-timePCR

注:左圖為分離產(chǎn)氣莢膜梭菌的netB 毒素基因擴(kuò)增曲線;右圖為分離產(chǎn)氣莢膜梭菌的netB 毒素基因溶解曲線。

第38卷第2期 孫 棟,等:G型產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定及其在雞壞死性腸炎發(fā)病模型中的應(yīng)用 35

圖5 陽性質(zhì)粒的netB 毒素基因熒光定量PCR鑒定結(jié)果

Fig.5 Identificationofthepositiveplasmid'snetBtoxingenebyreal-timePCR

注:左圖為陽性質(zhì)粒的netB 毒素基因擴(kuò)增曲線;右圖為陽性質(zhì)粒的netB 毒素基因溶解曲線。

圖6 陽性質(zhì)粒的plc毒素基因熒光定量PCR鑒定結(jié)果

Fig.6 Identificationofthepositiveplasmid'splctoxingenebyreal-timePCR

注:左圖為陽性質(zhì)粒的plc毒素基因擴(kuò)增曲線;右圖為陽性質(zhì)粒的plc毒素基因溶解曲線。

2.3 剖檢病變結(jié)果

雛雞在灌喂產(chǎn)氣莢膜梭菌后出現(xiàn)羽毛雜亂、活動(dòng)減少、沉郁萎靡、食欲減退和腹瀉等癥狀。剖檢時(shí)發(fā)

現(xiàn),相較于對(duì)照組,病變雞腸黏膜明顯出現(xiàn)充血腫脹以及腸黏膜壞死病變,雞腸壁變薄且充滿氣體,G1 組

各試驗(yàn)雞的壞死性腸炎病變平均評(píng)分為1.5±0.85分,十二指腸病變?nèi)鐖D7所示。

圖7 十二指腸病變

Fig.7 Duodenallesions

注:A為G1;B為G2;C為G3;D為G4;E為G5;F為G6;G為G7;H為G8。

表4顯示,G1 組10只雞中有8只(80%)出現(xiàn)了壞死性腸炎病變;G3 組10只雞中有9只雞(90%)出

現(xiàn)了壞死性腸炎病變;G2 組10只雞中有2只雞(20%)腸道出現(xiàn)病變;G4 組未出現(xiàn)壞死性腸炎病變。與

G4 組相比,單獨(dú)使用CPG-AH5株可以使雞出現(xiàn)壞死性腸炎病變,攻球蟲雖然可以使腸道產(chǎn)生一定的病

變,但未見明顯的腸炎病變。此外,利用球蟲+G型產(chǎn)氣莢膜梭菌的組合可以使腸炎病變率增加。G5 組

10只雞中有8只80%出現(xiàn)了嚴(yán)重的壞死性腸炎病變;G7 組10只雞中有10只雞(100%)出現(xiàn)了嚴(yán)重的壞

死性腸炎病變;G6 組10只雞中有2只雞(20%)出現(xiàn)了壞死性腸炎病變;G8 組未出現(xiàn)壞死性腸炎。通過

魚粉+G型產(chǎn)氣莢膜梭菌的組合誘導(dǎo)腸炎,與單獨(dú)使用 G型產(chǎn)氣莢膜梭菌差異不大。但通過添加魚粉、

球蟲、G型產(chǎn)氣莢膜梭菌多因素感染可以使雞壞死性腸炎病變率增加,病變加重。

2.4 腸道病變記分結(jié)果評(píng)價(jià)

使用IBMSPSSStatistics23軟件,對(duì)20日齡各組病變?cè)u(píng)分進(jìn)行雙因素方差分析(表4和圖8)。結(jié)果

顯示,在G1~G4 組中,G3 組雞的壞死性腸炎病變平均分最高,顯著高于 G1、G2 和 G4 組(P<0.05、

P <0.001和P<0.001);在G5~G8 組中,G7 組雞的壞死性腸炎病變平均分最高,均顯著高于 G5、G6 和

G8 組(P<0.001)。G7 組較G3 組可顯著提高病變程度(0.001<P<0.01)。

36 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

表4 腸道病變?cè)u(píng)分結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

Table4 Intestinallesionscoringresultsstatisticaltable

組別 內(nèi)容 數(shù)量

評(píng)分

0 1 2 3 4

病變?cè)u(píng)分

平均值±標(biāo)準(zhǔn)差

病變率/%

G1 CPG-AH5 10 2 1 7 0 0 1.5±0.85* 80

G2 E 10 8 0 2 0 0 0.4±0.84*** 20

G3 E+CPG-AH5 10 1 0 4 4 1 2.4±1.08 90

G4 Control 10 10 0 0 0 0 0.0±0.0*** 0

G5 F+CPG-AH5 10 2 0 4 4 0 2.0±1.15*** 80

G6 F+E 10 8 0 2 0 0 0.4±0.84*** 20

G7 F+E+CPG-AH5 10 0 0 0 4 6 3.6±0.52 100

G8 F 10 10 0 0 0 0 0±0*** 0

注:F為魚粉;E為Eimeirianecatrix;CPG-AH5為G型產(chǎn)氣莢膜梭菌;G1~G4 組全程飼喂以小麥為基礎(chǔ)的飼料(粗蛋白含量不低于

18%);1~7日齡飼喂以小麥為基礎(chǔ)的飼料(粗蛋白含量不低于18%),8日至試驗(yàn)結(jié)束飼喂以小麥為基礎(chǔ)的高蛋白飼料(小麥為基礎(chǔ)的粗蛋

白的含量為18%與68%蛋白的含量的魚粉,按照1∶1混合);G5~G8 組;G7 組為對(duì)照。* 表示差異顯著(P<0.05);*** 表示差異極顯著

(P<0.001)。

圖8 十二指腸病變?cè)u(píng)分

Fig.8 Duodenallesionsscore

注:Normal為低蛋白飼喂組;protein(H)為高蛋白飼喂組。低蛋白全程飼喂以小麥為基礎(chǔ)的飼料(粗蛋白含量不低于18%);高蛋白

1~7日齡飼喂以小麥為基礎(chǔ)的飼料(粗蛋白含量不低于18%);8日齡至試驗(yàn)結(jié)束飼喂以小麥為基礎(chǔ)的高蛋白飼料(以小麥為基礎(chǔ)的粗

蛋白含量18%的飼料與含68%蛋白的魚粉按1∶1的比例混合)。

病變?cè)u(píng)分分析結(jié)果表明,在飼喂魚粉時(shí),毒害艾美耳球蟲與 G型產(chǎn)氣莢膜梭菌聯(lián)合感染引起的壞死

性腸炎試驗(yàn)組較其他試驗(yàn)組差異顯著。

3 討論與結(jié)論

壞死性腸炎是雞的一種重要傳染病,會(huì)引起雞炎癥性腸道感染,主要是由 A型、C型和 G型產(chǎn)氣莢膜

梭菌引起,有極高的死亡率,對(duì)我國(guó)養(yǎng)雞行業(yè)造成巨大的威脅,對(duì)家禽養(yǎng)殖造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[12]。壞死性

腸炎主要表現(xiàn)為急性或慢性腸毒血癥,一年四季均有發(fā)生,夏季最盛,呈地方性流行,雛雞患病率較高。雞

感染后主要癥狀有抑郁、羽毛皺褶、飼料消耗減少、腹瀉、血便和小腸粘膜出血壞死[13]。因此,通過快速,

有效分離到產(chǎn)氣莢膜梭菌,確定其毒素類型,便于進(jìn)行有效治療,減少經(jīng)濟(jì)損失[14]。

G型產(chǎn)氣莢膜梭菌作為壞死性腸炎的主要致病菌,可用于建立壞死性腸炎模型。Cooper等[14]利用A

型產(chǎn)氣莢膜梭菌建立模型,評(píng)估了模型病例中產(chǎn)氣莢膜梭菌的毒力。Keyburn等[15]利用含 NetB毒素的

野生型親本菌進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)能引起典型的壞死性腸炎。To等[16]利用含 NetB毒素基因的產(chǎn)氣莢膜

梭菌日本分離株成功建立壞死性腸炎模型,首次在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭凶C明 NetB陽性的產(chǎn)氣莢膜梭菌日本分離

株能夠誘發(fā)壞死性腸炎的臨床癥狀和病變。本研究證明,使用G型產(chǎn)氣莢膜梭菌可引起雞的典型壞死性

腸炎病例。

球蟲和魚粉是引發(fā)壞死性腸炎常見的誘導(dǎo)因素。球蟲能造成腸道損傷,破壞腸上皮細(xì)胞,引起血漿蛋

白泄漏,黏蛋白分泌,為產(chǎn)氣提供豐富的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境,從而誘導(dǎo)雞發(fā)生壞死性腸炎[17-18]。龍航宇等[19]使用

4種艾美耳球蟲的單一蟲種與產(chǎn)氣莢膜梭菌共感染來引發(fā)壞死性腸炎,結(jié)果顯示除堆型艾美耳球蟲外,巨

型、毒害以及柔嫩艾美耳球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌的共感染均促進(jìn)壞死性腸炎的發(fā)生。高蛋白飼料的食用可

以改變腸道營(yíng)養(yǎng)環(huán)境以及腸道微生物菌群,促進(jìn)產(chǎn)氣莢膜梭菌的增殖,從而誘導(dǎo)雞產(chǎn)生雞壞死性腸炎[20]。

本次研究中使用毒害艾美耳球蟲、魚粉等誘導(dǎo)因素來引發(fā)腸炎病變。結(jié)果表明相較于單一誘導(dǎo)因素(球蟲

第38卷第2期 孫 棟,等:G型產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定及其在雞壞死性腸炎發(fā)病模型中的應(yīng)用 37

或魚粉),多個(gè)誘導(dǎo)因素(球蟲聯(lián)合魚粉)可顯著提高腸道病變,且病變?cè)u(píng)分最高,所有實(shí)驗(yàn)組壞死性腸炎病

變均以十二指腸多發(fā)?？傮w來說,魚粉、毒素艾美耳球蟲和 G型產(chǎn)氣莢膜梭菌共同聯(lián)合感染可顯著提高

壞死性腸炎病變,能夠成功的建立壞死性腸炎動(dòng)物模型,為后續(xù)的壞死性腸炎藥物的研發(fā)以及致病機(jī)理的

研究提供了參考。

本研究成功從雞腸道樣品中分離獲得一株G型產(chǎn)氣莢膜梭菌(CPG-AH5株)。在無誘導(dǎo)因素的影響

下,CPG-AH5株感染可以造成嚴(yán)重的腸道損傷(平均病變?cè)u(píng)分1.5±0.85分),為壞死性腸炎的發(fā)病機(jī)制

提供了理想的動(dòng)物模型。在該模型中,相較于單一誘導(dǎo)因素(魚粉或球蟲),多個(gè)誘導(dǎo)因素(魚粉和球蟲)能夠

有效促進(jìn)CPG-AH5株的感染,與無誘導(dǎo)因素條件和單一誘導(dǎo)因素條件相比腸道病變顯著提高(P<0.001)。

該動(dòng)物模型將為后續(xù)產(chǎn)氣莢膜梭菌性腸炎病疫苗和藥物的研制和篩選提供穩(wěn)定的模型基礎(chǔ),也為產(chǎn)氣莢

膜梭菌的致病機(jī)制研究提供技術(shù)支撐。

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(責(zé)任編輯:顧文亮)

38 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào),2024,38(2):39-45

JournalofAnhuiScienceandTechnologyUniversity

收稿日期:2023-08-12

基金項(xiàng)目:國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2022YFD2301402-3,2018YFD0300901-2);安徽省科技攻關(guān)重大專項(xiàng)(201903a06020001);農(nóng)業(yè)農(nóng)村部重

點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(BOFA202011)。

作者簡(jiǎn)介:江鑫鑫(1999-),女,安徽安慶人,碩士研究生,主要從事資源利用與植物保護(hù)研究,E-mail:2760179804@qq.com。

通信作者:李孝良,教授,E-mail:lixl@ahstu.edu.cn。

脲甲醛與尿素配比對(duì)盆栽玉米養(yǎng)分吸收

及氮肥利用效率的影響

江鑫鑫1, 吳中原1, 方俊超1, 李孝良1,2*

(1.安徽科技學(xué)院 資源與環(huán)境學(xué)院,安徽 鳳陽 233100;

2.安徽省農(nóng)業(yè)廢棄物肥料化利用與耕地質(zhì)量提升工程研究中心,安徽 鳳陽 233100)

摘 要:目的:基于不同脲甲醛與尿素配比,建立玉米脲甲醛緩釋肥施用技術(shù),提高氮肥利用率。方法:通

過盆栽試驗(yàn),以CK、PK為對(duì)照,設(shè)置 U(100%尿素)、UF20(80%尿素+20%脲甲醛)、UF40(60%尿素+

40%脲甲醛)、UF60(40%尿素+60%脲甲醛)、UF80(20%尿素+80%脲甲醛)、UF(100%脲甲醛)等6個(gè)

尿素與脲甲醛配施比例。結(jié)果:玉米脲甲醛緩釋肥可顯著提高玉米籽粒產(chǎn)量、養(yǎng)分吸收量和氮肥利用率。

盆栽玉米產(chǎn)量以UF20處理最高,較U增產(chǎn)18.75g/株;玉米養(yǎng)分吸收以UF20較高,氮吸收量為1.24g/株,

磷吸收量為0.31g/株,鉀吸收量為0.98g/株,分別較U提高17.94%、1.69%、12.02%;氮肥利用率以UF20

較高,肥料總氮利用率為38.49%,肥料總氮農(nóng)學(xué)利用率為26.36g/g,肥料總氮偏生產(chǎn)力為35.49g/g,氮肥

表觀利用率為57.11%,氮素生理利用率為46.17g/g,較U處理分別顯著提高了18.02%、16.75g/g、16.76g/g、

18.00%、21.61g/g。結(jié)論:綜合考慮玉米養(yǎng)分吸收和養(yǎng)分利用效率,80%尿素+20%脲甲醛(UF20)處理

可顯著提高玉米養(yǎng)分吸收量和肥料利用率,適宜在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用。

關(guān)鍵詞:脲甲醛;尿素;玉米養(yǎng)分吸收;氮肥利用率

中圖分類號(hào):S852.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1673-8772(2024)02-0039-07

開放科學(xué)(資源服務(wù))標(biāo)識(shí)碼(OSID): DOI:10.19608/j.cnki.1673-8772.2024.0206

Effectsofureaformaldehydeandurearatioonnutrient

uptakeandnitrogenuseefficiencyofpottedmaize

JIANGXinxin1, WUZhongyuan1, FANGJunchao1, LIXiaoliang

1,2*

(1.CollegeofResourceandEnvironment,AnhuiScienceandTechnologyUniversity,Fengyang233100,China;

2.AnhuiAgriculturalWasteFertilizerUtilizationandCultivatedLandQualityImprovement

EngineeringResearchCenter,Fengyang233100,China)

Abstract:Objective:Basedondifferentratiosofureaformaldehydeandurea,theapplicationtechnology

ofureaformaldehydeslow-releasefertilizerformaizewasestablishedtoimprovetheutilizationrateof

nitrogenfertilizer.Methods:Throughpotexperiment,withCK,PKascontrol,sixdifferentratioswere

set,andtheexperimentswererepatedthreetimes,includingU (100%urea),UF20(80%urea+20%

urea-formaldehyde),UF40 (60% urea+40% urea-formaldehyde),UF60 (40% urea+60% ureaformaldehyde),UF80(20% urea+80% urea-formaldehyde,UF (100% urea-formaldehyde).Results:

Urea-formaldehydeslow-releasefertilizercansignificantlyincreasemaizeyield,nutrientabsorptionand

nitrogenuseefficiency.TheyieldofpottedmaizewasthehighestinUF20treatment,whichwas18.75g/plant

higherthanthatinUtreatment.ThenutrientabsorptionofUF20washigher,thenitrogenabsorption

was1.24g/plant,thephosphorusabsorptionwas0.31g/plant,andthepotassiumabsorptionwas

0.98g/plant,whichwas17.94%,1.69%and12.02%higherthanthatofUrespectively.Thenitrogen

useefficiencyofUF20washigher,thetotalnitrogenutilizationrateoffertilizerwas38.48%,thetotal

nitrogenagronomicutilizationrateoffertilizerwas26.36%,thetotalnitrogenpartialproductivityof

fertilizerwas35.49g/g,theapparentutilizationrateofnitrogenfertilizerwas57.11%,andthe

physiologicalutilizationrateofnitrogenwas46.17g/g,whichwassignificantlyhigherthanthatofU

treatmentby18.02%,16.75g/g,16.76g/g,18.00%,21.61g/g,respectively.Conclusion:

Consideringthenutrientabsorptionandnutrientuseefficiencyof maize,80% urea+20% urea

formaldehyde(UF20)treatmentcouldsignificantlyimprovethenutrientabsorptionandfertilizer

utilizationrateofmaize,whichwassuitableinactualproduction.

Keywords:Ureaformaldehyde;Urea;Maizenutrientabsorption;Nitrogenuseefficiency

作物高產(chǎn)高效是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的必然要求[1],通過氮肥緩釋技術(shù)實(shí)現(xiàn)氮肥的高效利用是人們關(guān)注的熱

點(diǎn)[2]。脲甲醛在水解與微生物侵襲的雙重作用下緩慢釋放養(yǎng)分,達(dá)到肥料持續(xù)供應(yīng)的目的,是提高氮肥利

用效率的有效途徑[3]。目前,已有的研究表明,脲甲醛緩釋肥能夠有效減少氮肥的損失和浪費(fèi),提高氮肥

利用效率[4-6],持續(xù)提供養(yǎng)分的供應(yīng),滿足作物生育期內(nèi)的氮素需求,進(jìn)而提高作物產(chǎn)量和品質(zhì),同時(shí)減少

施肥量和次數(shù),節(jié)約勞動(dòng)力[7-9],并能夠被土壤微生物完全分解,降低對(duì)土壤和水體的污染風(fēng)險(xiǎn),對(duì)環(huán)境友

好[10-12]。但也發(fā)現(xiàn)脲甲醛緩釋肥制備工藝較為復(fù)雜[13],并且脲甲醛緩釋存在肥效不穩(wěn)定、施肥量控制不

當(dāng)?shù)葐栴},在不同的土壤和氣候條件下的肥效表現(xiàn)還存在差異,需要進(jìn)一步優(yōu)化配方和生產(chǎn)工藝,以適應(yīng)

不同的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境[14]。因此研究脲甲醛和尿素配比對(duì)玉米養(yǎng)分吸收及氮肥利用效率的影響具有重要

意義[15-16]。本研究旨在探究不同脲甲醛和尿素配比對(duì)盆栽玉米的養(yǎng)分吸收和氮肥利用效率的影響。通

過設(shè)置不同配比的脲甲醛和尿素處理組,結(jié)合玉米植株養(yǎng)分含量和氮肥利用效率等指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),以

期為優(yōu)化肥料配比提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概括

盆栽試驗(yàn)于2022年5—8月在安徽科技學(xué)院種植科技園進(jìn)行。該區(qū)域?qū)俦眮啛釒駶?rùn)季風(fēng)氣候,年

均氣溫為14.9℃,年降雨量為904.4mm。盆栽試驗(yàn)土壤為淮河沖積物發(fā)育的石灰性潮壤土,采自鳳陽縣顧

臺(tái)村,pH8.46,有機(jī)質(zhì)14.59g/kg,全氮0.87g/kg,全磷2.92g/kg,全鉀15.52g/kg,硝態(tài)氮2.61mg/kg,速

效磷8.57mg/kg,速效鉀96.55mg/kg,田間持水量35%。

1.2 供試材料

1.2.1 供試作物 鄭單958玉米。

1.2.2 供試肥料 尿素(N,46%)、過磷酸鈣(P2O5,12%)、氯化鉀(K2O,61%)由安徽科技學(xué)院土壤與環(huán)

境中心提供,脲甲醛(N,32.2%)由實(shí)驗(yàn)室制備。脲甲醛(UF)的制備方法[15]:甲醛和尿素按摩爾比1∶1.25

置于500mL燒杯中,攪拌至尿素全部溶解后,添加5% KOH 調(diào)節(jié)pH 至9.0,50℃水浴反應(yīng)2h,得到羥

甲基脲溶液;邊攪拌邊加入1% HCl調(diào)節(jié)pH 至5.0,50℃水浴反應(yīng)2h,形成白色膏狀物,后擠壓造粒,

40 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

60~70℃下烘干,制備得 UF顆粒。按GB/T34763-2017方法檢測(cè),UF中冷水不溶性氮(CWIN)含量

為82.37%,熱水不溶性氮(HWIN)含量為39.14%,活性指數(shù)(AI)為52.48%

[17-18]。

1.3 試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

玉米盆栽試驗(yàn)采用單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),以 CK(不施肥)、PK 為對(duì)照,設(shè)置 U(100%尿素)、UF20

(80%尿素+20%脲甲醛)、UF40(60%尿素+40%脲甲醛)、UF60(40%尿素+60%脲甲醛)、UF80(20%

尿素+80%脲甲醛)、UF(100%脲甲醛)等6個(gè)尿素與脲甲醛配施比例(表1),共8個(gè)處理,3次重復(fù)。

每盆裝11kg干土,氮、磷、鉀肥全部作為基肥,與土壤混勻后一次性施入。水分管理按質(zhì)量法保持田

間持水量為80%。5月16日播種,于苗期、拔節(jié)期、大喇叭口期、成熟期采集植株樣品,殺青,烘干,粉碎過

直徑0.5mm篩,成熟期樣品同時(shí)考種計(jì)產(chǎn)。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

Table1 Testdesignscheme

處理

氮磷鉀用量/(g/kg)

U-N UF-N P2O5 K2O

肥料用量/(g/盆)

尿素 脲甲醛 過磷酸鈣 氯化鉀

CK 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00

PK 0.00 0.00 0.10 0.20 0.00 0.00 9.17 3.60

U 0.20 0.00 0.10 0.20 4.79 0.00 9.17 3.60

UF-20 0.16 0.04 0.10 0.20 3.83 1.37 9.17 3.60

UF-40 0.12 0.08 0.10 0.20 2.87 2.74 9.17 3.60

UF-60 0.08 0.12 0.10 0.20 1.92 4.10 9.17 3.60

UF-80 0.04 0.16 0.10 0.20 0.96 5.47 9.17 3.60

UF 0.00 0.20 0.10 0.20 0.00 6.84 9.17 3.60

1.4 分析測(cè)定方法

植株全氮的測(cè)定采用 H2SO4-H2O2 消煮蒸餾滴定法,全磷測(cè)定采用 H2SO4-H2O2 消煮釩鉬黃比色

法,全鉀測(cè)定采用 H2SO4-H2O2 消煮火焰光度法[19]。

單株玉米植株氮(磷、鉀)積累量(g)=玉米植株干質(zhì)量×植株氮(磷、鉀)含量[20];

單株玉米生育期氮(磷、鉀)吸收量(g)=該生育期玉米氮(磷、鉀)積累量-前一生育期玉米氮(磷、

鉀)積累量;

肥料總氮利用率=(施氮處理植株氮積累量-CK植株氮積累量)/施氮總量×100%;

肥料總氮農(nóng)學(xué)利用率=(施氮處理籽粒產(chǎn)量-CK籽粒產(chǎn)量)/施氮總量[21];

肥料總氮偏生產(chǎn)力=籽粒產(chǎn)量/施氮總量;

氮肥表觀利用率=(施氮處理地上部吸收氮量-CK處理地上部吸收氮量)/施氮量×100%;

氮素生理利用率=(施氮區(qū)產(chǎn)量-CK處理產(chǎn)量)/(施氮區(qū)吸收氮量-CK處理吸收氮量)。

1.5 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)方法

采用 MicrosoftExcel2010和SPSS25進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)分析,采用 Origin2021制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 脲甲醛與尿素不同配比對(duì)玉米產(chǎn)量的影響

脲甲醛緩釋肥可顯著提高玉米產(chǎn)量(圖1)。供試各脲甲醛與尿素配比中,以 UF20產(chǎn)量最高,達(dá)

39.04克/株,較CK增產(chǎn)29.00克/株,較 U增產(chǎn)18.43克/株;其次為 UF60,玉米產(chǎn)量為37.45克/株,較

CK增產(chǎn)27.41克/株,較 U增產(chǎn)16.84克/株。脲甲醛緩釋肥可通過養(yǎng)分緩慢釋放,改善玉米生長(zhǎng)后期養(yǎng)

分供應(yīng),提高玉米產(chǎn)量。

2.2 脲甲醛與尿素不同配比對(duì)玉米氮、磷、鉀含量的影響

施肥可顯著提高玉米各生育期氮素含量(圖2A)。苗期以 U、UF20、UF40相對(duì)較高,分別為35.39、

35.56、35.38mg/g;拔節(jié)期以 UF20相對(duì)較高,達(dá)27.44mg/g;大喇叭口期以 UF20相對(duì)較高,達(dá)22.62mg/g;

成熟期以 UF60相對(duì)較高,達(dá)17.24mg/g。說明玉米脲甲醛緩釋肥通過氮肥的緩慢釋放,實(shí)現(xiàn)調(diào)控玉米

第38卷第2期 江鑫鑫,等:脲甲醛與尿素配比對(duì)盆栽玉米養(yǎng)分吸收及氮肥利用效率的影響 41

生育后期氮素營(yíng)養(yǎng)的效果。

圖1 不同脲甲醛與尿素配比對(duì)玉米產(chǎn)量的影響

Fig.1 Effectsofdifferentratiosofureaformaldehydeandureaonmaizeyield

圖2 不同脲甲醛與尿素配比對(duì)玉米地上部氮(A)、磷(B)、鉀(C)含量的影響

Fig.2 Effectsofdifferentratiosofureaformaldehydeandureaonthecontentsofnitrogen(A),

phosphorus(B)andpotassium (C)intheabovegroundpartofmaize

注:不同小字母表示在0.05水平上差異顯著。下同。

42 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

施肥可顯著提高玉米各生育期磷素含量(圖2B)。玉米苗期、拔節(jié)期、大喇叭口期、成熟期磷含量均以

U處理相對(duì)較高,分別為7.53、6.20、5.06、3.90mg/g。說明脲甲醛緩釋肥對(duì)磷的吸收無促進(jìn)效果。

施肥可顯著提高玉米各生育期鉀素含量(圖2C)。玉米苗期以PK處理相對(duì)較高,達(dá)50.97mg/g;拔

節(jié)期以 UF40、UF60、UF80相對(duì)較高,分別為40.64、40.62、40.34mg/g;大喇叭口期以 UF20相對(duì)較高,

為15.78mg/g;成熟期以 UF80、UF相對(duì)較高,分別為9.79、9.67mg/g。說明脲甲醛緩釋肥對(duì)鉀的吸收

有促進(jìn)作用。

2.3 脲甲醛與尿素不同配比對(duì)玉米氮、磷、鉀積累量的影響

施肥可顯著提高玉米氮積累量(圖3A)。苗期以 U、UF20、UF40相對(duì)較高,分別為0.017、0.016、

0.016g/株;拔節(jié)期以 UF80相對(duì)較高,為0.22g/株;大喇叭口期、成熟期都以 UF20相對(duì)較高,分別為

0.77、1.24g/株。脲甲醛緩釋肥對(duì)玉米氮積累量有促進(jìn)作用。

施肥可顯著提高玉米磷積累量(圖3B)。苗期以 U 相對(duì)較高,為0.004g/株;拔節(jié)期、大喇叭口期以

UF20相對(duì)較高,為0.05、0.16g/株;成熟期以UF20、UF40相對(duì)較高,分別為0.31、0.32g/株。成熟期脲

甲醛緩釋肥對(duì)玉米磷積累量有促進(jìn)作用,但與尿素處理差異不顯著。

施肥可顯著提高玉米鉀積累量(圖3C)。苗期以PK相對(duì)較高,為0.02g/株;拔節(jié)期以 UF80相對(duì)較

高,為0.39g/株;大喇叭口期以 UF20相對(duì)較高,為0.54g/株;成熟期以 UF20、UF80相對(duì)較高,分別為

0.31g/株、0.31g/株。脲甲醛緩釋肥對(duì)玉米鉀積累量有促進(jìn)作用。

圖3 不同脲甲醛與尿素配比對(duì)玉米地上部氮(A)、磷(B)、鉀(C)積累量的影響

Fig.3 Effectsofdifferentratiosofureaformaldehydetoureaontheaccumulationofnitrogen(A),

phosphorus(B)andpotassium (C)intheshootofmaize

第38卷第2期 江鑫鑫,等:脲甲醛與尿素配比對(duì)盆栽玉米養(yǎng)分吸收及氮肥利用效率的影響 43

2.4 脲甲醛與尿素不同配比對(duì)玉米氮肥利用效率的影響

脲甲醛與尿素配施顯著提高了玉米氮素養(yǎng)分利用率(表2)。供試處理中,盆栽玉米肥料總氮利用率

以 UF20、UF80相對(duì)較高,分別為38.49%、36.82%,較U處理提高了18.02%、16.35%,隨脲甲醛替代尿

素比例提高,玉米肥料總氮利用率總體呈先增加后降低趨勢(shì);肥料總氮農(nóng)學(xué)利用率以 UF20相對(duì)較高,達(dá)

26.36g/g,較 U提高了16.75g/g;肥料總氮偏生產(chǎn)力以 UF20相對(duì)較高,較 U處理增加了16.76g/g;肥

料表觀利用率以 UF20、UF80相對(duì)較高,較 U增加了18.00%、16.35%;氮素生理利用率以 UF20、UF60、

UF80相對(duì)較高,分別為46.17、45.86、44.16g/g,較U分別提高了21.61、21.30、19.60g/g。采用脲甲醛

與尿素配施的玉米緩控釋肥技術(shù),可促進(jìn)玉米對(duì)氮素的吸收與利用,提高氮肥利用率,減少氮素?fù)p失[22]。

表2 脲甲醛與尿素不同配比對(duì)玉米氮利用效率的影響

Table2 EffectsofdifferentratiosofureaformaldehydeandureaonNutilizationefficiencyofmaize

處理

氮肥用量/

(g/株)

產(chǎn)量/

(g/株)

N吸收總

量/(g/株)

肥料總氮

利用率/%

肥料總氮農(nóng)學(xué)

利用率/(g/g)

肥料總氮偏

生產(chǎn)力/(g/g)

氮肥表觀

利用率/%

氮素生理

利用率/(g/g)

CK 0.00 10.04±0.26g 0.61±0.01f - - - - -

PK 0.00 12.17±0.31f 0.81±0.01e - - - - -

U 1.10 20.20±0.92e 1.05±0.01d 20.47±0.34d 9.61±0.51e 18.73±0.51e 39.11±0.34d 24.56±1.17c

UF20 1.10 38.95±0.62a 1.24±0.01a 38.49±1.53a 26.36±0.66a 35.49±0.66a 57.11±1.53a 46.17±1.40a

UF40 1.10 34.02±0.30c 1.21±0.01bc 35.82±1.26bc 21.85±0.30c 30.98±0.30c 54.48±1.26bc 40.13±1.48b

UF60 1.10 37.22±0.94b 1.21±0.02bc 35.70±2.23bc 24.92±0.92b 34.04±0.92b 54.34±2.23bc 45.86±1.05a

UF80 1.10 36.92±0.24b 1.22±0.01ab 36.82±0.31ab 24.49±0.24b 33.61±0.24b 55.46±0.31ab 44.16±0.67a

UF 1.10 32.61±0.47d 1.19±0.041c 33.86±1.16c 20.72±0.18d 29.85±0.24d 52.50±1.16c 39.47±0.90b

3 結(jié)論與討論

本研究表明,脲甲醛與尿素配施可顯著提高玉米產(chǎn)量,其中 UF20、UF60、UF80的玉米產(chǎn)量相對(duì)較

高,分別較U增產(chǎn)18.75、17.02、16.72g/株。倪露等[4]、李前等[23]研究也表明,不同種類的緩釋氮肥和不

同組分的脲甲醛緩釋肥可以滿足玉米整個(gè)生育期的養(yǎng)分需求,從而在不同程度上提高玉米產(chǎn)量。徐峰

等[24]研究發(fā)現(xiàn),脲甲醛肥料可顯著提高玉米產(chǎn)量、穗粒數(shù)、千粒重。

尿素作為基肥和追肥可以為作物快速提供豐富的氮素,但其供肥效果受到土壤、氣候和其他因素的影

響,在中后期,容易導(dǎo)致氮素供應(yīng)不足,進(jìn)而影響植株對(duì)氮素的積累[25]。脲甲醛緩釋肥可以減緩氮素釋

放、轉(zhuǎn)化和分解速度,延長(zhǎng)氮肥肥效,更有利于作物對(duì)氮肥的吸收利用[26]。施用脲甲醛可以改善土壤團(tuán)聚

體結(jié)構(gòu)、增加其穩(wěn)定性和提高腐殖酸含量,進(jìn)而促進(jìn)玉米對(duì)氮素的吸收和利用[22,27],提高氮肥利用率。本

研究還發(fā)現(xiàn),玉米脲甲醛緩釋肥可以改善玉米生育后期氮、鉀的含量和養(yǎng)分吸收量,提高氮、鉀養(yǎng)分積累。

供試處理中 UF20處理玉米成熟期地上部植株 N、P、K 養(yǎng)分積累量較 U 處理提高了17.94%、1.69%、

12.02%;肥料總氮利用率、肥料總氮農(nóng)學(xué)利用率、肥料總氮偏生產(chǎn)力、氮肥表觀利用率、氮素生理利用率分

別提高了18.02%、16.75g/g、16.76g/g、18.00%、21.61g/g。

盆栽試驗(yàn)表明,通過脲甲醛與尿素配施的玉米緩釋肥技術(shù)可以降低氮肥施用量,促進(jìn)玉米養(yǎng)分的吸

收,改善玉米全生育期氮素營(yíng)養(yǎng),提高氮肥利用率。供試各處理中,UF20可顯著提高玉米產(chǎn)量,改善玉米

氮、鉀營(yíng)養(yǎng),提高玉米氮素利用率,適宜在玉米生產(chǎn)中應(yīng)用。

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(責(zé)任編輯:顧文亮)

第38卷第2期 江鑫鑫,等:脲甲醛與尿素配比對(duì)盆栽玉米養(yǎng)分吸收及氮肥利用效率的影響 45