吉林農(nóng)業(yè)大學學報 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

were significantly enriched in 10 and 14 KEGG metabolic pathways, respectively; Transcription fac?

tors predicted that 20 transcription factors in 13 families of NC95 changed significantly, and 38 tran?

scription factors in 20 families of SY04-3 changed significantly. This study provides reference for

the study on the early response of tobacco to potato Y virus infection mechanism.

Key words：tobacco； potato virus Y； transcriptome； differentially expressed genes

馬鈴薯 Y 病毒屬（Potyvirus）是最大的植物病

毒屬，其代表種為馬鈴薯 Y 病毒（Potato virus Y，

PVY），是侵染植物的 RNA 病毒［1-2］

。PVY 通過蚜

蟲和汁液摩擦等非持久性方式侵染馬鈴薯、辣椒、

番茄和煙草等茄科作物［3-4］

。在我國煙草種植區(qū)域

流行的代表性PVY毒株至少有4種，分別是脈壞死

株系（PVYN

）、莖壞死株系（PVYNS）、點刻條紋株系

（PVYC

）和普通株系（PVYO

）［5-6］

。當煙草感染 PVY

后，葉脈呈暗褐色，葉片出現(xiàn)花葉型的斑駁，病葉烤

曬后香氣和色澤較差，煙堿降低，硝酸鹽和總氮含量

上升，煙葉品質(zhì)明顯降低，帶來巨大的經(jīng)濟損失［7］

。

近年來，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在生物學研究領(lǐng)域

已經(jīng)廣泛應用，通過轉(zhuǎn)錄組測序可以快速、全面、

準確地了解植物基因總體表達情況，有利于挖掘

與防御、信號轉(zhuǎn)導和次生代謝等重要的基因［8-9］

。

雷陽等［10］

對辣椒苗期抗感黃瓜花葉病毒病比較

轉(zhuǎn)錄組學分析發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)代謝、防御反應、激素

調(diào)節(jié)等通路共同在辣椒體內(nèi)對黃瓜花葉病毒進行

免疫；Liu 等［11］

利用轉(zhuǎn)錄組分析在藍光下控制玉

米氣孔發(fā)育的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡，確定了 6 個在 HY5 模塊

和 MAPK級聯(lián)調(diào)控中起作用的基因；Kong等［12］

對

甜椒冷脅迫后進行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選出許多參與生

物膜穩(wěn)定性、脫水和滲透調(diào)節(jié)以及植物激素信號轉(zhuǎn)

導的差異表達基因，并鑒定出41個冷誘導轉(zhuǎn)錄因子

家族的250個轉(zhuǎn)錄因子。本研究通過對PVY高感

（NC95）和高抗（SY04-3）品種進行接種處理，利用

轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)深入了解煙草對 PVY 侵染的早

期響應的轉(zhuǎn)錄組信息，為進一步揭示煙草抗 PVY

的動態(tài)過程和培育抗病品種提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1. 1　試驗材料

供試材料為 PVY高感品種 NC95與高抗品種

SY04-3。PVY 病毒葉由延邊朝鮮族自治州農(nóng)業(yè)

科學院煙草研究所提供，將病葉剪碎放入冰上預

冷的研缽中，加入磷酸緩沖液后研磨至漿液，用無

菌紗布過濾掉殘渣，制成PVY病毒液，放在4 ℃冰

箱備用。

1. 2　方法

1. 2. 1 材料處理及轉(zhuǎn)錄組測序 使用質(zhì)量分數(shù)

為0.1％的AgNO3溶液對煙草種子進行消毒，用清

水浸洗 7~8 次。完成后將種子均勻撒在育苗盤

中，在延邊大學農(nóng)學院溫室進行育苗，待煙苗長至

三葉期移栽至營養(yǎng)缽中。煙株長至 5~6 片葉時，

選取長勢一致的煙株進行人工接種 PVY：用石英

砂在葉片背面劃出傷口，用棉簽蘸取病毒液涂抹

在傷口處，對照用清水代替病毒液。12 h 后對接

種和未接種的煙株進行取樣，將取下的葉片迅速

包好放入液氮中，置于-70 ℃超低溫冰箱冷藏，各

樣品均取3次重復。所有樣品由北京百邁克生物

科技有限公司進行轉(zhuǎn)錄組檢測。

1. 2. 2 測序數(shù)據(jù)的分析 為保證后續(xù)數(shù)據(jù)分析

的準確性，在進行數(shù)據(jù)分析前篩選出高質(zhì)量的

Reads。通過去除含有接頭的 Reads 和低質(zhì)量的

Reads［包括去除w（N）>10%的Reads和質(zhì)量值Q≤

10 的堿基數(shù)占整條 Read50% 以上的 Reads 等］對

原始數(shù)據(jù)進行過濾，得到高質(zhì)量的 Clean reads 并

進行后續(xù)分析［13］

。

1. 2. 3 差異基因的篩選與生物信息學分析 采

用DESeq軟件對對照與接種處理的樣本進行差異

表達基因的篩選，將差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）≥

1.5，P值≤0.01作為篩選標準。

將抗感2個品種的樣品組間所選出的差異表

達基因在北京百邁客生物科技有限公司百邁客云

平臺進行 GO 功能注釋和 KEGG Pathway 顯著性

富集分析［14］

。

根據(jù)差異表達基因與植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫

4.0（http：∥planttfdb. cbi. pku. edu. cn/）進 行 對

比，閾值設(shè)置為 E 值=1×10?5

，篩選差異表達基因

的轉(zhuǎn)錄因子分類及數(shù)目。

1. 2. 4 差異基因的 qRT-PCR 的驗證 為驗證

轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的準確性，隨機挑選4個基因，進

行 qRT-PCR 驗證，利用 Primer 6 軟件設(shè)計擴增引

物（表1）。各處理的樣品總RNA由北京百邁客生

220

王平，等：2個抗感煙草品種響應馬鈴薯Y病毒早期脅迫的轉(zhuǎn)錄組分析

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 Journal of Jilin Agricultural University

物科技有限公司提供，采用天根生化科技（北京）

有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒并按照說明書進行

反轉(zhuǎn)錄操作，獲得的 cDNA 保存在-20 ℃。將獲

得 cDNA 作為模板進行 qRT-PCR 反應，每個樣

品進行 3 次重復。qRT-PCR 反應體系為 20 μL

（2×miRcute Plus miRNA PreMix 10 μL，cDNA

2 μL，上游引物0.6 μL，下游引物0.6 μL，50×ROX

Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 6.4 μL），反應程序為

95 ℃ 3 min；95 ℃變性 5 s，60 ℃退火 10 s，72 ℃延

伸 20 s，40 個循環(huán)；于 72 ℃條件下讀取熒光值。

以煙草 Actin 基因為內(nèi)參基因，通過 2-ΔΔCT方法計

算相對表達量。

2　結(jié)果與分析

2. 1　測序質(zhì)量分析

采用高通量測序平臺，對處理組及對照組

的樣品進行了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)統(tǒng)計和質(zhì)量檢測，結(jié)

果見表 2。由表 2 可知，去除含有接頭的 Reads、

w（N）>10%的Reads和質(zhì)量值Q≤10的堿基數(shù)占整

條 Read 50%以上的 Reads，在 12個樣品中共獲得

了 28 563 278~20 803 749 的 Clean reads。就每個

樣品的 GC 含量來看，總體偏差很小，呈隨機分

布，范圍為42.71%~43.51%，其中A-12-2的GC含

量最多，為 43.51%，B1-12-3 的 GC 含量最少，為

42.71%。通過質(zhì)量控制參數(shù)Q30的數(shù)值大小可以

判斷測序質(zhì)量，當 Q30≥80％時，測序質(zhì)量可靠。

本研究的檢測結(jié)果顯示Q30的數(shù)值均>93%，表明

轉(zhuǎn)錄組測序具有較高的可信度，為后續(xù)分析結(jié)果

的準確性提供了保證。

2. 2　差異表達基因統(tǒng)計分析

對 NC95 和 SY04-3 接種 PVY 后 12 h 和未接

種的基因表達進行差異分析見表 3，結(jié)果表明，

NC95 接種 PVY 12 h 后，差異表達基因數(shù)量達到

了 317個，其中上調(diào)表達基因 206個，下調(diào)表達基

因 111 個；SY04-3 接種 12 h 后，上調(diào)表達基因

1 001 個，下調(diào)表達基因 423 個，差異表達基因共

有 1 424 個。接種后 SY04-3 的差異基因表達數(shù)

量遠多于 NC95。由差異表達基因韋恩圖（圖 1）

可見，2 個品種接種 12 h 后共有的差異基因為

75 個 ，NC95 單 獨 表 達 的 差 異 基 因 數(shù) 為 242，

SY04-3 單獨表達的差異基因數(shù)為 1 349。NC95

單獨表達的差異基因數(shù)少于 SY04-3 單獨表達的

差異基因。

表1 qRT-PCR反應引物

Table 1 Primers for qRT-PCR

引物名稱

ChiB-F

ChiB-R

Pti6-F

Pti6-R

FRK1-F

FRK1-R

WRKY33-F

WRKY33-R

Actin-F

Actin-R

序列（5′-3′）

CCGCAGAATGTTGGGTGGGATTTG

CTAGTCCGCCATTGCTGCATTGA

GCTCGGCGTCACATACTTCACACT

CATCAGCGCCAACTCAAGGTCCAT

CCAGGATGATGAAGGTGTTCTGCCG

TGCCACAAACTTCTCCACCCATTCG

TCAGCACCAGGAAGCAGAACAGTA

GGCATTGGCACCATTGTTGTAAGTA

AAGGGATGCGAGGATGGA

CAAGGAAATCACCGCTTTGG

表2 各樣品測序質(zhì)量

Table 2 Sequencing quality of each sample

樣品

A-12-1

A-12-2

A-12-3

A1

-12-1

A1

-12-2

A1

-12-3

B-12-1

B-12-2

B-12-3

B1

-12-1

B1

-12-2

B1

-12-3

總Reads 數(shù)量

46 351 196

57 126 556

46 275 322

43 620 520

41 607 498

54 837 710

48 801 596

42 719 062

42 513 046

44 928 036

43 176 130

42 733 260

有效讀序

23 175 598

28 563 278

23 137 661

21 810 260

20 803 749

27 418 855

24 400 798

21 359 531

21 256 523

22 464 018

21 588 065

21 366 630

多重比對

1 368 686 (2.95%)

2 154 578 (3.77%)

1 619 044 (3.50%)

1 548 345 (3.55%)

1 381 355 (3.32%)

2 441 272 (4.45%)

1 670 431 (3.42%)

2 938 916 (6.88%)

1 365 289 (3.21%)

1 749 560 (3.89%)

1 692 071 (3.92%)

1 414 396 (3.31%)

唯一比對

43 358 463 (93.54%)

52 823 512 (92.47%)

42 928 107 (92.77%)

40 598 927 (93.07%)

38 752 804 (93.14%)

50 415 221 (91.94%)

44 897 867 (92.00%)

37 804 305 (88.50%)

39 496 648 (92.90%)

41 504 014 (92.38%)

40 016 166 (92.68%)

38 857 259 (90.93%)

Q30含量/%

93.95

94.19

94.20

94.79

94.12

94.30

95.31

96.36

93.04

94.70

94.57

94.20

GC 含量/%

43.10

43.51

43.34

43.24

43.33

43.35

42.96

43.21

42.84

43.25

43.19

42.71

注：A. NC95接種處理12 h；A1

. NC95未接種處理12 h；B. SY04-3接種處理12 h；B1

. SY04-3未接種處理12 h。下表同

221

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2. 3　差異表達基因的GO功能注釋分析

表 4 為 NC95 與 SY04-3 接種后 12 h 下調(diào) GO

分類。由表 4 可知，NC95（A）和 SY04-3（B）上調(diào)

差異表達基因 GO注釋分類，在生物學過程中，均

注釋到細胞轉(zhuǎn)化最多，分別為 116個和 628個；在

細胞組分中，均注釋到細胞（細胞和細胞組分最多

的，分別為120個和679個；在分子功能中，注釋到最

多的均為與蛋白結(jié)合有關(guān)，分別為104個和479個）。

總體來看SY04-3 比NC95注釋到的GO條目略多，

且遠多于NC95的上調(diào)差異表達基因數(shù)目。

NC95 和 SY04-3 下調(diào)差異表達基因 GO 注釋

分類顯示，在生物學過程中，NC95 注釋到代謝過

程最多，為41個，而SY04-3注釋到細胞轉(zhuǎn)化最多，

為140個；在細胞組分中，2品種注釋到細胞和細胞

組分均最多，但 SY04-3 比 NC95 的差異表達基因

數(shù)多 99個；在分子功能中，NC95與蛋白結(jié)合有關(guān)

和催化活性注釋均最多，為38個，但SY04-3 只有

注釋到催化活性最多，為158個。NC95比SY04-3

注釋的下調(diào)差異表達基因數(shù)目少，2個品種注釋到

上調(diào)差異表達基因要多于下調(diào)差異表達基因。

表4 NC95與SY04-3接種后12 h下調(diào) GO分類

Table 4 Down regulation of GO classification 12 h after inoculation of NC95 and SY04-3

生物過程學

細胞進程

代謝過程

單生物過程

生物調(diào)節(jié)

應激反應

細胞成分組織或生物發(fā)生

定位

信號轉(zhuǎn)導

發(fā)展進程

有機體多細胞進程

繁殖進程

繁殖

有機體進程

生長

免疫系統(tǒng)進程

節(jié)律進程

轉(zhuǎn)運

行為

解毒

生物黏附

生物相

22 090

20 163

14 608

7 640

5 455

5 028

4 175

1 966

1 714

1 362

853

692

653

208

186

64

52

26

17

13

1

116

112

58

34

80

7

2

17

9

9

7

2

1

2

0

7

0

0

1

0

0

628

616

212

100

79

213

35

17

20

15

9

11

3

1

1

1

0

0

0

0

0

35

41

21

13

9

2

3

1

4

3

0

0

1

0

0

0

0

0

0

0

0

140

116

120

50

40

22

35

14

7

8

6

4

8

1

3

0

0

0

0

0

0

GO功能

名稱 GO功能分類 所有基因數(shù)

上調(diào)

A差異

基因數(shù)

B差異

基因數(shù)

下調(diào)

A差異

基因數(shù)

B差異

基因數(shù)

表3 差異基因表達數(shù)

Table 3 Number of differential gene expression

分組

A1

-12，A-12

B1

-12，B-12

差異基因總數(shù)

317

1 424

上調(diào)基因數(shù)

206

1 001

下調(diào)基因數(shù)

111

423

圖1 NC95與SY04-3差異表達基因韋恩圖

Fig. 1 Venn diagram of differentially expressed genes

of NC95 and SY04-3

222

王平，等：2個抗感煙草品種響應馬鈴薯Y病毒早期脅迫的轉(zhuǎn)錄組分析

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 Journal of Jilin Agricultural University

細胞組分

分子功能

細胞

細胞成分

細胞器

膜

膜成分

細胞器成分

高分子復合物

膜關(guān)閉內(nèi)腔

胞外區(qū)域

胞外區(qū)域成分

細胞連接

共質(zhì)體

其他有機體

其他有機體成分

超級分子絡合物

類核

突觸

突觸成分

結(jié)合

催化活性

轉(zhuǎn)運活性

結(jié)合核酸轉(zhuǎn)錄活性

結(jié)構(gòu)分子活性

分子轉(zhuǎn)導活性

信號轉(zhuǎn)導活性

抗氧化活性

電子載體活性

結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄活性

營養(yǎng)儲藏活性

分子功能調(diào)節(jié)劑

蛋白質(zhì)標記物

轉(zhuǎn)化調(diào)節(jié)活性

金屬伴侶活性

24 544

24 544

17 883

15 050

12 924

6 740

6 268

1 780

1 469

534

502

481

373

373

57

37

13

9

25 150

21 143

2 869

2 032

1 043

515

515

379

375

284

106

68

52

13

7

120

120

101

78

64

59

51

5

4

3

2

2

3

3

0

3

0

0

104

69

6

2

2

1

1

8

0

1

0

0

0

0

0

679

679

602

151

116

382

442

58

38

25

9

9

24

24

1

6

0

0

479

251

29

8

277

6

6

6

7

2

0

2

7

3

0

37

37

31

19

19

9

3

0

4

2

1

1

2

2

0

0

0

0

38

38

8

3

0

0

0

0

2

2

0

0

0

0

0

136

136

67

96

89

29

23

9

7

0

2

2

0

0

0

0

0

0

141

158

37

5

2

3

3

4

3

4

1

0

0

0

0

Continued table 4

GO功能

名稱 GO功能分類 所有基因數(shù)

上調(diào)

A差異

基因數(shù)

B差異

基因數(shù)

下調(diào)

A差異

基因數(shù)

B差異

基因數(shù)

2. 4　差異表達基因的KEGG通路分析

2. 4. 1 上調(diào)差異表達基因的KEGG通路分析 對

NC95和 SY04-3上調(diào)差異基因進行 KEGG通路分

析，結(jié)果見圖 2。由圖 2 可見，NC95 和 SY04-3 上

調(diào)差異基因富集到20條主要代謝通路，顯著富集

到 7 條主要的代謝通路（q 值≤ 0.05），NC95 與

SY04-3 富集因子最多的途徑均為光合-天線

蛋白。

NC95富集上調(diào)差異基因最多的途徑為光合天線蛋白，其次是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工途徑。

SY04-3在核糖體途徑富集上調(diào)差異基因最多，其

次是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工途徑。

續(xù)表4

223

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 2024 年 4 月

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2. 4. 2 下調(diào)差異表達基因的KEGG通路分析 對

NC95和 SY04-3下調(diào)差異表達基因進行 KEGG通

路分析，結(jié)果見圖 3。由圖 3可見，NC95和 SY04-

3下調(diào)差異表達基因富集到 20條主要代謝通路，

其中 NC95 顯著富集到 10 條主要代謝通路（q≤

0.05），在組氨酸代謝途徑富集因子最多；SY04-3

顯著富集到14條主要代謝通路（q≤ 0.05），富集因

子最多的途徑為光合有機物的碳固定。

NC95 富集下調(diào)差異基因最多的途徑為光合

作用和氧化磷酸化途徑，SY04-3富集差異基因最

多的途徑為碳代謝。

接種 PVY 后，NC95 和 SY04-3 代謝途徑中，

上調(diào)基因富集的代謝途徑高于下調(diào)基因，由此可

見，煙草受到 PVY 脅迫后，生理響應過程主要與

上調(diào)相關(guān)基因表達有關(guān)。

2. 5　煙草PVY響應的轉(zhuǎn)錄因子分析

通過煙草接種 PVY后的轉(zhuǎn)錄因子表達變化，

對差異表達基因中的轉(zhuǎn)錄因子進行分析。接種

PVY 后，NC95 有 20 個轉(zhuǎn)錄因子的表達發(fā)生了改

變，SY04-3 有 38 個轉(zhuǎn)錄因子的表達發(fā)生改變。

NC95 的轉(zhuǎn)錄因子屬于 13 個家族，其中數(shù)量最多

的為 Others、Pseudo ARR-B和TAZ，各有3個轉(zhuǎn)錄

因子，其次為 Jumonji，有 2 個轉(zhuǎn)錄因子。SY04-3

的轉(zhuǎn)錄因子屬于20個家族，Others和SNF2的數(shù)量

最多，有 4 個轉(zhuǎn)錄因子，Mterf 的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量次

之，有3個（圖4）。

注：圓點的位置代表代謝途徑，圓點的大小代表基因的數(shù)量。

下圖同

圖2 NC95和SY04-3上調(diào)差異基因KEGG通路

Fig. 2 KEGG pathway for up-regulating differential

genes of NC95 and SY04-3

圖3 NC95和SY04-3下調(diào)差異基因KEGG通路

Fig. 3 KEGG pathway for down-regulating differen?

tial genes of NC95 and SY04-3

224

王平，等：2個抗感煙草品種響應馬鈴薯Y病毒早期脅迫的轉(zhuǎn)錄組分析

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 Journal of Jilin Agricultural University

2. 6 qRT-PCR 驗證

隨機挑選 ChiB（堿性內(nèi)切幾丁質(zhì)酶 B）、Pit6

（致病相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄激活因子）、FPK1（衰老誘

導受體樣絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶）和 WRKY33

（WRKY 轉(zhuǎn) 錄 因 子 33）這 4 個 基 因 進 行 qRTPCR 擴增，并與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行對比，結(jié)果見圖5。

由圖 5 可見，接種后 NC95 顯著高于 SY04-3 的

ChiB 相對表達量（P<0.05），而 SY04-3 顯著高

于 NC95 的 Pti6、FPK1 和 WRKY33 的相對表達量

（P<0.05），4 個基因均與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表達趨勢一

致，說明此轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠性較高。

3　討論與結(jié)論

近年來，有關(guān)煙草抗 PVY 功能基因克隆、遺

傳多樣性和作用機理等方面的分子生物學研究正

在逐步開展，但是有關(guān)煙草抗 PVY轉(zhuǎn)錄組方面的

研究鮮有報道。本試驗對2品種煙草接種后產(chǎn)生

的差異基因數(shù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示：與對照相

比，感病品種 NC95 中差異表達基因有 317 個，而

抗病品種 SY04-3 有 1 424 個，2 個煙草品種中表

達情況差異較大正說明早期接種 PVY后，抗性品

種通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達量響應 PVY 病毒的

侵染。

從差異表達基因的GO功能富集方面看，2個

品種煙草接種 PVY 12 h 后在生物學過程中以細

胞轉(zhuǎn)化差異表達基因居多；在細胞組分中以注釋

到細胞和細胞組分差異表達基因居多；在分子功

能中以與蛋白結(jié)合有關(guān)的差異表達基因居多，

KEGG 代謝途徑分析結(jié)果顯示，NC95 在光合-天

線蛋白途徑差異表達基因最多，SY04-3差異表達

基因在核糖體途徑最多，說明主要存在與蛋白質(zhì)、

核糖體有關(guān)的途徑。同時也說明這2條通路可能

是 PVY影響煙草生長的關(guān)鍵，推斷這些基因可能

是影響煙草早期 PVY 脅迫調(diào)控的關(guān)鍵因子。從

富集差異表達基因的代謝途徑數(shù)量角度可以看

出，接種 PVY 后，煙草代謝途徑上調(diào)遠高于下調(diào)

圖4　煙草PVY響應轉(zhuǎn)錄因子

Fig. 4 Tobacco PVY virus response transcription factor

注：“*”表示 0.05 水平差異顯著

圖5 RNA測序與qRT-PCR基因相對表達量比較

Fig. 5 RNA sequencing and comparison of relative

expression levels of qRT-PCR genes

225

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

差異基因，從某種程度上說明，煙草受 PVY 脅迫

后，生理響應過程主要以上調(diào)相關(guān)基因的表達為

主。這與謝冰等［15］

、魯琳等［16］

利用轉(zhuǎn)錄組測序研

究煙草在生物脅迫以及非生物脅迫的逆境條件下

所得出的結(jié)論有相似之處。

PVY 是煙草在生長過程中易受到的主要生

物脅迫之一。煙株感染 PVY后，煙株體內(nèi)會發(fā)生

一系列生理生化反應，來抵御 PVY對植物生長的

影響［17］

。轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控基因的表達，調(diào)動相

關(guān)代謝途徑產(chǎn)生級聯(lián)反應，使煙株提高對病毒的

適應力［18-21］

。對差異表達基因進行轉(zhuǎn)錄因子預測

分析，結(jié)果表明，NC95受早期 PVY 脅迫調(diào)控的轉(zhuǎn)

錄因子家族主要有 MYB-related、bZIP、bHLH 等，

SY04-3 的轉(zhuǎn)錄因子家族主要有 AP2/ERF-ERF、

WRKY、bHLH等。李明［22］

研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)ATMYB12

基因的煙草植株均少于對照野生型煙草植株上寄

生的蚜蟲和煙粉虱的數(shù)量，而蚜蟲是傳播 PVY的

重要媒介。煙草 bZIP 轉(zhuǎn)錄因子 TGA1a 是第一個

被證明與 as-1 結(jié)合的重組蛋白，NPR1 是植物防

御反應的中心激活劑［23］

。Pontier 等［24］

構(gòu)建了一

種轉(zhuǎn)基因突變體，特異性地消除了轉(zhuǎn)基因煙草植

物中這類 bZIP 蛋白的 DNA 結(jié)合活性，通過 NPR1

和 TGA之間的物理相互作用，表明這些轉(zhuǎn)錄因子

在通過調(diào)節(jié)防御基因介導 SAR 誘導方面發(fā)揮作

用，并且 TGA在調(diào)解植物防御反應方面起著消極

和積極的調(diào)節(jié)作用。bHLH轉(zhuǎn)錄因子參與植物對

病原菌抗攻擊的反應，于靜［25］

在本氏煙中發(fā)現(xiàn)了

28 個 bHLH 轉(zhuǎn)錄因子，它們被寄生疫霉侵染后而

強烈地上調(diào)，表明這些 bHLH 轉(zhuǎn)錄因子與植物防

御反應有關(guān)。AP2/ERFs是最重要的轉(zhuǎn)錄因子家

族之一，可調(diào)節(jié)植物中的應激、代謝和發(fā)育等多

種反應。Sonal 等［26］從罌粟花中分離出 PsAP2。

PsAP2過表達轉(zhuǎn)基因煙草植物對非生物和生物脅

迫表現(xiàn)出增強的耐受性。轉(zhuǎn)錄表達分析顯示，在

PsAP2 過表達煙草植物中，煙草替代氧化酶 1a 和

Myo-肌醇-1-磷酸合成酶的組成性上調(diào)。植物

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子以前與響應各種病原體基因表

達的改變有關(guān)，Park等［27］

分離出一個WRKY基因，

使用含有假定的 W-box 序列的寡核苷酸分子作

為探針，證實了CaWRKY-a蛋白具有W-box結(jié)合

活性，CaWRKY-a 可能作為轉(zhuǎn)錄因子參與植物防

御相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導途徑。在本研究中，接種后

NC95有13個家族的20個轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生了顯著變

化，SY04-3 有 20 個家族的 38 個轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生了

顯著變化。

綜上，本研究利用高通量測序技術(shù)對 PVY不

同抗性煙草品種進行轉(zhuǎn)錄組測序和分析，篩選出

差異表達基因數(shù)量，通過 GO 功能注釋、KEGG 代

謝通路富集分析和轉(zhuǎn)錄因子預測，發(fā)現(xiàn)接種 PVY

的 12 h后煙草就能對 PVY脅迫作出響應，這為進

一步探究煙草防御 PVY 關(guān)鍵基因及其分子調(diào)控

機制提供了有益參考。

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（責任編輯：王希）

227

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E?mail : jlndxb @ vip.sina.com

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 2024，46（2）：228-238

Journal of Jilin Agricultural University

偏腫革裥菌 GMC 基因家族在木質(zhì)條件下轉(zhuǎn)錄

表達分析*

池玉杰**，陳欣妍，楊旭欣，郝雅昕，趙予璐，賈子燁，蘇文浩

東北林業(yè)大學林學院，哈爾濱 150040

摘 要：為揭示偏腫革裥菌（Lenzites gibbosa）在分解木材過程中葡萄糖-甲醇-膽堿氧化還原酶（Glucosemethanol-choline oxidoreductases， GMCs）基因的功能，采用高通量測序技術(shù)對 L. gibbosa分解木屑過程中 0，3，

5，7，11 d的菌絲體進行轉(zhuǎn)錄組測序，以 Count值與校正后的 FPKM 值為表達量進行基因篩選。分析基因表達

量變化情況及在eggNOG，COG，GO，KEGG，NR，SwissProt和Pfam等數(shù)據(jù)庫中的功能注釋結(jié)果，通過qPCR驗證

基因表達量。根據(jù)基因注釋結(jié)果共篩選到23個GMCs基因，表達量變化表明其中有9個是差異基因。功能注

釋及富集結(jié)果表明，L. gibbosa 的 GMCs 至少有 6 種，分別為纖維二糖脫氫酶、葡萄糖氧化酶、吡喃糖脫氫酶、

L-山梨糖1-脫氫酶、醇氧化酶、吡喃糖氧化酶，屬于CAZy-AA3家族下的4個亞家族，在木材木質(zhì)素與綜纖維

素的降解過程中，它們主要參與能量轉(zhuǎn)運和代謝有關(guān)的碳代謝、甲烷代謝、氨基酸代謝和脂質(zhì)代謝；GMCs與木

質(zhì)素降解過程中 H2

O2的形成有特定關(guān)系，可與 FAD結(jié)合，將初級醇基氧化形成醛并釋放 H2

O2，為過氧化物酶

提供恒定反應底物。由于能在木質(zhì)素和纖維素的降解過程中發(fā)揮重要的輔助作用，GMCs屬于與木材降解相

關(guān)的重要輔助酶系，為白腐菌中GMC家族在木材降解過程中的功能研究提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：偏腫革裥菌；葡萄糖-甲醇-膽堿氧化還原酶；木質(zhì)素降解；轉(zhuǎn)錄組；差異表達基因

中圖分類號：S718. 81 文獻標志碼：A 文章編號：1000-5684（2024）02-0228-11

DOI：10.13327/j.jjlau.2021.1817

引用格式：池玉杰，陳欣妍，楊旭欣，等 .偏腫革裥菌 GMC基因家族在木質(zhì)條件下轉(zhuǎn)錄表達分析［J］.吉林農(nóng)業(yè)

大學學報，2024，46（2）：228-238.

Transcriptional Expression Analysis of GMC Gene Family from Lenz?

ites gibbosa under Woody Condition *

CHI Yujie**，CHEN Xinyan，YANG Xuxin，HAO Yaxin，ZHAO Yulu，JIA Ziye，SU Wenhao

School of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China

Abstract：In order to reveal the function of glucose-methanol-choline oxidoreductases (GMCs) genes

of Lenzites gibbosa (Trametes gibbosa) during wood decomposition, transcriptome sequencing was per?

formed on L. gibbosa mycelia at 0, 3, 5, 7 and 11 days during the decomposition of wood chips by

high-throughput sequencing technology. Count value and corrected FPKM value of each gene were

used as expression levels to screen genes and differentially expressed genes (DEGs) between the

samples of non-woody control group and the wood-treated samples at 3, 5, 7 and 11 d. The changes of

gene expression levels and the annotated results in function of genes in eggNOG, COG, GO, KEGG,

NR, SwissProt and Pfam databases were analyzed. The expression of five important DEGs was veri?

* 基金項目：國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（202010225200），黑龍江省自然科學基金項目（C2016006）

作者簡介：池玉杰，女，博士，教授，研究方向：林木病理學與菌物學；陳欣妍，女，博士研究生，研究方向：林木病理學。

陳欣妍與池玉杰同為第一作者。

收稿日期：2022-05-12

** 通信作者：池玉杰，E-mail：chiyujienefu@126.com

池玉杰，等：偏腫革裥菌GMC基因家族在木質(zhì)條件下轉(zhuǎn)錄表達分析

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 Journal of Jilin Agricultural University

fied by fluorescence quantitative PCR (qPCR).A total of 23 GMC genes were screened based on the

gene annotation results, and the change of expression showed that 9 of them were DEGs. Functional

annotation and enrichment results showed that at least 6 kinds of GMCs in L. gibbosa, namely cellobi?

ose dehydrogenase, glucose oxidase, pyranose dehydrogenase, L-sorbose 1-dehydrogenase, alcohol

oxidase and pyranose oxidase, belonged to four subfamilies of CAZy-AA3 family. In the process of

wood lignin and holocellulose degradation, they were mainly involved in carbon metabolism, methane

metabolism, amino acid metabolism and lipid metabolism related to energy transport and metabo?

lism. Various GMCs had a specific relationship with the formation of H2O2 during lignin and cellu?

lose degradation. They could bind with flavin adenosine dinucleotide (FAD) to oxidize the primary al?

cohol group to form aldehyde and release H2O2, providing a constant reaction substrate for peroxi?

dases. Due to their important auxiliary role in the degradation of lignin and cellulose, GMCs are im?

portant auxiliary enzymes related to wood degradation. This study provides a basis for the functional

study of GMC family in wood degradation of white rot fungi.

Key words：Lenzites gibbosa； glucose-methanol-choline oxidoreductases （GMCs）； lignin degrada?

tion； transcriptome； differentially expressed genes （DEGs）

木材細胞壁主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)

素3種高分子組成。木質(zhì)素是一種復雜且難以降

解的三維網(wǎng)狀酚類高分子聚合物［1］

，是非常豐富

的生物可再生資源［2］

。白腐菌可以有效地降解木

材細胞壁的所有成分，除了具有纖維素酶和半纖

維素酶外，白腐菌能產(chǎn)生降解木質(zhì)素的酶系統(tǒng)

（Lignin-degrading enzymes），該酶系統(tǒng)既包括一系

列能分解木質(zhì)素的氧化酶和過氧化物酶，也包括

一些木質(zhì)素降解輔助酶（Lignin-degrading auxil?

iary enzymes），如對過氧化物酶的活性至關(guān)重要

的 產(chǎn) 生 H2O2 的 酶（H2O2 generating enzymes）［3-4］。

偏腫革裥菌（Lenzites gibbosa）作為一種分解木質(zhì)

素能力較強、生長速度較快的白腐菌［5］

，可以產(chǎn)

生能用于高效分解木質(zhì)素的錳過氧化物酶（Man?

ganese peroxidases，MnPs）和漆酶。已知 MnPs 是

一種依賴 H2O2的亞鐵血紅素糖蛋白酶［6］

，在木材

白腐菌降解過程中發(fā)揮重要作用。MnPs 基因受

Mn2+

調(diào)控表達［7- 8］

，MnPs 的酶學性質(zhì)已有較多的

研究［9］，還有研究表明，產(chǎn)生 H2O2 的酶能促進

MnPs 對木質(zhì)素的降解反應［3］

，但 H2O2作為過氧

化物酶的重要反應條件，其形成機制還不十分

明確。

葡萄糖-甲醇-膽堿氧化還原酶（Glucosemethanol-choline oxidoreductases， GMCs）超 家 族

是指存在于生物有機體中的一大類，以黃素腺嘌

呤二核苷酸（Flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD）為

輔酶的氧化還原酶類，廣泛存在于昆蟲、真菌等生

物體中［10-11］

。1991 年，在對果蠅葡萄糖脫氫酶、

膽堿脫氫酶、黑曲霉葡萄糖氧化酶、多型甲醇氧化

酶的序列比對中，GMC家族被發(fā)現(xiàn)并定義［12］

。其

后，不斷有新的酶被發(fā)現(xiàn)并歸類于 GMC 家族，如

吡喃糖氧化酶［12］

、芳基醇氧化還原酶［13］

、醇氧化

酶、纖維二糖脫氫酶、葡萄糖氧化酶［14］

、葡萄糖脫

氫酶、吡喃糖脫氫酶等［15］

，顯示出該家族的功能

多樣化特征。

GMCs 一般催化某些反應導致 H2O2的產(chǎn)生，

因此在 L. gibbosa 降解木材的過程中，由 GMCs 表

達并參與的反應可能作為其產(chǎn)生 H2O2的重要機

制之一，為MnPs在木材白腐菌降解過程中的作用

提供必需的反應條件。本研究首次在偏腫革裥菌

（L. gibbosa）中開展 GMC 基因家族表達規(guī)律與功

能研究，利用高通量測序技術(shù)對L. gibbosa無木屑

和木屑處理3，5，7，11 d條件下的菌絲體進行轉(zhuǎn)錄

組測序，并分析白腐菌在木材降解過程中的所有

GMC基因和差異表達基因，為深入研究白腐菌中

GMC 家族在木材降解過程中的功能提供理論依

據(jù)，也為提高偏腫革裥菌降解木材效率的研究提

供基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1. 1　菌絲培養(yǎng)與轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建

供試菌株 CB-1 分離自吉林省長白山的偏腫

革裥菌（L. gibbosa）子實體，PDA 斜面培養(yǎng)基上的

菌種保存于東北林業(yè)大學林學院森林保護學科森

229

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

林病蟲病理實驗室 4 ℃冰箱內(nèi)。去皮的小黑楊

（Populus simonii × P. nigra）木片削成薄木屑，滅菌

后備用。將保藏菌種復壯后，接種至 PDA平板培

養(yǎng)基上，在 26 ℃下培養(yǎng) 7 d，至菌絲長滿平板。在

平板菌落邊緣用5 mm打孔器提取菌餅，接種至裝

有 70 mL 低氮天冬酰胺琥珀酸（Low nitrogen as?

paragine succinic acid，LNAS）培養(yǎng)基和 5 mL 過濾

除菌的 15% 葡萄糖的 250 mL 三角瓶中，每個三

角瓶中接種 5 個菌餅，26 ℃靜置培養(yǎng) 10 d 后，隨

機取 15 瓶沒有加入木屑的作為對照組（ck），其

他為處理。其中每個三角瓶內(nèi)加入 2 g 木屑，

分 別 靜 置 培 養(yǎng) 3，5，7，11 d，記 為 D3，D5，D7，

D11。每組設(shè) 3 次重復，隨機提取 5 瓶內(nèi)的菌絲

體作為 1 次重復。將混合后的菌絲體置于 8 層

紗布中，用無菌水沖去培養(yǎng)基雜質(zhì)，過濾擰干。

將得到的干菌絲體轉(zhuǎn)入凍存管內(nèi)封口，以液

氮速凍并置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存。將冷凍的菌

絲樣品送至北京百邁克生物科技有限公司，利用

Illumina HiSeq X Ten高通量測序平臺進行轉(zhuǎn)錄組

雙端測序。

1. 2 GMC 基因和差異基因的篩選與功能注釋

分析

轉(zhuǎn)錄組測序得到的原數(shù)據(jù)（Raw data）進行質(zhì)

量調(diào)控后得到待分析的純數(shù)據(jù)（Clean reads）。使

用 Hisat2 軟件將純數(shù)據(jù)與 JGI 的 Trametes gibbosa

參考基因組序列（http：∥genome.jgi.doe.gov/Tra?

gib1/Tragib1.home.html）進行比對。根據(jù)參考基

因組的 GFF 文件使用 StringTie 軟件對比，將對比

后的轉(zhuǎn)錄本進行組裝并合并，得到一整套轉(zhuǎn)錄本

信息和每個基因的表達量值。使用 BLAST 軟

件［16］對轉(zhuǎn)錄組基因在 COG，KOG，eggNOG，GO，

KEGG，NR，Pfam，SwissProt 這 8 個基因功能數(shù)據(jù)

庫中進行功能注釋。根據(jù)在數(shù)據(jù)庫中對基因功能

注釋的結(jié)果，在L. gibbosa所有基因集中進行GMC

基因搜索獲得所有 GMC基因。根據(jù) GMC基因的

表達量，用 edgeR 軟件進行差異基因（DEGs）表達

分析，以差異倍數(shù) Fold Change≥2、錯誤糾偏率

FDR<0.05為標準，篩選出 GMC 差異表達基因，分

析差異表達情況和表達量的變化規(guī)律，表達量值

以 Count 值與校正后的 FPKM 值表示，Count 值是

比對到參考基因組上的每個基因的reads數(shù)；根據(jù)

差異基因在 COG 和 GO 中的注釋結(jié)果分析其功

能；根據(jù)差異基因在 KEGG 代謝通路中的注釋結(jié)

果分析GMC基因參與的代謝通路。

1. 3　重要差異基因表達量的qPCR驗證

根據(jù)GMC基因的表達差異和功能分析，篩選

出在降解木材過程中可能發(fā)揮重要作用的9個差

異基因。根據(jù)其基因序列使用 Primer5 設(shè)計擴增

長約為200 bp的qPCR上下游特異性引物（表1），

送至上海生工生物工程有限公司進行引物合

成，使用 gpd 基因作為相關(guān)差異基因表達的內(nèi)參

照，在與本文“1.1”中同樣的分解木屑和無木屑

處理條件下，提取菌絲體進行 qPCR 驗證。以

Revert Aid Premium Reverse Transcriptase 試劑盒

（Thermo Fisher Scientific 公 司）及 其 方 法 合 成

cDNA 第一鏈。以 2X SYBR Green qPCR Master

Mix （Low Rox）試劑盒（Bimake 生物科技有限公

司）及其說明書進行熒光定量 PCR 反應，每個樣

品 3 次生物學重復，每個生物學重復 3 次機械重

復。以目的基因與內(nèi)參基因的差值作為處理組和

對照組的 ΔCt 數(shù)值，根據(jù)公式：基因相對表達量=

2?［?Ct（處理組）-?Ct（對照組）］，計算不同基因的起始相對表

達量并進行分析。試驗的表達量數(shù)據(jù)在 Excel 下

進行方差分析，用IBM SPSS Statistics 24進行顯著

性分析。

表1 9個重要基因的qPCR引物

Table 1 Primers for qPCR of 9 important genes

基因ID

gene_10147

gene_10240

gene_11129

gene_11344

gene_11714

gene_2965

gene_438

gene_5916

gene_9842

引物序列（5′-3′）

TCGCCTGCTTTCCTTT

CCTGGTAACCCTTCTTGAC

CTGAACGCCCAATACG

CCCGCCATACATCTGA

TGGGGTTTCTGTTGGG

CGTGTTCTTGATTTTCGTC

CCGCAAAAGCACATAA

GGAAGAGGGAGGGATAG

CCGTGGGTTGACTGAT

CGCCCCTGATTATGAC

CATTTCTGTTGCTTCGC

TCGTTCGTGCTTTTCAT

GGACTTTTCGGGCATA

TTCAGGTTCGGTCTACG

GTCCAAGGCAAGGTCA

GTGGGTCGGCATAGAG

ACAGTCTGGGTGGAAAA

CCGAAAACTTGCATCTC

用途

上游

下游

上游

下游

上游

下游

上游

下游

上游

下游

上游

下游

上游

下游

上游

下游

上游

下游

230

池玉杰，等：偏腫革裥菌GMC基因家族在木質(zhì)條件下轉(zhuǎn)錄表達分析

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 Journal of Jilin Agricultural University

2　結(jié)果與分析

2. 1 GMC基因與差異基因的篩選

根據(jù)在 COG，eggNOG，GO，KEGG，NR，Swis?

sProt 等多個數(shù)據(jù)庫中對轉(zhuǎn)錄組文庫基因注釋的

結(jié)果及表達量數(shù)據(jù)，在所有L. gibbosa基因中篩選

出23個GMC基因（表2），以基因差異表達倍數(shù)的

log2FC 絕對值>1.0，F(xiàn)DR<0.05 為標準篩選出 9 個

差異表達基因，其他 14 個為非差異基因。在 D3

與 ck，D5 與 ck，D7 與 ck 組中，都是有 5 個相同的

差異基因表達上調(diào)，有 4 個相同的差異基因表達

下調(diào)；但在D11與ck組中，有4個差異基因表達上

調(diào)，有 5 個差異基因表達下調(diào)（“l(fā)og2FC”是以 2 為

底的2組樣品間差異表達基因表達量比值的對數(shù)

值）。可見，在木屑處理條件下，部分GMC基因表

達量存在變化，在木屑處理3，5，7 d的木材降解過

程中上調(diào)表達基因多，下調(diào)表達基因相對少。

2. 2　偏腫革裥菌（L. gibbosa）的GMC類別

GMC 超家族的真菌成員包括芳基醇氧化還

原酶、醇氧化酶、纖維二糖脫氫酶、葡萄糖氧化酶、

葡萄糖脫氫酶、吡喃糖脫氫酶、吡喃糖氧化酶和寡

糖 脫 氫 酶 8 類（http：∥www. cazy. org/AA3_struc?

ture.html），它們共同構(gòu)成碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)

庫中輔助活性的 AA3 家族（Carbohydrate-Active

enZYmes Database-Auxiliary Activity Family 3，

CAZy-AA3）。根據(jù) GMCs 基因在 NR，Swiss Prot，

Pfam 數(shù)據(jù)庫中的注釋結(jié)果，L. gibbosa 的 GMCs 類

別見表 3（有基因產(chǎn)物被注釋到不同的類別中），

其中，纖維二糖脫氫酶、葡萄糖氧化酶、吡喃糖脫

氫酶、L-山梨糖 1-脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶 citC、

醇氧化酶和吡喃糖氧化酶等 GMCs歸屬于 CAZyAA3 家族下的 4 個亞家族（CAZy-AA3_1，2，3，

4）。雜色曲菌素 B 合酶也屬于 CAZy-AA3 家族，

但未明確具體屬于哪個亞家族。據(jù)此可推測，以

上對應基因產(chǎn)物屬于 CAZy-AA3 家族，都屬于

GMC 家族。gene_5916 在 GMC 家族中無明確注

釋，歸屬于FAD依賴型氧化還原酶大類。

表2　偏腫革裥菌的GMC基因及其表達

Table 2 GMC genes and their expression of L. gibbosa

分組

D3 與ck

D5 與 ck

D7 與 ck

D11與ck

差異表達基因ID

上調(diào)基因ID/表達量的log2

FC

gene_10147/1.061 9

gene_11714/1.596 5

gene_438/3.210 6

gene_5916/1.228 4

gene_9842/1.268 3

gene_10147/1.241 5

gene_11714/1.121 3

gene_438/1.815 8

gene_5916/1.718 3

gene_9842/1.197 2

gene_10147/1.322 8

gene_11714/1.132 3

gene_438/2.711 7

gene_5916/1.899 4

gene_9842/1.613 1

gene_11714/1.004 9

gene_438/3.432 0

gene_5916/1.587 4

gene_9842/1.586 0

下調(diào)基因ID/表達量的log2

FC

gene_10240/0.967 8

gene_11129/0.628 8

gene_11344/0.519 4

gene_2965/0.245 7

gene_10240/0.570 7

gene_11129/0.515 8

gene_11344/0.432 6

gene_2965/0.211 1

gene_10240/0.710 7

gene_11129/0.454 7

gene_11344/0.400 9

gene_2965/0.214 2

gene_10147/0.793 7

gene_10240/0.548 3

gene_11129/0.329 6

gene_11344/0.253 4

gene_2965/0.140 1

非差異表達基因ID

gene_10202

gene_10331

gene_10573

gene_1060

gene_11097

gene_11130

gene_11929

gene_2960

gene_2963

gene_3440

gene_4352

gene_4371

gene_8844

gene_9918

231

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Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

2. 3 GMC基因在 COG和 eggNOG 數(shù)據(jù)庫中的

注釋和分析

偏腫革裥菌 GMC 基因在 COG 數(shù)據(jù)庫中的功

能注釋結(jié)果見圖 1。在篩選到的 GMC 基因中，共

有 20 個基因得到注釋，其中注釋到“［I］：脂質(zhì)運

輸和代謝”以及“［R］：一般功能預測”中的基因均

為 19 個，都占總數(shù)的 48.72%；注釋到“［E］：氨基

酸轉(zhuǎn)運和代謝”中的基因 1 個，是 gene_5916，占

總數(shù)的 2.56%。在差異基因中，除 gene_5916 被

注釋到［E］外，其他都被注釋到脂質(zhì)運輸和代謝

［I］和一般功能預測［R］類目中。在 eggNOG 數(shù)據(jù)

庫中的注釋結(jié)果見表 3，除 gene_8844 被注釋到

“O：翻譯后修飾、蛋白質(zhì)折疊、伴侶”；gene_9842、

9918 被注釋到“［S］：功能未知”外，其他基因都

被注釋到了“［E］：氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝”中。以上

結(jié)果表明，GMC 除一般生物體功能外，主要參與

氨基酸和脂質(zhì)的運輸和代謝，與能量的轉(zhuǎn)運、代謝

有關(guān)。

2. 4 GMC基因在GO數(shù)據(jù)庫中的分類注釋與富

集分析

在 GO 數(shù)據(jù)庫中，將偏腫革裥菌基因產(chǎn)物分

類在“生物學過程”“細胞組分”和“分子功能”3個

一級類目下。對處理組與對照組的 21個 GMC 基

因進行GO分類注釋，結(jié)果見圖2。其中共有18個

GMC 基因得到 GO 注釋，分類到 3 大功能類目的

10個二級類目中，其中7個為差異基因；而得到的

轉(zhuǎn)錄組共有 5 341個基因得到 GO 注釋，被注釋到

3大功能類目的44個二級類目中。在18個GMC基

因中，注釋到“生物學過程”的基因有13個，它們同時

被注釋到二級功能類目“代謝過程（GO：0008152）”

和“單機體過程（GO：0044699）”中，其中有 1個基

因被注釋到“細胞過程”中；注釋到“細胞組分”的基

因有4個，其中2個相同的基因被分別注釋到二級

類目“膜（GO：0016020）”和“膜部分（GO：0044425）”

中，其他 2 個基因被分別注釋到“細胞”與“細胞部

分”和“細胞外區(qū)域”中；注釋到“分子功能”的有18個，

均被注釋在二級類目“催化功能（GO：0003824）”

中，其中有12個也被注釋到“結(jié)合”中。

表3　偏腫革裥菌的GMCs類別及GMC基因在eggNOG數(shù)據(jù)庫中的功能注釋結(jié)果

Table 3 Types of GMCs of L. gibbosa and functional annotation results of GMC genes in eggNOG database

基因產(chǎn)物類別

纖維二糖脫氫酶（Cellobiose dehydrogenase; AA3_1）

葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase; AA3_2）

吡喃糖脫氫酶（Pyranose dehydrogenase; AA3_2）

L-山梨糖1-脫氫酶（L-sorbose 1-dehydrogenase; AA3_2）

異檸檬酸脫氫酶citC（Isocitrate dehydrogenase citC; AA3_2）

雜色曲霉素B合酶（Versicolorin B synthase; AA3）

醇氧化酶（Alcohol oxidase; AA3_3）

吡喃糖氧化酶（Pyranose oxidase; AA3_4）

FAD依賴型氧化還原酶（FAD dependent oxido-reductase; GMC）

基因ID

差異基因ID

gene_10240[E]

gene_10147[E]

gene_2965[E]

gene_11344[E]

gene_438[E]

gene_11129[E]

gene_11129[E]

gene_11714[E]

gene_9842[S]

gene_5916[E]

非差異基因ID

gene_11929[E]

gene_8844[O]

gene_9918[S]

gene_10573[E]

gene_10331[E]

gene_11130[E]

gene_11097[E]

gene_4371[E]

gene_1060[E]

gene_4352[E]

gene_4371[E]

gene_11097[E]

gene_10202[E]

gene_10331[E]

gene_2960[E]

gene_2963[E]

gene_3440[E]

注：gene_ID后的標注為eggNOG數(shù)據(jù)庫中的注釋，［E］：氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝；［S］：功能未知；［O］：翻譯后修飾、蛋白質(zhì)折疊、伴侶

232

池玉杰，等：偏腫革裥菌GMC基因家族在木質(zhì)條件下轉(zhuǎn)錄表達分析

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圖1 GMC基因在COG數(shù)據(jù)庫中的注釋結(jié)果

Fig. 1 Annotation results of GMC genes in COG database

每對圖柱左側(cè)為此 GO Term 相關(guān)的所有基因數(shù)，右為GMC基因數(shù)。右縱軸數(shù)值上為GMC基因數(shù)，下為所有基因數(shù)

圖2 GMC基因的GO功能分類

Fig. 2 Function classification of GMC genes in Go database

233

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

將 21 個 GMC 基因進行 GO 富集分析，在 3 大

功能類目中以校正P值<0.05為標準，篩選出二級

條目及對應基因，以實際注釋的目的基因個數(shù)與

期望個數(shù)的差值作為富集程度的標準，篩選結(jié)果

見表 4。在 3 大功能分類中，共有 12 個 GMC 基因

被顯著富集到5個功能類目中，其中1個纖維二糖

脫氫酶基因（gene_11929）富集在“生物學過程”中

的 3個類目“細胞碳水化合物分解代謝過程（GO：

0044275）”“葡聚糖分解代謝過程（GO：0009251）”

“細胞多糖分解代謝過程（GO：0044247）”中，細胞

碳水化合物、葡聚糖和細胞多糖與構(gòu)成木材細胞

壁綜纖維素的成分相一致，表明該基因產(chǎn)物能參

與木材的分解代謝，纖維二糖脫氫酶可以直接氧

化纖維二糖，并在纖維二糖存在的條件下氧化纖

維素、蛋白質(zhì)、脂類等分子，同時釋放出H2O2

［17-18］

，

為過氧化物酶提供反應條件；12個GMC基因富集

在“分子功能”中的“氧化還原酶活性，作用于供體

的CH-OH基團（GO：0016614）”和“黃素腺嘌呤二

核苷酸結(jié)合（GO：0050660）”2 個類目下，表明這

12 個基因可與黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合，并發(fā)

揮氧化還原酶活性，它們作為氧化還原酶，是

以 黃 素 腺 嘌 呤 二 核 苷酸（FAD）為輔酶參加 氧

化還原反應。這 12個基因特別是 gene_11929及

其 中 的 5 個 差 異 基 因 gene_10147，gene_10240，

gene_11129，gene_11714，gene_9842 被顯著富集

于“分子功能”中的 2 個類目中，應是 L. gibbosa 在

降解木材過程中發(fā)揮重要作用的基因。

GO分類和富集分析表明，GMC在細胞內(nèi)、膜

上和細胞外參與L. gibbosa的代謝過程，具有與黃

素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合功能，具有氧化還原酶活

性與催化功能，可以參與木材纖維素的直接降解

和對木質(zhì)素的降解有輔助功能。

2. 5 GMC基因在 KEGG 數(shù)據(jù)庫中分類、富集及

關(guān)鍵通路分析

在 KEGG 分類中，有 5 個醇氧化酶基因 gene_

10202，gene_11714，gene_2960，gene_2963，gene_

3440 得到 KEGG 通路注釋，這 5 個基因被同時注

釋到了碳代謝通路和甲烷代謝通路中，見圖 3，其

中g(shù)ene_11714是差異基因；其他GMC基因都沒有

被注釋到通路中。對這2個通路進行目的基因是

否發(fā)生顯著富集的分析結(jié)果見圖 4，以 Q 值<0.01

為標準，結(jié)果顯示 2 條通路均顯著富集，表明這

5個醇氧化酶參與了與能量代謝有關(guān)的碳代謝和

甲烷代謝。比較 2 條通路的富集因子，甲烷代謝

通路富集因子約為82.96，高于碳代謝通路富集因

子 19.14，表明甲烷代謝通路是最顯著富集通路，

實際上甲烷代謝通路屬于碳代謝通路的范疇。

GMCs 在甲烷代謝通路中的功能見圖 5，GMCs 在

該通路中參與將甲醇氧化成甲醛的過程，作用于

供 體 的 CH-OH 基 團 并 以 氧 為 受 體 同 時 產(chǎn) 生

H2O2，可推測在 L. gibbosa 降解木材過程中，GMCs

能參與初級醇基氧化形成相應醛的反應，并同時

將氧氣還原為 H2O2，從而為錳過氧化物酶等降解

木質(zhì)素提供反應底物［11，19］

，促進木質(zhì)素的降解。

表4 顯著性富集的GMC基因及對應的GO功能類目

Table 4 Significantly enriched GMC genes and corresponding GO function categories

GO一

級類目

生物學

過程

分子

功能

GO序號

GO:

0044275

GO:

0009251

GO:

0044247

GO:

0016614

GO:

0050660

GO功能類目

細胞碳水化合物分解代謝

過程

葡聚糖分解代謝過程

細胞多糖分解代謝過程

氧化還原酶活性，作用于

供體的CH-OH基團

黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合

差值

0.95

0.96

0.96

11.70

11.71

校正P值

0.045 8

0.049 9

0.049 9

0.011 2

0.007 4

基因_ID

gene_11929

gene_11929

gene_11929

gene_10147; gene_10202; gene_10240; gene_1060

gene_11097; gene_11129; gene_11130; gene_11714

gene_11929; gene_2960; gene_2963; gene_9842

gene_10147; gene_10202; gene_10240; gene_1060

gene_11097; gene_11129; gene_11130; gene_11714

gene_11929; gene_2960; gene_2963; gene_9842

234

池玉杰，等：偏腫革裥菌GMC基因家族在木質(zhì)條件下轉(zhuǎn)錄表達分析

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2. 6　重要差異基因表達量的熒光定量PCR驗證

根據(jù)差異基因在 eggNOG，GO 和 KEGG 中功

能分類與注釋的結(jié)果，并與參考文獻比較［7，11］

，篩

選出9個可能影響L. gibbosa降解木材過程的關(guān)鍵

酶基因：1 個葡萄糖氧化酶（AA3_2）基因：gene_

10240；2 個吡喃糖脫氫酶（AA3_2）基因：gene_

10147 和 gene_2965；2 個 異 檸 檬 酸 脫 氫 酶 citC

（AA3_2）基因：gene_11344 和 gene_438；2 個醇氧

化酶（AA3_3）基因：gene_11129 和 gene_11714；

1 個吡喃糖氧化酶（AA3_4）基因：gene_9842；1 個

FAD 依賴型氧化還原酶基因：gene_5916，采用

qPCR 試驗驗證基因相對表達量，結(jié)果見圖 6［圖

中柱形圖上方顯著性標識的不同小寫字母表示不

同處理之間差異顯著（P<0.05）］。相比于 ck 組，

有 5 個 基 因 gene_10147，gene_11714，gene_438，

gene_5916 和 gene_9842 的表達在木屑條件下受

促進而呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，其中 gene_10147各木屑處

理組（3，5，7，11 d）的表達量分別是對照組表達量

的 1.06 倍，1.24 倍，1.32 倍，0.79 倍；gene_11714 為

1.60倍，1.12倍，1.13倍，1.00倍；gene_438為3.21倍，

1.82 倍 ，2.71 倍 ，3.43 倍 ；gene_5916 為 1.23 倍 ，

1.72 倍 ，1.90 倍 ，1.59 倍 ；gene_9842 為 1.27 倍 ，

1.20 倍，1.61 倍，1.59 倍；但 gene_10147 和 gene_

11714的各木屑處理和ck之間表達量沒有顯著差

異。有 4 個基因 gene_10240，gene_11129，gene_

11344 和 gene_2965 的表達在木屑條件下受抑制

而呈下調(diào)和顯著下調(diào)趨勢，gene_10240 對照組表

達量分別是各木屑處理組（3，5，7，11 d）表達量的

1.03 倍，1.75 倍，1.41 倍，1.82 倍；gene_11129 為

1.59 倍，1.94 倍，2.20 倍，3.03 倍；gene_11344 為

1.93倍，2.31倍，2.49倍，3.95倍；gene_2965為4.07

倍，4.74倍，4.67倍，7.14倍。qPCR 驗證基因表達

量的結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序的基因表達量結(jié)果在表達

量差異倍數(shù)上存在一些偏差，但多數(shù)基因的整體

趨勢基本一致。

圖3 GMC基因的KEGG分類

Fig. 3 Classification of GMC genes in KEGG database

圖中右側(cè)顏色條帶對應圖中圓點顏色，顏色越紅表明 Q 值越小。

圓點大小代表基因數(shù)目，圓點越大表明數(shù)目越多

圖4　在KEGG中GMC基因富集的通路

Fig. 4 Pathways for GMC gene enrichment in KEGG

注：圖中紫色部分代表有GMC注釋其中

圖5　甲烷代謝通路中GMCs參與的步驟

Fig. 5 Involvement of GMCs in methane metabolism

pathway

235

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Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

3　討 論

本研究中的白腐菌偏腫革裥菌其拉丁學名

“Lenzites gibbosa”與“Trametes gibbosa”是同物異

名。纖維素與半纖維素的降解主要是通過糖基水

解酶的水解作用［17］

，但木質(zhì)素是一種復雜的三維

長鏈高分子化合物，其降解途徑主要是氧化作用

而不是水解作用，包括芳香基、烷基醚鍵和碳-碳

鍵的斷裂，脫甲氧基化、烷化和縮合反應等［20］

。

通常白腐菌可形成有效降解木材各成分的過氧化

物酶類、氧化酶類、糖基水解酶類和細胞色素

P450 類［21］

。在偏腫革裥菌中主要降解木質(zhì)素的

酶有漆酶和 MnPs，MnPs 參與反應時需要以 H2O2

作為底物。本研究通過對非木質(zhì)和木質(zhì)處理 3，

5，7，11 d條件下的偏腫革裥菌進行轉(zhuǎn)錄組測序與

分析，篩選出23個葡萄糖-甲醇-膽堿氧化還原酶

（GMC）基因。在含有偏腫革裥菌菌絲體的 LNAS

液體培養(yǎng)基中，加入木屑、混勻后繼續(xù)靜置培養(yǎng)，

于 3 d時有少量菌絲在木屑上生長并開始分解木

屑，5，7，11 d時在木屑上及周圍的菌絲逐漸增多，

表明菌絲生物量的增長，菌絲對木屑的分解也在

緩慢增強，而在 1 d時菌絲尚未在木屑上定植，因

此選擇了無木屑作為對照和加入木屑處理后 3，

5，7，11 d 的菌絲體進行轉(zhuǎn)錄組測序，目的是獲得

在 0，3，5，7，11 d時，菌絲體內(nèi)基因的表達和差異

表達情況，探索加入木屑處理的最初一段時間內(nèi)

與無木屑處理之間基因在表達上的差異。11 d以

后的情況還有待今后進一步探究。GMC 作為在

真菌中廣泛存在的一個大家族，歸屬于一組具有

圖6　無木屑（對照）和木屑處理條件下9個差異基因的表達量

Fig. 6 Expression of 9 DEGs under woody environment in LNAS medium

236

池玉杰，等：偏腫革裥菌GMC基因家族在木質(zhì)條件下轉(zhuǎn)錄表達分析

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 Journal of Jilin Agricultural University

特殊“輔助活性”（Auxiliary activities，AA）的酶，即

CAZy-AA3家族，L. gibbosa的這23個GMC基因至

少有 6 種，它們以 FAD 作為輔酶，通過其產(chǎn)物

H2O2或?qū)Ρ蕉虞o助其他 AA 家族酶發(fā)揮作用，

或 支 持 糖 苷 水 解 酶 在 纖 維 素 降 解 中 發(fā) 揮 作

用［11，19］

，或能促進 MnPs對木質(zhì)素的降解［3］ ，如纖

維二糖脫氫酶，既可直接參與木材細胞壁中纖維

素的氧化降解，又可與醇氧化酶等 GMCs 同時介

導氧化還原反應，并釋放出 H2O2，為過氧化物酶

氧化木質(zhì)素提供反應條件。在木屑處理條件下，

自木屑開始降解并隨時間延長降解程度的逐漸增

強，在3 ~5 d和5～7 d，GMC差異基因表達情況呈

上調(diào)的居多，至11 d一直有上調(diào)的表達基因，表明

一直都有 H2O2的產(chǎn)生，這個結(jié)果為 GMCs 在木材

降解過程中發(fā)揮的作用提供了依據(jù)，也符合MnPs

降解木屑的規(guī)律［22］

。可見，作為與木材降解相關(guān)

的重要輔助酶系，由于 GMCs 在白腐菌對木材木

質(zhì)素和纖維素的降解過程中能發(fā)揮重要的輔助作

用而不可或缺。

GMCs與木材中木質(zhì)素和纖維素降解過程中

H2O2的形成有特定的關(guān)系?，F(xiàn)有研究表明，多孔

菌中的各類GMCs都能產(chǎn)生H2O2

［23］

。葡萄糖氧化

酶（GOD，EC1.1.3.4），系統(tǒng)名稱為 β-D-葡萄糖氧

化還原酶，是一種需氧脫氫酶，在有氧條件下能

專一性地氧化 β-D-葡萄糖生成 D-葡萄糖-1，5-

內(nèi)酯至葡萄糖酸和 H2O2

（C6H12O6+O2→C6H12O7+

H2O2

），在食品工業(yè)、紡織漂染、醫(yī)藥等行業(yè)、生物

燃料、飼料、葡萄糖生物傳感器等領(lǐng)域都有廣泛的

應用［14］

。吡喃糖氧化酶（PROD， EC1.3.10，）能催

化一類碳水化合物在第2個碳原子上發(fā)生反應生

成 2-酮基類衍生物和 H2O2

［24］

，例如來自 Trametes

multicolor 的吡喃糖 2-氧化酶（P2O）是一種黃素

酶，它利用O2作為電子受體，催化C2位的D-葡萄

糖和其他醛吡喃糖的氧化，形成相應的2-酮糖和

H2O2

［25-27］

。

有一個現(xiàn)象需要指出，雖然這些基因在 egg?

NOG，COG，GO數(shù)據(jù)庫中得到了注釋，但是只有5個

醇氧化酶基因得到 KEGG 通路注釋，其他的 GMC

基因都未被注釋到 KEGG 通路中，其參與的通路

還不明確，還有部分基因在 NR，SwissProt 數(shù)據(jù)庫

中得到的注釋也不完全。關(guān)于本研究已篩選得到

的重要 GMC 基因，其基因結(jié)構(gòu)、功能和作用機制

還有待進一步探索。

4　結(jié) 論

本研究共篩選到白腐菌偏腫革裥菌 23 個

GMC基因，其中9個為差異表達基因，在木材剛剛

開始分解時 GMC 即穩(wěn)步參與降解反應。這些

GMC 歸屬于碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫中輔助活

性 3 家族下的 4 個亞家族（CAZy-AA3_1，2，3，

4），至少有 6 種，分別為纖維二糖脫氫酶、葡萄糖

氧化酶、吡喃糖脫氫酶、L-山梨糖1-脫氫酶、醇氧

化酶、吡喃糖氧化酶。在L. gibbosa對木材降解過

程中，GMCs 在細胞內(nèi)、膜上和細胞外參與 L. gib?

bosa 的代謝過程，具有與輔酶黃素腺嘌呤二核苷

酸結(jié)合的功能和催化氧化還原反應的功能，參與

了與能量代謝有關(guān)的碳代謝、甲烷代謝中的醇氧

化反應，以及與能量轉(zhuǎn)運、代謝有關(guān)的氨基酸和脂

質(zhì)的運輸和代謝，在偏腫革裥菌降解木材木質(zhì)素

和纖維素的過程中發(fā)揮重要的輔助作用，是與木

材降解相關(guān)的重要輔助酶系。本研究為白腐菌中

GMC 家族在木材降解過程中的功能研究提供了

依據(jù)。

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（責任編輯：王希）

238

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 2024，46（2）：239-245 http : // xuebao.jlau.edu.cn

Journal of Jilin Agricultural University E?mail : jlndxb @ vip.sina.com

林下栽培靈芝主要活性成分與生態(tài)因子的關(guān)系*

石云龍，韓 梅，孫 卓**，楊利民**

吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，長春130118

摘 要：環(huán)境條件是影響藥用真菌活性成分形成和積累的重要因素，利用灰色關(guān)聯(lián)度、典范對應分析（CCA）、

主成分分析（PCA）等分析法探究生態(tài)因子對林下栽培靈芝主要活性成分積累的影響。在吉林省和龍市落葉

闊葉林，采集靈芝、土壤樣品各 30份，采用分光光度法測定靈芝主要活性成分含量，常規(guī)法測定土壤溫度、含

水量、有機質(zhì)等，空氣溫濕度計測定空氣溫、濕度，光照計測定透光率。結(jié)果表明：生態(tài)因子對靈芝多糖、總?cè)?/p>

萜、總蛋白含量的影響較大，對氨基酸含量的影響較小；土壤溫度、含水量對靈芝主要活性成分積累具有顯著

影響，土壤溫度在 19. 50~24. 25 ℃，土壤含水量在 22. 65%~49. 49%，有利于靈芝多糖、總?cè)?、總蛋白含量?/p>

積累。

關(guān)鍵詞：靈芝；活性成分；生態(tài)因子；林下栽培模式

中圖分類號：S567. 31 文獻標志碼：A 文章編號：1000-5684（2024）02-0239-07

DOI：10.13327/j.jjlau.2021.5642

引用格式：石云龍，韓梅，孫卓，等 . 林下栽培靈芝主要活性成分與生態(tài)因子的關(guān)系［J］. 吉林農(nóng)業(yè)大學學報，

2024，46（2）：239-245.

Relationship between Main Active Components of Ganoderma lu?

cidum Cultivated under Forests and Ecological Factors *

SHI Yunlong，HAN Mei，SUN Zhuo**，YANG Limin**

College of Chinese Medicinal Materials， Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China

Abstract：Environmental conditions are important factors that affect the formation and accumulation

of active components of medicinal fungi. Grey correlation degree, CCA, PCA and other analysis meth?

ods were used to explore the effects of ecological factors on the accumulation of main active compo?

nents of Ganoderma lucidum cultivated under forests. Thirty samples of G.lucidum and thirty samples

of soil were collected from deciduous broad-leaved forest in Helong city, Jilin province, and associated

plants were recorded. The main active components of G.lucidum were determined by spectrophotom?

etry. Soil temperature, water content, organic matter, etc. were determined by conventional methods. Air

temperature and humidity meter and light meter were used to measure air temperature, humidity and

light transmittance. The results showed that ecological factors had greater effects on polysaccharide, trit?

erpene and protein content of G.lucidum, but less effects on amino acid content. Soil temperature and wa?

ter content had significant effects on the accumulation of main active components of G.lucidum. Soil

temperature was 19.50-24.25 ℃, and soil water content was 22.65%-49.49%, which is conducive to

the accumulation of G.lucidum polysaccharide, total triterpenes and total protein content.

Key words：Ganoderma lucidum； active component； environmental factor； cultivation under forest

* 基金項目：吉林省科技發(fā)展計劃重點科技研發(fā)項目（20180201038YY），國家中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-21）

作者簡介：石云龍，男，在讀碩士，研究方向：藥用植物生態(tài)學。

收稿日期：2020-02-11

** 通信作者：孫卓，E-mail：329575668@163.com；楊利民，E-mail：ylmh777@126.com

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

靈芝原植物主要為赤芝［Ganoderma lucidum

（Leys. Ex Fr.） Karst.］，隸屬于多孔菌科（Polypora?

ceae）靈芝屬（Ganoderma）［1］

，素有“仙草”“神芝”

等美譽，是我國珍貴的傳統(tǒng)藥材［2］

。按其外部形

態(tài)及顏色，可分為青芝、赤芝、黃芝、白芝、黑芝和

紫芝 6類［3］

。世界范圍內(nèi)目前可確認的靈芝屬物

種共有 137 種，中國目前可確認的靈芝屬物種共

有 24 種［4］

。靈芝的栽培大致分為固體培養(yǎng)和液

體培養(yǎng)兩大方式。其中，固體培養(yǎng)又分為椴木栽

培和代料栽培等［5］

。目前，我國大部分靈芝栽培

為椴木栽培模式，主要分布于西南、華南、西北、東

北等地區(qū)［6］

。目前靈芝研究主要集中在化學成

分、栽培、藥理及臨床應用等方面［7-9］

，近年來，隨

著人們生活水平的提高和保健意識的增強，對靈

芝產(chǎn)品的需求呈日益增加的趨勢［10］

。林下栽培

靈芝作為市場獲取靈芝的主要方式之一，與其他

栽培靈芝比，其優(yōu)勢在于較少人工干預和環(huán)境無

污染的條件下自然生長，且品質(zhì)好［11-12］

，但由于靈

芝對生態(tài)環(huán)境要求很高，盲目地引種栽培和擴大

生產(chǎn)規(guī)?？赡軙е蚂`芝品質(zhì)的不穩(wěn)定，因此研

究靈芝活性成分與生態(tài)因子的相關(guān)性，對提高靈芝

品質(zhì)，保障靈芝產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

靈芝多糖、總?cè)?、總蛋白和氨基酸是靈芝的

主要活性成分，這些活性成分是靈芝在長期的進

化過程中與環(huán)境相互作用的結(jié)果，溫度、水分、光

照等作為主要的生態(tài)因子直接或間接影響著靈芝

的品質(zhì)［13-15］

。有研究表明，不同產(chǎn)地靈芝的品質(zhì)

差異較大［16-17］

，且受培養(yǎng)基質(zhì)的影響［18-19］

。目前

關(guān)于林下栽培靈芝與生態(tài)因子的關(guān)系研究較少。

為此，本研究以吉林省和龍市10個不同樣地林下

栽培靈芝的多糖、總?cè)啤⒖偟鞍?、氨基酸含量與

各樣地10個生態(tài)因子指標為參數(shù)，采用綜合分析

法建立靈芝品質(zhì)與生態(tài)因子之間的量化關(guān)系，旨

在明確影響靈芝品質(zhì)的主導生態(tài)因子及其作用特

征和規(guī)律，以期為林下栽培靈芝的規(guī)范化生態(tài)種

植技術(shù)提供科學依據(jù)。

1　材料與方法

1. 1　試驗地概況

研究樣地位于吉林省和龍市，地理坐標東經(jīng)

129° 01′12.3″，北 緯 42° 47′20.1″，平 均 海 拔 約

550 m。吉林省和龍市屬溫帶季風半濕潤氣候，年

日照時數(shù) 2 387.2 h，年平均氣溫 5.6 ℃，年均降雨

量 573.6 mm。植被以溫帶山地落葉闊葉林為主。

土壤為棕色森林土，地被層較深厚，土質(zhì)肥沃。

1. 2　供試材料

研究材料來自于以蒙古櫟為建群種的落葉闊

葉林，林下采用椴木木段人工栽培的靈芝。于

2019 年 8 月靈芝開片期，根據(jù)微地形、透光率、地

被層和伴生植物種類等差異設(shè) 10 個樣地。每個

樣地隨機采集靈芝樣品3株及土樣3份，并記錄靈

芝的菌蓋長、菌柄長等生物學指標；室內(nèi)烘干各樣

地靈芝樣品，粉碎，過0.25 mm（60目）篩，備用；土

壤樣品采用環(huán)刀法采集，剔除雜質(zhì)，裝入密封帶混

勻。靈芝材料經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學韓梅教授鑒定為赤

芝（G.lucidum）。

1. 3　主要藥品及試驗儀器

齊 墩 果 酸 標 準 品（質(zhì) 量 分 數(shù) >98%，批 號

SO8030）購自北京索萊寶科技有限公司；pH 測試

儀［SevenMulti，梅特勒-托利多（上海）儀器公司］，

紫外分光光度計［SHIMADZU（日本）制造公司］，

酶標儀［SpectraMax 190，美谷分子儀器（上海）

有限公司］，高速離心機和微量離心機［Thermo

（美國）制造公司］；恒溫培養(yǎng)搖床（KYC-100B，上

海 新 苗 醫(yī) 療 器 械 制 造 有 限 公 司），電 子 天 平

（AVY220，上海精密儀器儀表有限公司）等。

1. 4　靈芝多糖含量的測定

相關(guān)試劑盒測定靈芝多糖含量，具體步驟參

考科銘生物技術(shù)（蘇州）有限公司的靈芝多糖含量

測定試劑盒（ZDT-1-Y）。

1. 5　靈芝總?cè)坪康臏y定

采用香草醛-高氯酸-分光光度法測定靈芝

總?cè)坪浚?0］

。標準曲線的繪制：以齊墩果酸

為標準品，齊墩果酸含量 x 為橫坐標，吸光度y為

縱 坐 標 ，回 歸 方 程 為 y=52.714x+0.010 1，R2

=

0.997 8。

1. 6　靈芝總蛋白含量的測定

相關(guān)試劑盒測定靈芝總蛋白含量，具體步驟

參考科銘生物技術(shù)（蘇州）有限公司的總蛋白含量

試劑盒（BCAP-1-W）。

1. 7　靈芝氨基酸含量的測定

相關(guān)試劑盒測定靈芝氨基酸含量，具體步驟

參考索萊寶科技（北京）有限公司的靈芝氨基酸含

量檢測試劑盒（BC1575）。

240

石云龍，等：林下栽培靈芝主要活性成分與生態(tài)因子的關(guān)系

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 Journal of Jilin Agricultural University

1. 8　生態(tài)因子的測定

共測定 10個主要生態(tài)因子，包括土壤 pH、電

導率、有機質(zhì)、含水量、容重、孔隙度、土壤溫度、空

氣溫度、空氣濕度和透光率。土壤因子測定方法

參照《土壤農(nóng)化分析》［21］

，空氣溫度及濕度采用空

氣溫濕度計測定，透光率采用光照計測定。

1. 9　數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用 SPSS 23.0，DPS，Simca-p 14.1

和 Canoco5.0 軟件；圖表繪制采用 Origin 2018 和

graphpad Prism 8軟件。

2　結(jié)果與分析

2. 1　靈芝生物學性狀測定結(jié)果

對不同樣地林下栽培靈芝的菌蓋長、菌柄長、

鮮質(zhì)量、干質(zhì)量比較分析，結(jié)果表明，靈芝樣品平

均鮮質(zhì)量最大每株 180.52 g，最小每株 63.75 g；

平均干質(zhì)量每株最大 160.66 g，每株最小 50.76 g

（圖 1-A）；平均菌蓋長每株最大 49.39 cm，每株最

小 13.87 cm；平均柄長每株最大 7.15 cm，每株最

小3.32 cm（圖1-B）。綜合4項指標，樣地4、樣地5、

樣地6、樣地7靈芝的生物學性狀較優(yōu)（圖1）。

2. 2　靈芝主要活性成分含量分析

靈芝活性成分分光光度計測定結(jié)果顯示，不

同樣地靈芝主要活性成分存在明顯差異，結(jié)果見

圖 2。靈芝多糖平均含量為 7.58 mg/g，樣地 6 最

高，為 11.66 mg/g；樣地 1最低，為 4.34 mg/g；多糖

含量樣地 6 是樣地 1 的 2.69 倍。2015 版《中國藥

典》［22］

規(guī)定，靈芝多糖含量≥9 mg/g（0.90%），本研

究 10 個樣地中靈芝多糖含量只有樣地 5、樣地 6

和樣地 8 超過國家藥典標準，最高靈芝多糖含量

是藥典的1.30倍（圖2-A）。靈芝總?cè)破骄?/p>

為23.74 mg/g，樣地4最高，為32.03 mg/g；樣地10

最低，為 19.64 mg/g；總?cè)坪繕拥?4是樣地 10

的1.63倍。2015年《中國藥典》［22］

規(guī)定，靈芝總?cè)?/p>

萜含量≥5 mg/g（0.50%），本研究10個樣地靈芝總

三萜含量均超過國家藥典標準，且最低靈芝總?cè)?/p>

萜含量是藥典的 3.686 倍（圖 2-B）。靈芝總蛋白

平均含量為9.81 mg/g，樣地1最高，為12.50 mg/g；

樣地 4 最低，為 5.69 mg/g；靈芝總蛋白含量最高

是最低樣地的 2.20 倍（圖 2-C）。靈芝氨基酸平

均 含量為 624.92 μmol/g，其中，樣地 5 最高，為

1 056.20 μmol/g；樣地 7 最低，為 141.01 μmol/g；

靈芝總蛋白含量最高樣地是最低樣地的 7.49 倍

（圖2-D）。

綜上，以蒙古櫟為建群種的林下栽培靈芝，不

同樣地間靈芝差異明顯。在 2015 版《中國藥

典》［22］

規(guī)定的多糖含量與總?cè)坪?2項標準中，

總?cè)坪?10 個樣地均達到標準，且多數(shù)樣地

遠超藥典標準，質(zhì)量優(yōu)異；而多糖含量只有 3 個

樣地達到標準，說明林下栽培靈芝藥材質(zhì)量受環(huán)

境條件影響較大。另外，靈芝總蛋白和氨基酸

含量各樣地間差異明顯，特別是氨基酸含量多

數(shù)樣地間差異達到顯著水平（圖2）。采用SPSS軟

件對靈芝4種活性成分進行聚類分析，結(jié)果表明，

10個樣地可劃分為4類，樣地4單獨為一類，其總

三萜含量顯著高于其他樣地；樣地 9、樣地 10、樣

地 1 和樣地 2 聚為一類，其靈芝總蛋白含量高于

其他樣地；樣地 3、樣地 7和樣地 8聚為一類，其靈

芝氨基酸含量顯著低于其他樣地；樣地5和樣地6

聚為一類，其靈芝多糖含量顯著高于其他樣

地（圖3）。

圖1　不同樣地靈芝生物學性狀比較

Fig. 1 Comparison of biological characteristics of G.lucidum from different soil samples

241

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

2. 3　靈芝活性成分含量與生態(tài)因子的灰色關(guān)聯(lián)

度分析

對靈芝主要活性成分含量與生態(tài)因子進行灰

色關(guān)聯(lián)度分析，結(jié)果表明，土壤溫度處于 19.50~

24.25 ℃，土壤溫度越低越有利于靈芝多糖、總?cè)?/p>

萜、總蛋白含量的提高；土壤含水量在 22.65%~

49.49%，靈芝多糖、總?cè)?、總蛋白含量隨含水量

升高呈遞增趨勢；在 23.68~25.00 ℃，空氣溫度升

高可有效促進靈芝多糖的積累 ；空氣濕度在

73.42%~80.06%，空氣濕度越高越有利于靈芝總

三萜、總蛋白含量的積累（表1）。土壤溫度、空氣

溫度、空氣濕度對靈芝總?cè)萍翱偟鞍缀坑绊?/p>

最大 ；靈芝氨基酸含量與土壤容重存在相關(guān)

性（表2）。

2. 4　靈芝采樣點生態(tài)因子分析

為更加全面分析采樣點靈芝的生態(tài)因子，采

用 Simca-p 軟件對靈芝生長環(huán)境中的生態(tài)因子

（表 1）進行 PCA 分析，結(jié)果顯示：樣地 7 和樣地 8

集中在 PCA圖上的左上部，土壤容重顯著低于其

他樣地，靈芝氨基酸含量較低；樣地 1，2，9，10 分

散在 PCA圖的右下部分，土壤溫度顯著高于其他

樣地，靈芝總?cè)坪亢涂偟鞍缀枯^高；樣地

3~6 分散在 PCA 圖的右上部分，空氣溫度顯著低

于其他樣地（圖 4）。與靈芝活性成分聚類分析的

分類形式比較相似（圖 3），說明生態(tài)因子在一定

程度上影響靈芝活性成分含量的積累。

圖2　不同樣地靈芝活性成分比較

Fig. 2 Comparison of active components of G.lucidum from different soil samples

圖3　靈芝活性成分的聚類分析

Fig. 3 Cluster analysis of active components from

G.lucidum

242

石云龍，等：林下栽培靈芝主要活性成分與生態(tài)因子的關(guān)系

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 Journal of Jilin Agricultural University

采用 Canoco 軟件對靈芝活性成分與生態(tài)因

子進行 CCA 分析，結(jié)果表明：對靈芝活性成分影

響最大的生態(tài)因子為土壤溫度，與靈芝多糖、總?cè)?/p>

萜、總蛋白呈負相關(guān)關(guān)系；其次是土壤含水量，與

靈芝多糖、總?cè)?、總蛋白呈正相關(guān)關(guān)系。靈芝多

糖、總?cè)?、總蛋白位于不同象限，說明三者對生

態(tài)因子變化的敏感性較強，靈芝氨基酸位于距坐

標軸中心點較近的位置，說明靈芝氨基酸含量不

易受環(huán)境因子的影響。此外，土壤有機質(zhì)、孔隙

度、容重、空氣濕度對靈芝活性成分含量的積累也

存在一定的影響，但土壤 pH、電導率及空氣溫度

對靈芝活性成分含量的積累影響較小。靈芝多糖

與土壤有機質(zhì)、孔隙度、空氣濕度呈正相關(guān)關(guān)系，

與土壤容重呈負相關(guān)關(guān)系；靈芝總?cè)萍翱偟鞍?/p>

與土壤有機質(zhì)、孔隙度呈正相關(guān)關(guān)系，與空氣溫

度、土壤容重呈負相關(guān)關(guān)系（圖 5）。與靈芝活性

成 分 與 生 態(tài) 因 子 的 灰 色 關(guān) 聯(lián) 度 分 析 結(jié) 果 相

似（表2）。

表1 林下栽培靈芝不同樣地的主要生態(tài)因子

Table 1 Major ecological factors of G.lucidum cultivated under forests from different soil samples

樣地

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

土壤pH

5.43±0.03d

5.22±0.14ef

5.02±0.17g

4.82±0.07h

5.24±0.04e

5.18±0.06fg

5.67±0.08c

5.26±0.08ef

6.57±0.03a

5.89±0.03b

土壤電導率/

（μS·cm-1

）

56.32±5.40f

78.55±5.00f

50.44±7.80f

87.51±14.60ef

117.52±9.20c

105.05±7.40cd

63.46±1.50f

93.17±3.80de

592.05±10.60a

146.48±6.90b

土壤含水

量/%

34.52±0.20bcd

28.23±0.10cd

22.65±0.20d

28.84±0.20cd

33.37±0.20bcd

40.43±0.40bc

59.07±0.20a

49.49±0.10ab

48.31±0.10ab

28.12±0.10cd

土壤容重/

（g·cm-3

）

0.76±0.08a

0.75±0.23a

0.80±0.10a

0.80±0.13a

0.67±0.27a

0.69±0.12abc

0.39±0.06ab

0.44±0.03c

0.57±0.06bc

0.73±0.13abc

土壤

孔隙度

68.84±1.20h

68.92±4.40g

67.33±2.10j

67.57±2.50i

71.64±1.40d

70.95±2.70e

80.87±2.10a

79.22±7.60b

74.82±2.50c

69.79±2.30f

土壤溫度/

℃

24.25±0.25a

23.75±0.63a

23.75±0.63a

23.25±0.25ab

23.75±0.29a

22.50±0.13b

20.88±0.13b

19.50±0.20d

23.75±0.25a

24.25±0.25a

土壤有機

質(zhì)/%

9.09±0.75f

10.03±0.74g

9.04±0.81e

10.64±0.49a

10.53±2.07c

11.51±1.16c

11.13±0.42b

10.15±1.47d

11.35±0.28c

8.21±1.15fg

空氣溫度/

℃

25.00±0.05a

24.44±0.05d

24.10±0.04e

23.68±0.08f

24.80±0.05b

24.80±0.05b

24.64±0.05c

24.08±0.44e

23.96±0.05f

24.12±0.04e

空氣濕度/

%

73.42±1.21f

76.38±0.36c

73.50±0.56f

73.78±0.42f

74.46±0.05e

74.46±0.21e

75.58±0.22d

77.76±0.13b

75.88±0.46cd

80.06±0.34a

透光率/%

3.75±0.001f

2.06±0.001g

7.61±0.011e

24.69±0.008a

12.28±0.011c

11.13±0.004c

19.90±0.006b

9.63±0.003d

11.07±0.001c

2.81±0.001fg

表2 靈芝活性成分與生態(tài)因子灰色關(guān)聯(lián)度分析

Table 2 Grey correlation analysis of active components of G.lucidum and ecological factors

活性成分

靈芝多糖

靈芝總?cè)?/p>

靈芝總蛋白

靈芝氨基酸

土壤pH

0.506 7

0.716 4

0.741 1

0.464 2

土壤電導

率

0.434 7

0.442 7

0.527 8

0.424 5

土壤含

水量

0.555 3

0.539 7

0.553 3

0.407 8

土壤容重

0.462 7

0.697 6

0.641 4

0.551 8

土壤孔

隙度

0.537 2

0.747 0

0.744 1

0.452 0

土壤溫度

0.511 0

0.774 7

0.745 0

0.491 2

土壤有

機質(zhì)

0.535 9

0.717 1

0.717 0

0.486 7

空氣溫度

0.538 5

0.770 8

0.767 1

0.470 3

空氣濕度

0.535 2

0.793 4

0.795 7

0.470 9

透光率/%

0.456 3

0.484 0

0.482 9

0.377 9

圖4　采樣點生態(tài)因子主成分分析

Fig. 4 Principal component analysis of ecological fac?

tors in sampling sites

243

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

3　結(jié) 論

生態(tài)因素是藥材質(zhì)量形成的原始特征［23］

。

生態(tài)環(huán)境差異是導致藥材質(zhì)量差異的主要原因，

其對藥用真菌的產(chǎn)量和品質(zhì)具有顯著影響［24-33］

。

本研究采用灰色關(guān)聯(lián)度分析、典范對應分析法，考

察了不同樣地靈芝活性成分含量與生態(tài)因子的相

關(guān)性，結(jié)果表明：靈芝活性成分的含量不同程度地

受生態(tài)因子的影響，其中靈芝多糖、總?cè)?、總?/p>

白含量受生態(tài)因子的影響較大，相同生態(tài)因子對

三者含量積累的影響存在差異，但生態(tài)因子對靈

芝氨基酸含量影響較小，僅受土壤容重的影響。

土壤含水量、土壤溫度、空氣溫度、空氣濕度是影

響靈芝活性成分的主要生態(tài)因子，其中靈芝多糖

與土壤含水量、空氣溫度呈正相關(guān)，與土壤溫度、

空氣濕度呈負相關(guān)；靈芝總?cè)?、總蛋白與土壤含

水量、空氣濕度呈正相關(guān)，與土壤溫度、空氣溫度

呈負相關(guān)。

基于聚類分析、灰色關(guān)聯(lián)度分析、PCA 分析、

典范對應分析，本研究揭示了土壤溫度、含水

量、空氣濕度、空氣溫度在靈芝活性成分形成中

起重要作用。結(jié)果表明：土壤溫度處于 19.50~

24.25 ℃，越低越有利于靈芝多糖、總?cè)?、總蛋?/p>

含量的提高；土壤含水量在22.65%~49.49%，靈芝

多糖、總?cè)?、總蛋白含量隨含水量升高呈遞增趨

勢，表現(xiàn)為活性成分積累狀態(tài)；空氣溫度在23.68~

25.00 ℃，空氣溫度升高可有效促進靈芝多糖的積

累，但一定程度限制了靈芝總?cè)?、總蛋白的積

累；空氣濕度在73.42%~80.06%，空氣濕度越高越

有利于靈芝總?cè)?、總蛋白含量的積累，對靈芝多

糖的積累不利。綜上，林下栽培靈芝選擇土壤溫

度較低、土壤含水量較高的生境，可顯著提高靈芝

多糖、總?cè)?、總蛋白的積累，從而提高林下栽培

靈芝品質(zhì)。

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△代表活性成分

圖5　靈芝多糖、總?cè)啤⒖偟鞍?、氨基酸含量與環(huán)境因子

的CCA二維排序

Fig. 5 CCA two-dimensional sequencing of G. lu?

cidum polysaccharides， total triterpenes， total

proteins， amino acid contents and environmen?

tal factors

244

石云龍，等：林下栽培靈芝主要活性成分與生態(tài)因子的關(guān)系

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 Journal of Jilin Agricultural University

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（責任編輯：王希）

245

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吉林農(nóng)業(yè)大學學報 2024，46（2）：246-254

Journal of Jilin Agricultural University

天然闊葉次生林下不同年生人參根際微生物群

落多樣性*

劉麗娟1，2

，佟愛仔1，2

，秦佳梅1，2**

1. 通化師范學院 生命科學學院，通化 134001；2. 吉林省長白山生物種質(zhì)資源評價與應用重點

實驗室，通化 134001

摘 要：為探討天然闊葉次生林下人參根際細菌和真菌的群落組成和分布規(guī)律，以不同生長年限人參根際土

壤為研究對象，采用 Illumina HiSeq 高通量測序技術(shù)分析天然闊葉次生林下不同生長年限人參根際微生物菌

群落多樣性。結(jié)果表明：人參根際細菌和真菌的OTU數(shù)目，隨著人參生長年限的增長普遍增加，其中，11年生

（K11）人參的根際微生物OTU數(shù)目最多。α多樣性分析結(jié)果表明，相對于未種植人參土壤（Kck），生長年限分

別為7年（K7）和11年（K11）的土壤細菌群落的豐富度和多樣性明顯增加（P<0. 05），15年（K15）的細菌群落α

多樣性指數(shù)沒有明顯差異，而真菌群落的豐富度和多樣性指數(shù)，隨著人參的生長年限變化不大。β多樣性分

析表明，相同年生人參根際細菌和真菌群落距離較近，其中，15 年生（K15）人參根際細菌和真菌群落與對照

（Kck）樣本完全分開，群落差異明顯。優(yōu)勢細菌門的相對豐度隨著人參生長年限的增長發(fā)生改變。放線菌門

數(shù)量隨著種植年限有大幅變化，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，4年生（K4）數(shù)量達到最大值。優(yōu)勢真菌門的相對

豐度隨著人參生長年限的增長發(fā)生改變。天然闊葉次生林下，生長年限對人參根際土壤微生物有較大影響，

可為林下人參科學種植提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：闊葉林；人參；根際微生物；高通量測序技術(shù)

中圖分類號：S154. 3；S567. 51 文獻標志碼：A 文章編號：1000-5684（2024）02-0246-09

DOI：10.13327/j.jjlau.2021.1875

引用格式：劉麗娟，佟愛仔，秦佳梅.天然闊葉次生林下不同年生人參根際微生物群落多樣性［J］.吉林農(nóng)業(yè)大

學學報，2024，46（2）：246-254.

Diversity of Rhizosphere Microbial Community of Different Age

Panax ginseng in Natural Broad-leaved Secondary Forests *

LIU Lijuan1，2

，TONG Aizi1，2

，QIN Jiamei1，2**

1. School of Life Sciences， Tonghua Normal University， Tonghua 134001， China；2. Key Laboratory

of Evaluation and Application of Changbai Mountain Biological Gerplasm Resources of Jilin Prov?

ince， Tonghua 134001， China

Abstract：To explore the community composition and distribution patterns of bacteria and fungi in

the rhizosphere of Panax ginseng under natural broad-leaved secondary forests, taking ginseng rhizo?

sphere soil with different growth years as the research object, Illumina HiSeq high-throughput se?

quencing technology was used to analyze the microbial community diversity of ginseng rhizosphere

soil at different growth years in natural broad-leaved secondary forest. The results showed that the

number of OTUs of bacteria and fungi generally increased with the ginseng planting years. Among

* 基金項目：吉林省科技發(fā)展計劃項目（20190304012YY）

作者簡介：劉麗娟，女，碩士，教授，研究方向：藥用植物營養(yǎng)與栽培。

收稿日期：2022-08-12

** 通信作者：秦佳梅，E-mail：th-qjm@163.com

劉麗娟，等：天然闊葉次生林下不同年生人參根際微生物群落多樣性

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 Journal of Jilin Agricultural University

them, the number of OTUs of 11-year-old ginseng rhizosphere microorganisms was the largest.The α

diversity analysis showed that compared with the soil without planting ginseng, the richness and di?

versity of soil bacterial communities with growth years of 7 years (K7) and 11 years (K11) were sig?

nificantly increased (P<0.05), and there was no significant difference in α diversity index of bacterial

communities with 15 years, while fungi richness and diversity indexes of the community did not

change signifcantly with the growth years of ginseng. β diversity analysis showed that the rhizosphere

bacterial and fungal communities of the same year-old ginseng were relatively close. Among them,

the 15-year-old ginseng rhizosphere bacterial and fungal communities were completely separated

from the control samples, indicating that the community differences were significant. The abundance

of dominant bacteria phyla changed with the increase of ginseng age.The number of Actinomycetes

changed significantly with the planting years of ginseng, showing a first increasing and then decreas?

ing trend. The number of Actinomycetes in the 4-year-old ginseng reached the maximum value. The

abundance of dominant fungi phyla changed with the increase of ginseng age. Under the natural

broad-leaved secondary forest, the microbial community of ginseng rhizosphere under the broadleaved forest changed significantly with the growth of ginseng, which can provide a theoretical basis

for the scientific planting of ginseng under the forest.

Key words：broad-leaved forest；Panax ginseng； rhizosphere microorganism； high-throughput se?

quencing technology

人參（Panax ginseng C. A. Mey.）為五加科多

年宿根草本植物，按照生長環(huán)境不同，分為野山

參、林下參和園參三類［1］

，按栽培模式可分為林下

種參、伐林栽參和農(nóng)田栽參［2］

，其中，園參主要有

農(nóng)田栽參和林地種參 2 種生產(chǎn)方式，伐林種參給

森林資源和生態(tài)環(huán)境造成負擔，也易造成水土流

失，農(nóng)田栽參一定程度上雖緩解了參林矛盾，但由

于人參連作障礙，栽過一茬人參的土壤要30年后

才能再栽參，產(chǎn)區(qū)宜參農(nóng)田數(shù)量急劇減少。參地

資源緊張已成為阻礙人參產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要瓶

頸［3］

。林下護育栽培的人參與野山參外形相似，

有效成分相近，品質(zhì)優(yōu)于其他 2種栽培模式［4］

，是

目前人參產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要方向。

土壤是人參賴以生存的物質(zhì)基礎(chǔ)，人參根系

與土壤有極大的接觸面，且與土壤之間不斷進行

著物質(zhì)交換［5］

。人參是多年生宿根植物，長期栽

培導致土壤劣變，質(zhì)量下降，影響土壤微生物群落

結(jié)構(gòu)［6］

。根系分泌釋放的有機物對根際微生物群

落組成與結(jié)構(gòu)有顯著影響［7］

，人參栽培改變了森

林土壤的原核微生物群落結(jié)構(gòu)，部分土著微生物

種群消亡的同時，外來微生物種群增加［8］

，重茬人

參真菌病害發(fā)病率升高與其根際分泌物對其病原

真菌的拮抗細菌、拮抗放線菌的生長受到抑制明

顯相關(guān)［9］

。為了促進人參產(chǎn)業(yè)健康有序發(fā)展，解

決隨著生長年限的延長，天然闊葉次生林下栽參

留存率極低的問題，采用Illumina HiSeq高通量測

序技術(shù)，分析天然闊葉次生林下不同種植年限人

參根際微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)，為人參林下種

植應對措施提供理論支撐。

1　材料與方法

1. 1　土壤樣品采集

2020 年 7 月，采用常規(guī)方法從通化縣石湖鄉(xiāng)

天然闊葉次生林下人參栽培基地，采集種植年限

分別為 2，4，7，11，15 年的人參根際土壤樣品，用

K2，K4，K7，K11 和 K15 表示，以未種植人參的地

塊為對照（Kck）。從土壤中采集人參根，去掉表

面大塊土，然后用棉簽輕輕刮取靠近根部表面的

土壤（至少采集8份樣本），從中隨機抽取4個樣本

進行測序和后續(xù)分析。

1. 2 DNA提取與擴增

采用 E.Z.N.A.

?Soil DNA Kit 提取人參根際土

壤樣品中微生物的總 DNA，利用 NanoDrop 2000

超微量紫外分光光度計檢測DNA的濃度和純度，

然后使用1％瓊脂糖凝膠電泳進行質(zhì)量檢測。

細菌以 16S rRNA 基因的 V3-V4 區(qū)為目標序

列，用通用引物 338F（5′-ACTCCTACGGGAGGC

AGCAG-3′）/806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCT

247

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

AAT-3′）進行擴增，擴增產(chǎn)物 468 bp。真菌以內(nèi)

源轉(zhuǎn)錄間隔ITS區(qū)為目標序列，用通用引物ITS1F

（5′-CTTGGTCATTTAGAGAGGAAGTAA-3′）/ITS

2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3）進 行 擴

增，擴增產(chǎn)物300 bp。PCR產(chǎn)物通過2％瓊脂糖凝

膠電泳進行檢測，然后利用 AxyPrep DNA Gel Ex?

traction Kit和QuantiFluorTM-ST進行純化和均一化。

1. 3　擴增產(chǎn)物高通量測序

根據(jù) Majorbio Bio-Pharm Technology Co. Ltd.

的標準程序，將純化的擴增子等摩爾合并，并在

Illumina MiSeq 平臺上進行雙末端測序（PairedEnd）。對測序原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)控和拼接，過濾掉

低質(zhì)量 Reads，將得到的雙端序列拼接成 Tags，同

時去除低質(zhì)量 Tags和嵌合體，得到高質(zhì)量的 Tags

數(shù)據(jù)（Clean Tags）。

1. 4　數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用 UPARSE 對高質(zhì)量序列，按 97％的序列

相似性進行操作分類單位（Operational Taxonomic

Units，OTU）聚類，基于 Silva 16S rRNA 數(shù)據(jù)庫和

Unite ITS基因數(shù)據(jù)庫對OTU進行分類學注釋，置信

度閾值為70％。依據(jù)OTU鑒定結(jié)果，利用Mothur計

算α多樣性指數(shù)；使用Bray-Curtis距離算法計算樣

本之間的距離，并進行β多樣性分析；利用ANOSIM

對PCoA分析進行檢驗。本研究使用t檢驗比較不同

分組的α多樣性指標，統(tǒng)計顯著性設(shè)置為“*”表示

P<0.05，“**”表示P<0.01，“***”表示P<0.001。

2　結(jié)果與分析

2. 1　測序深度分析

從 24 個土壤樣品中共獲得 1 265 109 個細菌

16S rRNA V3-V4 有效序列和 1 466 124 個真菌

ITS有效序列。細菌和真菌序列的平均長分別為

415.37 bp和250.96 bp，高質(zhì)量序列分別以97％的

序列相似性共聚類 7 945 個細菌操作分類單位

（OTUs）和 5 292 個真菌 OTUs。闊葉林下人參根

際真菌群落的有效序列高于細菌群落，但 OTU數(shù)

目明顯低于細菌群落。

通過構(gòu)建細菌和真菌稀釋曲線發(fā)現(xiàn)，每個樣

品的OTUs稀釋曲線接近飽和（圖1-A，B），表明測

序數(shù)據(jù)可用于后續(xù)分析土壤細菌和真菌的多樣性

分析，與細菌相比，真菌的稀疏曲線形狀變化程度

更高。從微生物 OTU 數(shù)目 Venn 圖可見（圖 1-C，

D），與 Kck 相比，人參根際細菌和真菌的 OTU 數(shù)

目普遍增加（K2 細菌除外），其中，K11 微生物

OTU 數(shù)目最多。種植年限 10 年以上的人參根際

細菌 OTU 數(shù)目為 2 602~2 612，而種植年限<10 年

的人參根際細菌OTU數(shù)目為2 442~2 506，表明種

植年限超過 10 年人參根際細菌 OTU 數(shù)目增加。

人參根際真菌除K7的OTU數(shù)目為684外，其他年

限人參根際真菌的 OTU數(shù)目均>818，且差異不顯

著。6 組樣本共有細菌 OTU 占比 28.14%，獨有占

比分別為 2.81%（Kck），2.59%（K2），3.40%（K4），

3.26%（K7），4.73%（K11），4.63%（K15），由此可

見，共有細菌OTU較多，獨有OTU較少。6組樣本

共 有 真 菌 OTU 占 比 8.14%，獨 有 占 比 分 別 為

4.04%（Kck），7.67%（K2），8.48%（K4），4.78%

（K7），11.39%（K11），7.31%（K15），即共有真菌

OTU 較少，獨有 OTU 較多，其中 K11 真菌獨有

OTU最多。

2. 2 α多樣性分析

為估計人參根際微生物群落的 Alpha（α）多

樣性，從數(shù)據(jù)中按最小樣本序列數(shù)對樣本序列進

行抽評。Chao和Shannon指數(shù)分別反映人參根際

土壤微生物群落的豐富度和多樣性（圖 2）。由

圖2可見，與Kck相比，K7和K11的土壤細菌群落

Chao和Shannon指數(shù)顯著增加（P<0.01，P<0.001），

K11 的 Chao 指數(shù)與 Kck 相比差異顯著，K15 的土

壤細菌群落Chao和Shannon指數(shù)無明顯差異。而

真菌群落的Chao和Shannon指數(shù)隨著種植人參的

年限變化不大。

2. 3 β多樣性分析

對土壤微生物群落的細菌科與真菌科水平進

行 β 多樣性分析（圖 3）。由圖 3-A，B 可見，相同

年生人參根際細菌和真菌群落組內(nèi)距離較近，說

明樣本的物種分類和豐富度上相似性較高，而不

同年生人參根際微生物群落組間距離較遠，但不

完全分開。其中，K15 細菌微生物群落與 Kck 完

全分開，群落差異明顯。

由圖 3-C，D 可見，種植年限>10 年的細菌群

落與種植年限2年、4年、7年的細菌和真菌群落距

離較遠，說明細菌和真菌群落組成發(fā)生變化。

K15真菌群落組成與Kck被分為2個不同的簇，說

明真菌群落組成變化明顯。隨種植年限增加，不

同年生真菌群落組成變化不明顯。

248

劉麗娟，等：天然闊葉次生林下不同年生人參根際微生物群落多樣性

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 Journal of Jilin Agricultural University

A,C.細菌；B,D.真菌

圖1　人參根際細菌和真菌的稀釋曲線和OTU水平韋恩圖

Fig. 1 Rarefaction curves and Venn diagram of bacterial and fungal communities in ginseng rhizospheric soil

圖2　人參根際細菌和真菌群落α多樣性分析

Fig. 2 Alpha diversity analysis of bacterial and fungal communities in ginseng rhizospheric soil

249

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

A，B.基于Bray-Curtis距離算法的微生物層次聚類；C，D.根際微生物主成分分析（PCoA）；A，C.細菌；B，D.真菌

圖3　人參根際細菌和真菌群落科水平的β多樣性分析

Fig. 3 Beta diversity analysis of bacterial and fungal communities in ginseng rhizospheric soil

續(xù)圖2

Continued fig. 2

250

劉麗娟，等：天然闊葉次生林下不同年生人參根際微生物群落多樣性

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 Journal of Jilin Agricultural University

2. 4　細菌群落組成與結(jié)構(gòu)

根據(jù)97％的物種相似性，從細菌16S rRNA基

因序列中共鑒定出 36 門，116 綱，281 目，452 科，

832屬，1 928種和7 945個OTU。在36個細菌門類

中，占比0.5%以上的類群有12個（圖4），依次為變

形菌門（Proteobacteria，35.37%），放線菌門（Acti?

nobacteriota，19.25%），酸桿菌門（Acidobacteriota，

15.61%），疣微菌門（Verrucomicrobiota，6.81%），綠

彎菌門（Chloroflexi，5.13%），浮霉菌門（Planctomy?

cetota，3.23%），粘球菌門（Myxococcota，3.08%），

擬桿菌門（Bacteroidota，2.52%），厚壁菌門（Fir?

micutes，2.17%），甲基桿菌門（Methylomirabilota，

2.08%），芽單胞菌門（Gemmatimonadota，1.24%）和

脫硫桿菌門（Desulfobacterota，0.66%）。

A.不同樣品優(yōu)勢細菌門的相對豐度；B.單因素方差分析樣品間的群落組成差異（*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001）

圖4　細菌群落的組成和結(jié)構(gòu)

Fig. 4 Composition and structure of bacterial communities

251

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

單因素方差分析（One-way ANOVA）表明，

12 個優(yōu)勢細菌門中有5個類群的相對豐度隨著人

參生長年限發(fā)生明顯差異，分別為放線菌門，綠彎

菌門，厚壁菌門，芽單胞菌門。6組樣本進行兩組

比較并進行Student′s T檢驗，結(jié)果顯示，優(yōu)勢細菌

門的相對豐度隨著人參生長年限的增長發(fā)生改

變，K2 與 Kck，K15 與 K11，K15 與 Kck 分別有 6，

3，6 個優(yōu)勢細菌門發(fā)生明顯改變（P<0.05），而

K4 與 K2，K7 與 K4，K11 與 K7 優(yōu)勢細菌門沒有明

顯改變。放線菌門相對豐度 K4（22.57%）>K7

（20.76%） >K2 （20.7%） >Kck （19.74%） >K11

（17.59%）>K15（14.16%），放線菌門數(shù)量隨著種植

年限變化呈現(xiàn)先升后降趨勢，K4放線菌數(shù)量達最

大值 22.57%，K7 和 K2 數(shù)值相近，種植 4 年后，隨

種植年限增加逐年降低，種植年限>10年時，放線

菌門數(shù)量降低幅度較大且小于Kck。

在不同年生人參根際土壤中芽孢桿菌屬（Ba?

cillus）相對豐度 Kck（1.24%）>K11（1.23%）>K15

（1.13%）>K4（0.64%）>K2（0.62%）>K7（0.61%），未

種植人參地塊芽孢桿菌屬數(shù)量均大于種植人參地

塊，K4、K2 和 K7 數(shù)相近，種植年限>10年時，芽孢

桿菌屬數(shù)回升至>1.1%，K15略低于 K11。天然闊

葉次生林下種植人參后，芽孢桿菌屬（Bacillus）數(shù)

量均低于未種人參地塊，10年以內(nèi)不同年限間差

異不顯著，與 Kck 組相比明顯下降；10 年以上恢

復到對照狀態(tài)，總體呈現(xiàn)先低后高趨勢。

2. 5　真菌群落組成與結(jié)構(gòu)

人參根際土壤樣品的真菌 OTUs 代表序列經(jīng)

比對鑒定得到16門，67綱，169目，390科，926屬，

1 601 種和 5 292 個 OTU。在門水平上，將相對豐

度<0.1%以及在該水平上沒有注釋結(jié)果的真菌歸

于其他，林下人參根際真菌門主要有 6 個類群

（圖5），分別為擔子菌門（Basidiomycota，49.92%），

子囊菌門（Ascomycota，33.68%），被孢霉門（Mor?

tierellomycota，9.56%），羅茲菌門（Rozellomycota，

3.54%），壺菌門（Chytridiomycota，0.28%）和球囊

菌門（Glomeromycota，0.23%）。

One-way ANOVA 分析結(jié)果表明，6 個優(yōu)勢真

菌門中有3個類群的相對豐度隨著人參生長年限

發(fā)生明顯改變，分別為擔子菌門，子囊菌門，球囊

菌門。6 組樣本進行兩組比較并進行 Student′s T

檢驗，結(jié)果顯示，優(yōu)勢真菌門的相對豐度隨著人參

生 長 年 限 的 增 長 發(fā) 生 改 變 ，球 囊 菌 門 在 Kck

（0.043%），K2（0.574%）， K4（0.132%）中先增加后

減少，K15 的球囊菌門與 Kck 相比，沒有明顯變

化 ；K7 的 擔 子 菌 門 相 對 豐 度 最 高（66.97%），

大 于 Kck（58.2%），其 他 年 限 均 小 于 Kck，K15

（55.51%） >K2 （46.14%） >K11 （39.36%） >K4

（33.34%），呈現(xiàn)先降低后增加，再降低的趨勢，規(guī)

律性不明顯，K15與對照相比，差異不明顯。

A.不同樣品優(yōu)勢真菌門的相對豐度；B.單因素方差分析樣品間的群落組成差異（*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001）

圖5　真菌群落的組成和結(jié)構(gòu)

Fig. 5 Composition and structure of fungal communities

252

劉麗娟，等：天然闊葉次生林下不同年生人參根際微生物群落多樣性

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 Journal of Jilin Agricultural University

3　討 論

隨著科學技術(shù)的不斷發(fā)展，土壤微生物群落

結(jié)構(gòu)研究方法也在不斷改進。利用稀釋平板法進

行土壤微生物的分離，因培養(yǎng)基組成和分離條件

有一定局限性，培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基針對性較強，

且能純培養(yǎng)的土壤微生物的菌株數(shù)只占微生物總

數(shù)的 0.1%~1.0%［10］

，故分離出的微生物種類和數(shù)

量不完全。平板稀釋法是一種產(chǎn)孢真菌的分離方

法，分離到的真菌幾乎全部為絲孢綱真菌，難以真

實反映土壤真菌的生存狀態(tài)與種群分布［11］

。高

通量測序技術(shù)應用于探究并揭示土壤中微生物物

種和群落結(jié)構(gòu)的多樣性［12］

。

利用稀釋平板法進行土壤微生物的分離，認

為種植年限越長，人參根區(qū)土壤真菌濃度越高，細

菌和放線菌的含量越低［13］

，根際微生物種類和數(shù)

量呈增多趨勢［14］

。與本試驗結(jié)果不同的原因是

此法分離出的微生物不全面。野生撫育模式人參

根部內(nèi)生細菌和內(nèi)生真菌的群落豐富度和物種多

樣性較高，而農(nóng)田栽參模式較低［15］

。林下參生長

根區(qū)土壤微生物總量、細菌生物量、真菌生物量及

放線菌生物量與對照相比均有提高，且15年以后

提高的幅度更加明顯［16］

。張鴻雁等［17］

采用稀釋

平板法及皿內(nèi)瓊脂塊法研究不同種植年限（1，5

和7年）人參地土壤樣品中的放線菌生態(tài)得出，隨

種植年限的增加放線菌總數(shù)呈增加趨勢的結(jié)果，

與本試驗結(jié)果不同。分析原因，一是樣品數(shù)量

差別，本試驗樣本種植年限（2，4，7，11和 15年），

有>10 年樣本，張鴻雁等的試驗無此類樣品；二

是測試方法，高通量測序技術(shù)得出的放線菌門數(shù)

量遠大于稀釋平板法。人參栽培引起參地土壤

有機質(zhì)含量［18］

及pH值下降［19］

，土壤酸化嚴重，不

利于人參的生長發(fā)育。放線菌為原核生物生長的

適宜 pH 7.5~8.5

［20］

，種植年限增加引起土壤酸堿

度變化，使環(huán)境不利于放線菌生長，故種植年限>

10年時放線菌數(shù)量降低幅度較大，且低于未種人

參地塊。

天然闊葉次生林下種植人參后，芽孢桿菌屬

（Bacillus）數(shù)量均低于未種人參地塊，10年以內(nèi)不

同年限間差異不顯著，與對照相比下降；10 年以

上恢復到對照狀態(tài)，總體呈現(xiàn)先低后高趨勢。分

析變化原因，與人參生長改變土壤中養(yǎng)分、酸堿

度、土壤酶活性等有關(guān)，具體原因需進一步研究。

天然闊葉次生林下種植人參后，根際土壤中

的細菌、放線菌和真菌數(shù)量比未種人參有所增加；

種植年限>10 年時，根際細菌群落組成發(fā)生明顯

續(xù)圖5

Continued fig. 5

253

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

變化，數(shù)量增加；真菌數(shù)目隨著種植年限增加，但

不呈現(xiàn)明顯趨勢，不同年生真菌群落組成變化不

明顯。K15的細菌和真菌群落組成與 Kck差異明

顯。不同年生放線菌數(shù)量變化較大，總趨勢是先

升后降，種植年限>10 年時降低幅度較大且小于

Kck。

本試驗樣品只采集一個地點的樣品，有一定

的局限性，以后的研究中會增加樣品采集地點，特

別是不同林相。與傳統(tǒng)分子生物學方法相比，高

通量測序技術(shù)能夠更加全面地揭示土壤微生物群

落結(jié)構(gòu)的相關(guān)信息，所得結(jié)果更準確。本研究采

用高通量測序技術(shù)分析土壤微生物，可以詳細、準

確地描述闊葉林下不同年生土壤微生物群落結(jié)

構(gòu)，可為科學合理開展林下人參種植提供參考。

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（責任編輯：林海濤）

254

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 2024，46（2）：255-263 http : // xuebao.jlau.edu.cn

Journal of Jilin Agricultural University E?mail : jlndxb @ vip.sina.com

栽培年限的增加對人參根區(qū)土壤養(yǎng)分及微生物

群落結(jié)構(gòu)的影響*

王天佑1，2

，丁萬隆2

，尹春梅1**，王 蓉2

，李 勇2**

1. 吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，長春 130118；2. 中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研

究所，北京 100193

摘 要：參照相關(guān)行業(yè)標準對不同栽培年限人參根區(qū)土壤pH、電導率及各種營養(yǎng)成分進行測定，并使用分離

培養(yǎng)基對土壤中的真菌、細菌和放線菌進行培養(yǎng)，利用高通量測序技術(shù)對土壤微生物基因組進行分析。結(jié)果

表明：人參的種植會導致土壤酸化，且隨栽培時間的延長，土壤各項營養(yǎng)成分均呈現(xiàn)不同程度降低的趨勢；相

同情況下，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)也會產(chǎn)生一些變化，其中土壤真菌隨栽培年限的升高其數(shù)量呈升高趨勢，細

菌和放線菌數(shù)量呈現(xiàn)降低趨勢；通過皮爾遜相關(guān)性分析可知，土壤養(yǎng)分因子與微生物之間關(guān)系密切，具有統(tǒng)

計學意義（≥0. 2）的相關(guān)性系數(shù)占試驗總數(shù)據(jù)的 84. 62%；測序結(jié)果顯示，變形菌門（Proteobacteria）等是試驗

土壤中的主要細菌門類，栽參會顯著影響土壤細菌群落結(jié)構(gòu)，導致常見的優(yōu)勢菌群相對豐富度降低，并促使

細菌性假絲酵母念珠菌（WPS-2）等有害菌大量繁殖；子囊菌門（Ascomycota）等是真菌群落結(jié)構(gòu)中的主要門

類，栽參會導致真菌的群落構(gòu)成受到影響，常規(guī)菌種相對豐度降低，腐質(zhì)霉屬（Humicola）、鐮刀菌屬（Fusarium）

及土赤殼屬（Ilyonectria）等致病真菌類群大量繁殖且彼此存在共生關(guān)系。綜上，土壤微生物對土壤養(yǎng)分的調(diào)節(jié)

具有積極作用，明確人參根區(qū)土壤微生物的生命活動以及發(fā)展規(guī)律，為促進人參種植產(chǎn)業(yè)的優(yōu)化升級提供理

論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：人參；根區(qū)土壤；土壤養(yǎng)分；微生物數(shù)量；微生物群落結(jié)構(gòu)

中圖分類號：S154. 3；S567. 51 文獻標志碼：A 文章編號：1000-5684（2024）02-0255-09

DOI：10.13327/j.jjlau.2021.1298

引用格式：王天佑，丁萬隆，尹春梅，等.栽培年限的增加對人參根區(qū)土壤養(yǎng)分及微生物群落結(jié)構(gòu)的影響［J］.吉

林農(nóng)業(yè)大學學報，2024，46（2）：255-263.

Effects of Increasing Cultivation Years on Soil Nutrients and Micro?

bial Community Structure in Root Zone of Ginseng *

WANG Tianyou1，2

，DING Wanlong2

，YIN Chunmei1**，WANG Rong2

，LI Yong2**

1. College of Chinese Medicinal Materials， Jilin Agricultural University， Changchun 130118，

China；2. Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences and Pe?

king Union Medical College， Beijing 100193， China

Abstract：Soil pH, electrical conductivity and various nutrients were measured in the root zone of

ginseng with reference to relevant industry standards, and soil fungi, bacteria and actinomycetes were

cultured using isolation media. In the same situation, soil microbial community structure also showed

some changes, among which the number of soil fungi tended to increase with the increase of cultiva?

tion years, and the number of bacteria and actinomycetes tended to decrease; Pilsen correlation

* 基金項目：國家中藥標準化項目（ZYBZH-C-JL-27），中國醫(yī)學科學院醫(yī)學與健康科技創(chuàng)新工程項目（2016-I2M-3-017）

作者簡介：王天佑，男，在讀碩士，研究方向：中藥學。

收稿日期：2021-06-01

** 通信作者：尹春梅，E-mail：18943009604@163.com；李勇，E-mail：liyong@implad.ac.cn

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

analysis showed that there was a close relationship between soil nutrient factors and microorganisms,

and the correlation coefficients with statistical significance (≥0.2) in this study accounted for 84.62%

of the overall data. The results of sequencing showed that Proteobacteria were the main bacterial

phyla in the test soils, and planting ginseng had a significant impact on soil bacterial community

structure, leading to a decrease in the relative abundance of common dominant groups and promoting

the proliferation of harmful bacteria such as WPS-2; Ascomycota were the main bacterial phyla in

the test soils. Ascomycota, which is the main fungal community structure, was affected by planting

ginseng, and the relative abundance of conventional species was reduced, and pathogenic fungal

groups such as Humicola, Fusarium, and Ilyonectria proliferated had symbiotic relationships with

each other. In conclusion, the regulation of soil nutrients by soil microorganisms is positive, and it is

important to clarify life activities and development rules of soil microorganisms, which can provide

theoretical basis for promoting the optimization and upgrading of ginseng cultivation industry.

Key words：ginseng； root zone soil； soil nutrient； quantity of soil microorganisms； soil microbial

community structure

人參（Panax ginseng C. A. Meyer）為五加科多

年生宿根草本植物，為我國傳統(tǒng)名貴中藥材，素有

“百草之王”的美譽［1］

。然而，極強的忌地性制約

了人參產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展，傳統(tǒng)的“伐林栽參”模式

已不適用于當今的社會現(xiàn)況［2］

，老參地重復利用

已然成為人參種植產(chǎn)業(yè)面臨的一大難題。因此，

深入研究人參連作障礙形成機理，加快老參地循

環(huán)再利用，不僅能促進中藥材生產(chǎn)與自然生態(tài)環(huán)

境和諧發(fā)展，還有助于推動人參種植模式優(yōu)化

升級。

大量研究表明［3-6］

，栽參會導致其根區(qū)土壤營

養(yǎng)失衡，而土壤微生物是地上植物群落和土壤養(yǎng)

分循環(huán)聯(lián)系的關(guān)鍵紐帶，可以起到維系植物體自

身健康的重要作用，若土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)驟

變或多樣性降低，將導致土壤營養(yǎng)的轉(zhuǎn)化效率降

低，影響植物體對于養(yǎng)分的吸收與利用［7］

。本研

究通過對我國人參主產(chǎn)區(qū)不同栽培年限人參根區(qū)

土壤pH、電導率、養(yǎng)分含量及菌群動態(tài)進行測定，

利用高通量測序技術(shù)探究土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)

及物種多樣性，分析人參栽培過程中土壤因子的

動態(tài)變化及其相互聯(lián)系，為闡明人參連作障礙發(fā)

生時其根區(qū)土壤的微觀動態(tài)變化以及為老參地的

重復再利用提供科學的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1. 1　試驗樣品采集及前處理

供試2~5年生栽參農(nóng)田土（SP2~SP5）及對照農(nóng)

田土（SPck）均采自遼寧省丹東市寬甸滿族自治縣

雙山子鄉(xiāng)四平村（北緯41°5′14″，東經(jīng)124°45′15″）。

全部土壤樣本采用五點法［8］

取樣，每個樣點隨機

選取 6 株健康生長的人參，小心挖出人參根并收

集根圍土（與主根距離<5 cm），將土壤中石塊、植

物殘體、雜草等剔除干凈，將5點采集的土壤合并

裝入無菌自封袋，記錄對應的人參生長年限。將

冰袋帶回實驗室，立即過 2 mm 篩，鮮樣進行微生

物試驗，風干樣品進行營養(yǎng)元素試驗。

本研究中的試驗地塊實施了集免疫調(diào)節(jié)、促

生拮抗、生物刺激、殺菌劑及植物營養(yǎng)類劑于一體

的肥藥調(diào)控，以保持土壤的養(yǎng)分供給。多數(shù)肥藥

劑量以每 75 m2

施用一單位體積（瓶、袋）為基準

（健達、哈茨木霉和榮亞每3 m2

施用一單位體積）；

所有藥劑均按照使用說明溶解，并以噴灌的方式

施用。除池面消毒外，1~2年生各進行9次肥藥噴

灌，3~5年生進行10次。

1. 2　土壤養(yǎng)分測定

土壤 pH 測定參照 NY/T 1377—2007［9］

；土壤

電導率用電導率儀測定；土壤有機質(zhì)測定參照

NY/T 1121.6—2006［10］

；土壤總氮及總碳測定采用

高溫燃燒法［11］

；土壤全磷及全鉀測定采用ICP定量

法［12］

；土壤堿解氮測定參照 LY/T 1228—2015［13］

；

土壤有效磷測定參照 NY/T 1121.25—2012［14］

；土

壤速效鉀測定參照NY/T 889—2004［15］

。

1. 3　土壤微生物數(shù)量

土壤微生物數(shù)量采用平板稀釋計數(shù)法［16］

測

定。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌、高氏一號合

成培養(yǎng)基培養(yǎng)放線菌、馬丁-孟加拉紅-鏈霉素培

256

王天佑，等：栽培年限的增加對人參根區(qū)土壤養(yǎng)分及微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 Journal of Jilin Agricultural University

養(yǎng)基培養(yǎng)真菌。細菌、放線菌每皿 30~300 個菌

落，真菌每皿 10~100 個菌落為宜。接菌后 28 ℃

恒溫培養(yǎng)（細菌1~2 d，放線菌3~4 d，真菌3~6 d），

菌落計數(shù)并根據(jù)稀釋倍數(shù)折算原始濃度。

微生物濃度（CFU/g）=（相同稀釋度菌落平均

數(shù)×稀釋倍數(shù)）/土壤質(zhì)量。

1. 4　樣品基因組總DNA提取

使用Ultra Clean Soil DNA Isolation Sample Kit

提取土壤樣品微生物總基因組 DNA，具體步驟參

照試劑盒說明書，并將提取后的樣本DNA統(tǒng)一稀

釋至20 ng/μL進行后續(xù)試驗。

1. 5 PCR擴增

以 1% 的凝膠、170 V 電壓和 30 min電泳時間

為基礎(chǔ)條件，進行 25 μL 反應體系［17］和擴增程

序［17］。 對 細 菌 16S V3-V4 區(qū) 域 擴 增 的 引 物 序

列［18］：338F（5′-ACT CCT ACG GGA GGC AGC

AG-3′）和 806R（5′-GGA CTA CHV GGG TWT

CTA AT-3′）；對真菌 ITS1（ITS1-ITS2）區(qū)域擴增

引物序列［19］

：ITS1-F（5′-CTT GGT CAT TTA GAG

GAA GTA A-3′）和 58A2R（5′-TGC GTT CTT CAT

CGA TGC-3′）。

25 μL PCR反應體系包括模板DNA樣品 1.5 μL，

Forward Primer （5 μmol/L） 1 μL，Reverse Primer

（5 μmol/L）1 μL，BSA（2 ng/μL）3 μL，2×Taq Plus

Master Mix 12.5 μL，ddH2O 6 μL。

擴 增 程 序 ：16S V3-V4 區(qū) 為 94 ℃ 預 變 性

5 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸

60 s，28 個循環(huán)；72 ℃維持 7 min，程序結(jié)束后在

4 ℃下保存； ITS1（ITS1-ITS2）區(qū)為 94 ℃預變性

5 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸

60 s，34 個循環(huán)；72 ℃維持 7 min，程序結(jié)束后在

4 ℃下保存。

1. 6 Illumina PE300高通量測序

按指定測序區(qū)域［細菌16S V3-V4，真菌ITS1

（ITS1-ITS2）］，合成帶有 barcode 的特異引物，或

帶有錯位堿基的簡并引物。

全部樣本按照正式試驗條件進行，每個樣本

3 次重復，將同一樣本 PCR 產(chǎn)物混合，2% 瓊脂糖

凝膠電泳檢測 ，AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒

（Axygen公司）切膠回收 PCR產(chǎn)物，Tris HCl洗脫；

2% 瓊脂糖電泳檢測。通過 Miseq PE300 平臺進

行測序（奧維森基因科技有限公司，北京）。

1. 7　數(shù)據(jù)分析

利用 Excel 2016 和 SPSS 20.0 軟件進行數(shù)據(jù)

處理和統(tǒng)計分析；單因素方差分析（ANOVA）比較

不同處理間土壤因子的顯著性差異 ；皮爾遜

（Pearson）相關(guān)分析推測土壤因子間的相互關(guān)系；

土壤微生物獨立豐富度指數(shù)及綜合指數(shù)［20］

計算

方法：土壤微生物獨立豐富度指數(shù)=土壤中某類

型微生物數(shù)/全部土壤樣品中該微生物數(shù)的平均

值；土壤微生物豐富度綜合指數(shù)=（土壤細菌豐富

度指數(shù)+土壤真菌豐富度指數(shù)+土壤放線菌豐富

度指數(shù)）/3。

利用Trimmomatic（v0.36）、Pear（v0.9.6）、Flash

（v1.20）和Vsearch（v2.7.1）軟件對測序后下機得到

的原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)控處理，去除具有N的序列，對

數(shù)據(jù)拼接從而得到Fasta序列，最終與已知數(shù)據(jù)庫

（uchime 方法）和未知數(shù)據(jù)庫（Denovo 方法）完成

比對，以 97% 的相似水平為標準，對序列進行分

類并生成 OTUS，最終采用 RDP Classifier 算法對

OTU 代表序列進行比對，并在不同分類水平上注

釋其群落的物種信息［21-24］

。

2　結(jié)果與分析

2. 1　土壤養(yǎng)分分析

由表 1 可知，本研究中土壤樣品整體偏弱酸

性（pH 5.1~5.4），非栽參土壤（pH 5.4）相較于栽

參農(nóng)田土壤略有改觀，但仍未達到人參最適生長

pH（5.5~6.5）。隨栽培年限增加，土壤 pH 變化極

小；土壤電導率呈現(xiàn)先升高后降低、再升高再降低

的波動性變化；土壤有機質(zhì)、總碳、總氮、全磷和

全鉀的含量均大致呈現(xiàn)降低趨勢；土壤堿解氮的

含量呈先降低后上升再降低趨勢，在人參栽種

3 年后達到峰值（240.42 mg/kg），人參栽種 5 年后

降至 176.90 mg/kg；土壤有效磷和速效鉀的含量

隨栽培年限增加兩者的變化趨勢一致，均呈先降低

后升高趨勢，栽種 4 年后最低（88.01 mg/kg 和

154.77 mg/kg），栽種5年后突然升高（166.79 mg/kg

和606.62 mg/kg）。

257

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

2. 2　土壤微生物量分析

由不同土壤樣本三類微生物的統(tǒng)計結(jié)果可知

（表 2），在土壤樣本中細菌是土壤環(huán)境中最主要

的微生物，占據(jù)三者總量的83.51%~90.98%；隨著

栽培年限的增加，真菌在土壤環(huán)境中占據(jù)的比例

逐漸增加，且不同栽培年限下其含量具有顯著性

差異（P<0.05）；土壤細菌含量隨栽培年限的增加

呈逐漸降低的趨勢，栽參土壤細菌含量顯著低于

非栽參土壤（P<0.05），栽培3年與栽培4年的土壤

細菌含量差異不顯著（P>0.05）；土壤放線菌的含

量隨栽培年限的增加，其在土壤環(huán)境中的比例呈

先升高后降低趨勢，而含量呈逐漸降低趨勢，非栽

參土壤放線菌含量顯著高于栽參土壤（P<0.05），

栽培 2年與栽培 3年的土壤放線菌含量差異不顯

著（P>0.05），栽培4年與栽培5年的土壤放線菌含

量差異不顯著（P>0.05）。

研究發(fā)現(xiàn)（表 3），供試土壤真菌豐富度指數(shù)

隨栽培年限的增加呈逐漸升高趨勢，細菌豐富度

指數(shù)呈逐漸降低趨勢，放線菌豐富度指數(shù)呈逐漸

降低趨勢。供試土壤的整體微生物豐富度指數(shù)隨

栽培年限的增加呈逐漸降低趨勢，其中非栽參土

壤微生物豐富度指數(shù)最高（1.21），栽培5年后土壤

微生物豐富度指數(shù)最低（0.87）。

表1 土壤pH、電導率及養(yǎng)分分布

Table 1 Soil pH， electrical conductivity and nutrient distribution

處理

SPck

SP2

SP3

SP4

SP5

pH

5.43±0.03a

5.12±0.51b

5.11±0.44b

5.22±0.11b

5.21±0.26b

電導率/

(μS·cm-1

)

50.19±0.32d

103.19±0.28b

88.80±0.22c

128.04±0.06a

90.51±0.36c

有機質(zhì)/

(g·kg-1

)

56.47±0.66a

45.41±0.02b

55.09±0.51a

42.92±0.24c

42.93±0.37c

總碳/

(g·kg-1

)

20.77±0.33d

24.39±0.17b

28.12±0.12a

22.90±0.39c

23.34±0.19bc

總氮/

(g·kg-1

)

3.43±0.55a

2.83±0.42c

3.08±0.11b

2.72±0.09c

2.71±0.20c

全磷/

(g·kg-1

)

0.48±0.12a

0.37±0.22c

0.47±0.07a

0.31±0.11d

0.43±0.06b

全鉀/

(g·kg-1

)

9.62±0.77a

9.19±0.62c

9.08±0.59c

9.70±0.69a

9.53±0.08b

堿解氮/

(mg·kg-1

)

223.71±0.13b

211.09±0.05c

240.42±0.16a

185.48±0.43d

176.90±0.59e

有效磷/

(mg·kg-1

)

122.33±0.14b

96.87±0.53c

92.12±0.21d

88.01±0.26e

166.79±0.01a

速效鉀/

(mg·kg-1

)

444.44±0.27b

400.31±0.66c

176.19±0.15d

154.77±0.04e

606.62±0.89a

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差（n=3），同列不同小寫字母表示在 0.05 水平上差異顯著（P<0.05）。下表同

表2　人參根圍土壤微生物種類及數(shù)量

Table 2 Species and quantity of microorganisms in ginseng rhizosphere soil

處理

SPck

SP2

SP3

SP4

SP5

微生物總數(shù)/

(×104

CFU·g

-1

)

519.88

321.04

213.15

180.65

106.26

真菌

數(shù)量/(×104

CFU·g

-1

)

0.18±0.05e

1.34±0.14d

2.25±0.23c

3.35±0.38b

4.26±0.24a

比例/%

0.03

0.42

1.06

1.85

4.00

細菌

數(shù)量/(×106

CFU·g

-1

)

4.73±0.19a

2.78±0.11b

1.78±0.09c

1.59±0.06c

0.92±0.25d

比例/%

90.98

86.59

83.51

88.02

86.58

放線菌

數(shù)量（/ ×105

CFU·g

-1

）

4.67±0.89a

4.17±0.36ab

3.29±0.36b

1.83±0.12c

1.00±0.21c

比例/%

8.98

12.99

15.43

10.13

9.41

表3　土壤微生物豐富度指數(shù)

Table 3 Soil microbial richness index

處理

SPck

SP2

SP3

SP4

SP5

獨立指數(shù)

真菌

0.08

0.59

0.99

1.47

1.87

細菌

2.00

1.18

0.75

0.67

0.39

放線菌

1.56

1.39

1.10

0.61

0.33

綜合指數(shù)

1.21

1.05

0.95

0.92

0.87

258

王天佑，等：栽培年限的增加對人參根區(qū)土壤養(yǎng)分及微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 Journal of Jilin Agricultural University

2. 3　土壤因子相關(guān)性分析

由表 4 可知，具有統(tǒng)計學意義的相關(guān)系數(shù)（≥

0.2）數(shù)據(jù)占到全部相關(guān)系數(shù)的 84.62%，其中土壤

pH與土壤電導率呈顯著負相關(guān)（P<0.05），與總氮

及細菌的含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05），與土壤全

鉀含量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）；土壤電導率與

土壤有機質(zhì)、總碳和細菌含量呈顯著負相關(guān)（P<

0.05），與土壤真菌含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05），

與土壤總氮以及全磷含量呈極顯著負相關(guān)（P<

0.01）；土壤有機質(zhì)含量與土壤總碳、總氮、全磷以

及堿解氮含量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），與土壤

真菌含量呈顯著負相關(guān)（P<0.05），與土壤細菌以

及放線菌含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05）；土壤總碳

含量與土壤總氮、全磷以及堿解氮含量呈極顯著

正相關(guān)（P<0.01），與土壤放線菌含量呈顯著正相

關(guān)（P<0.05）；土壤總氮含量與土壤全磷、堿解氮以

及放線菌含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05），與土壤真

菌含量呈極顯著負相關(guān)（P<0.01），與土壤細菌含

量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）；土壤全磷的含量與

堿解氮含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05）；土壤堿解氮

的含量與土壤真菌含量呈顯著負相關(guān)（P<0.05），

與放線菌含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05）；土壤速效

鉀含量與土壤細菌含量呈顯著負相關(guān)（P<0.05）；

土壤真菌含量與土壤細菌以及放線菌含量呈極顯

著負相關(guān)（P<0.01）；土壤細菌含量與土壤放線菌

含量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）。

2. 4　下機數(shù)據(jù)分析

5 個土壤樣品 16S rDNA V3-V4 區(qū)測序后，對

其下機數(shù)據(jù)進行篩選，共得到 437 653 條優(yōu)質(zhì)序

列，其中 99.79% 分布于 400~440 bp；將優(yōu)質(zhì)序列

用聚類的方式生成 OTUS，以 97% 的相似水平為

標準，共產(chǎn)生 3 727個 OTU，經(jīng)過抽平處理后剩余

3 694 個，其中 SPck~SP5 獨有的 OUT 個數(shù)分別為

705，22，49，50，69，5 個樣本中有 876 個 OUT 發(fā)生

重疊（圖1-A）。

5 個土壤樣品進行 ITS1 測序后，通過篩選得

到 429 137 條優(yōu)質(zhì)序列，其中 88.73% 分布于 200~

260 bp；以同樣的方法將優(yōu)質(zhì)序列生成 OTUS，共

產(chǎn)生1 342個OTU，經(jīng)過抽平處理后剩余1 335個，

其中 SPck~SP5 獨有的 OUT 個數(shù)分別為 144，45，

56，112，62，5 個樣本中有 233 個 OUT 發(fā)生重疊

（圖1-B）。

表4 土壤因子間的皮爾遜相關(guān)性分析

Table 4 Pearson correlation analysis between soil factors

相關(guān)

因子

pH

電導率

有機質(zhì)

總碳

總氮

全磷

全鉀

堿解氮

有效磷

速效鉀

真菌

細菌

放線菌

pH

1

電導率

-0.662*

1

有機質(zhì)

0.380

-0.771*

1

總碳

0.133

-0.653*

0.960**

1

總氮

0.602*

-0.860**

0.961**

0.847**

1

全磷

0.354

-0.891**

0.813**

0.817**

0.780*

1

全鉀

0.870**

-0.222

-0.070

-0.309

0.166

-0.099

1

堿解氮

-0.023

-0.503

0.894**

0.931**

0.777*

0.616*

-0.446

1

有效磷

0.346

-0.400

-0.199

-0.235

-0.093

0.363

0.320

-0.492

1

速效鉀

-0.572

0.081

-0.305

-0.104

-0.437

0.200

-0.585

-0.205

0.543

1

真菌

-0.410

0.623*

-0.722*

-0.577

-0.800**

-0.396

-0.040

-0.727*

0.360

0.556

1

細菌

0.674*

-0.707*

0.659*

0.448

0.812**

0.392

0.349

0.530

-0.158

-0.647*

-0.946**

1

放線菌

0.248

-0.555

0.707*

0.603*

0.747*

0.378

-0.130

0.785*

-0.431

-0.465

-0.985**

0.877**

1

注：“*”表示顯著相關(guān)；“**”表示極顯著相關(guān)

259

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

2. 5　土壤細菌和真菌的物種組成及多樣性

土壤樣品中的細菌在門水平上的組成見

圖 2-A，測序比對后共得到 37 個門類，以相對豐

度>1%為基準進行篩選后剩余15個，其中變形菌

門（Proteobacteria，29.38%）、酸桿菌門（Acidobac?

teriota，20.05%）、綠彎菌門（Chloroflexi，12.93%）、

放線菌門（Actinobacteriota，9.74%）、班氏菌門（Pa?

tescibacteria，5.51%）、細菌門（Gemmatimonadota，

4.84%）、擬桿菌門（Bacteroidota，3.86%）、粘球菌

門（Myxococcota，3.49%）、疣微菌門（Verrucomicro?

biota，3.19%）9 門 為 主 要 門 類 ；與 非 栽 參 土 壤

（SPck）相比，栽參后土壤（SP2~SP5）中均產(chǎn)生細

菌性假絲酵母念珠菌（WPS-2）；匿桿菌門（Lates?

cibacterota）、甲烷氧化菌門（Methylomirabilota）和

硝化螺旋菌門（Nitrospirota）只能在 SPck 中檢出，

而在 SP2~SP5 中無法檢出；迷蹤菌門（Elusimicro?

biota）只可以在 SPck 和 SP4 中檢出；蛭弧菌門

（Bdellovibrionota）只能在SP3中檢出。此外，測序

結(jié)果在綱水平上共得到 102 綱，相對豐度>1% 的

有24個；在目水平上共得到203目，相對豐度>1%

的有38個；在科水平共得到250科，相對豐度>1%

的有 32個；在屬水平上共得到 371屬，相對豐度>

1%的有26個。

同理，土壤真菌測序比對后在門水平上得到

14個門類，以相對豐度>1%為基準并除去無法辨

別的門類（1.90%）后剩余 5 個，分別為子囊菌門

（Ascomycota，71.59%）、被孢霉門（Mortierellomy?

cota，18.71%）、擔子菌門（Basidiomycota，5.19%）、

球 囊 菌 門（Glomeromycota，2.74%）和 羅 茲 菌 門

（Rozellomycota，1.11%）；全部樣品均檢出子囊菌

門、被孢霉門和擔子菌門，其中SPck這3種菌的相

對豐度由大到小為子囊菌門>擔子菌門>被孢霉

門，而另外4組樣品這3種菌的相對豐度由大到小

均為子囊菌門>被孢霉門>擔子菌門；SP2~SP5 中

被孢霉門的相對豐富均遠高于 SPck；在栽參后，

土壤中子囊菌門的相對豐度呈現(xiàn)降低趨勢，最低

為 SP4，僅為 58.13%；SP2、SP3 和 SP4 均有球囊菌

門檢出，而另外 2 組沒檢出；僅有 SP5 檢出羅茲

菌門。此外，測序結(jié)果在綱水平上共得到 41綱，

相對豐度>1% 的有 11 個；在目水平上共得到

100目，相對豐度>1%的有13個；在科水平共得到

189科，相對豐度>1%的有13個；在屬水平上共得

到331屬，相對豐度>1%的有11個（圖2-B）。

由斯皮爾曼關(guān)聯(lián)分析可知（圖 3），細菌以變

形 菌 門（Solicoccozyma）中 的 羅 河 桿 菌 屬（Rho?

danobacter）富集最多；樣品中真菌以在子囊菌門

（Ascomycota）中 的 腐 質(zhì) 霉 屬（Humicola）富 集最

多，且其與鐮刀菌屬（Fusarium）以及土赤殼屬

（Ilyonectria）三 者 間 達 成 共 生 關(guān) 系 ，鐮 刀 菌屬

（Fusarium）與木霉屬（Trichoderma）之間呈正相關(guān)

關(guān)系；除此之外，Cladophialophora 與 Cadophora 以

及 Solicoccozyma 三者之間存在共生關(guān)系，Discosia

與 Pseudoanungitea間呈正相關(guān)關(guān)系，Cadophora與

Solicoccozyma 以及 Paraglomus 三 者 間 存 在 共 生

關(guān)系。

圖1　樣本優(yōu)質(zhì)序列分布圖及OUT聚類韋恩圖

Fig. 1 Sample quality sequence distribution and OUT clustering Venn diagram

260

王天佑，等：栽培年限的增加對人參根區(qū)土壤養(yǎng)分及微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 Journal of Jilin Agricultural University

A.土壤細菌群落相對豐度圖；B.土壤真菌群落相對豐度圖

圖2　細菌及真菌群落組成相對豐度圖

Fig. 2 Relative abundance diagram of bacterial and fungal community composition

點的大小代表豐度的大小，線的粗細代表相關(guān)性大??；點的顏色代表所屬門，線為紅色表示呈正相關(guān)，藍色表示呈負相關(guān)

圖3　細菌及真菌斯皮爾曼關(guān)聯(lián)分析網(wǎng)絡圖

Fig. 3 Spearman correlation analysis network of bacteria and fungi

261

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

3　討 論

本研究通過對土壤 pH、電導率、C、N、P、K 含

量的測定發(fā)現(xiàn)，土壤樣品整體偏酸性，這與戴中

民［25］

和李芳明等［26］

的報道一致。隨栽培年限增

加，土壤電導率的變化波動較大，土壤有機質(zhì)、總

碳、總氮、全磷、全鉀和堿解氮的含量均呈現(xiàn)不同

程度的降低趨勢，但土壤全磷、有效磷和速效鉀的

含量在栽種5年后突然升高，分別相較于第4年升

高 0.12 g/kg，78.78 mg/kg 和 451.85 mg/kg。人參

對養(yǎng)分的需求在第4，5年時會比較大，5年生根區(qū)

土壤中的養(yǎng)分含量應低于 4 年生人參根區(qū)土壤，

造成這一結(jié)果推測與收獲年份為保證人參產(chǎn)量而

采取的人為水肥干預有關(guān)。通過全國第二次土壤

普查［27］

可知，本試驗中個別樣本存在磷鉀素過高

的情況，應及時預防可能由土壤營養(yǎng)元素失

衡［28-29］

而帶來的負面影響。

土壤微生物在地上植物體的生長發(fā)育以及土

壤產(chǎn)能方面具有重要作用［30-32］

。本研究發(fā)現(xiàn)，隨

著栽培年限的增加，真菌數(shù)量及其在土壤環(huán)境中

所占比例逐漸增加，而細菌和放線菌逐漸降低，土

壤中微生物豐富度綜合指數(shù)隨種植人參年限的增

加而逐漸降低，這與趙東岳等［33］

的研究一致。皮

爾遜相關(guān)性結(jié)果顯示，土壤因子間存在互相影響

的作用，微生物對于土壤的調(diào)節(jié)十分明顯，真菌數(shù)

量僅與土壤全鉀含量極弱相關(guān)，細菌數(shù)量僅與土

壤有效磷含量極弱相關(guān)，放線菌數(shù)量僅與土壤全

鉀含量極弱相關(guān)，與其他各因子至少存在弱相關(guān)。

由此可知，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的失衡是人參種

植所造成的土壤劣化中重要的因素之一。

現(xiàn)代分子生物學技術(shù)的飛速發(fā)展，為探索微

觀世界帶來了契機。本研究運用高通量測序技

術(shù)，進一步挖掘土壤微生物在栽參時間增加時產(chǎn)

生的種群結(jié)構(gòu)以及物種多樣性變化。在保證測

序樣品的質(zhì)量合格以及下機數(shù)據(jù)達標的前提下，

結(jié)果顯示，土壤樣品細菌共得到37門102綱 203目

250 科 371 屬，經(jīng)過篩選后分別剩余 15 門 24綱

38目 32科 26屬。栽參會對土壤微生物群落構(gòu)成

造成明顯影響，主要在于細菌性假絲酵母念珠菌

（WPS-2）等致病菌大量滋生。匿桿菌門（Latesci?

bacterota）、甲烷氧化菌門（Methylomirabilota）和硝

化螺旋菌門（Nitrospirota）只能在非栽參土壤中檢

出，而在栽參土壤中無法檢出，且種植人參以后的

土壤優(yōu)勢菌群及土著原核微生物種群的相對豐度

會逐漸降低，這與張偉等［34］

的研究一致。以上結(jié)

果表明，栽參后的土壤細菌群落結(jié)構(gòu)平衡被打破，

物種多樣性降低。

本研究中土壤真菌共得到 14 門 41 綱 100 目

189 科 331 屬，經(jīng)過篩選后分別剩余 5 門 11 綱

13目 13科 11屬。栽參后的土壤真菌群落相對豐

度變化很明顯，物種組成以及優(yōu)勢種的劃分也出

現(xiàn)了偏移，主要表現(xiàn)為子囊菌門（Ascomycota）的

相對豐度顯著降低，被孢霉門（Mortierellomycota）

的相對豐度顯著升高，且栽參會導致球囊菌門

（Glomeromycota）和 羅 茲 菌 門（Rozellomycota）的

滋生。本研究中，樣品中的真菌以在子囊菌門

（Ascomycota）中的腐質(zhì)霉屬（Humicola）富集最多，

且其與鐮刀菌屬（Fusarium）以及土赤殼屬（Ilyo?

nectria）三者間達成共生關(guān)系，證明這與劣化后的

土壤加劇人參根部土傳病害息息相關(guān)。

綜上，人參栽培過程中土壤環(huán)境劣化以及病

原物含量的增加，是人參連作障礙形成的主要原

因之一。

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（3）：298-306

（責任編輯：林海濤）

263

http : // xuebao.jlau.edu.cn

E?mail : jlndxb @ vip.sina.com

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 2024，46（2）：264-271

Journal of Jilin Agricultural University

氮磷鉀配施對朝鮮淫羊藿產(chǎn)量和質(zhì)量的影響*

張 碩1，2

，張永剛1，2**，楊利民1，2

，韓 梅1，2

1. 吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，長春 130118；2. 吉林省生態(tài)恢復與生態(tài)系統(tǒng)管理重點實驗室，

長春130118

摘 要：采用D-飽和最優(yōu)設(shè)計，建立朝鮮淫羊藿葉產(chǎn)量與氮磷鉀配施的回歸模型，并結(jié)合因素頻率分布，研究

氮磷鉀配施對朝鮮淫羊藿葉產(chǎn)量及淫羊藿苷和總黃酮 2種質(zhì)量指標含量的影響。在盛花期和初果期磷肥對

產(chǎn)量貢獻最大，果熟期氮肥對產(chǎn)量貢獻最大，而在果后的綠葉期鉀肥對產(chǎn)量的貢獻最大。尋優(yōu)結(jié)果表明：每株

葉產(chǎn)量>1 g，95% 置信區(qū)間所對應的優(yōu)化施肥量為 N 12. 89~17. 30 kg/667m2

、P2

O5 16. 45~19. 90 kg/667m2

、

K2

O 17. 24~20. 82 kg/667m2

；淫羊藿苷含量>1%，95%置信區(qū)間所對應的優(yōu)化施肥量為N 6. 46~15. 80 kg/667m2

、

P2

O5 8. 88~17. 26 kg/667m2

、K2

O 9. 35~19. 25 kg/667m2

；總黃酮含量>20%，95% 置信區(qū)間所對應的優(yōu)化施肥量

為 N 12. 83~18. 57 kg/667m2

、P2

O5 12. 85~18. 32 kg/667m2

、K2

O 16. 78~21. 01 kg/667m2

。合理的氮磷鉀配施不

僅能促進朝鮮淫羊藿單株葉片產(chǎn)量的提高，而且對于保證其藥材質(zhì)量具有明顯作用。綜合考慮氮磷鉀配施

對朝鮮淫羊藿產(chǎn)量和質(zhì)量的影響，得出朝鮮淫羊藿優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)的施肥量為N 12. 89~15. 80 kg/667m2

、P2

O5 16. 45~

17. 26 kg/667m2

、K2

O 17. 24~19. 25 kg/667m2

，N、P2

O5

、K2

O的最優(yōu)施肥量配比為1∶（1. 04~1. 34）∶（1. 34~1. 49）。

關(guān)鍵詞：朝鮮淫羊藿；飽和最優(yōu)設(shè)計；肥效模型；產(chǎn)量；質(zhì)量；多元回歸分析

中圖分類號：S567. 2 文獻標志碼：A 文章編號：1000-5684（2024）02-0264-08

DOI：10.13327/j.jjlau.2020.5881

引用格式：張碩，張永剛，楊利民，等 . 氮磷鉀配施對朝鮮淫羊藿產(chǎn)量和質(zhì)量的影響［J］. 吉林農(nóng)業(yè)大學學報，

2024，46（2）：264-271.

Effects of N, P and K Combined Application on Yield and Quality of

Epimedium koreanum *

ZHANG Shuo1，2

，ZHANG Yonggang1，2**，YANG Limin1，2

，HAN Mei1，2

1. College of Chinese Medicinal Materials， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China；

2. Key Laboratory of Ecological Restoration and Ecosystem Management of Jilin Province， Changchun

130118， China

Abstract：To explore the optimal application rate of nitrogen (N), phosphorus (P) and potassium (K)

in the cultivation of Epimedium koreanum, and to provide theoretical basis for the rational fertiliza?

tion for E.koreanum. the D-saturation optimal design was adopted to establish a regression model be?

tween the yield of E. koreanum leaves and the application of N, P and K. The effects of N, P dand K

application on the yield leaves and icariin and total flavonoids of Epimedium koreanum were studied

in combination with frequency distribution of factors. The contribution of phosphorus fertilizer to the

yield was the largest in the flowering stage and the early fruit stage; The contribution of nitrogen fer?

* 基金項目：國家中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-21），吉林省重點科技研發(fā)項目（20180201038YY），吉林省科技發(fā)展計劃

項目（20170307025YY，20200404006YY）

作者簡介：張碩，女，碩士研究生，主要從事野生植物栽培研究。

收稿日期：2020-06-16

** 通信作者：張永剛，E-mail：zhyg4579@126.com

張碩，等：氮磷鉀配施對朝鮮淫羊藿產(chǎn)量和質(zhì)量的影響

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 Journal of Jilin Agricultural University

tilizer was the largest in the ripening stage; The contribution of potassium fertilizer was the largest in

the green leaf stage. The results of the frequency analysis showed that the optimal fertilizer applica?

tion of N, P2O5 and K2O were 12.89-17.30 kg/667m2

, 16.45-19.90 kg/667m2

and 17.24-20.82 kg/

667m2

for the target leaves yield over 1 g per plant and confidence interval of 95%, respectively.

Those were 6.46-15.80 kg/667m2

, 8.88-17.26 kg/667m2

and 9.35-19.25 kg/667m2

for the icariin

content over 1% and confidence interval of 95%, and 12.83-18.57 kg/667m2

, 12.85-18.32 kg/667m2

and 16.78-21.01 kg/667m2

for the total flavonoid content over 20% and confidence interval of 95%,

respectively. Reasonable application of N, P and K can not only improve leaf yield, but also play an

important role in ensuring the quality of E. koreanum. Comprehensively taking into account the ef?

fects of N, P and K application on the yield and quality of E. koreanum, we can conclude that the op?

timal fertilization rates for high-quality production of E. koreanum are N 12.89-15.80 kg/667m2

, P2O5

16.45-17.26 kg/667m2

, and K2O 17.24-19.25 kg/667m2

, respectively, and the optimal fertilization

ratio of N∶P2O5

∶K2O is 1∶（1.04-1.34）∶（1.34-1.49）.

Key words：Epimedium koreanum； saturation optimal design； fertilizer efficiency model； yield；

quality； multiple regression analysis

朝鮮淫羊藿（Epimedium koreanum Nakai）為

小檗科多年生草本植物，主要分布于中國長白山、

日本沿海岸、朝鮮北部。以葉入藥，含有淫羊藿

苷、朝藿定 A、B、C 等黃酮類藥效成分，具有補腎

陽，強筋骨，祛風濕等功效［1］

。朝鮮淫羊藿作為中

藥淫羊藿的重要基原之一，市場需求量大，但朝鮮

淫羊藿的有性生殖能力較弱，主要以無性繁殖維

持種群更新與增長，市場藥材供應主要來自野生

資源，其采擷和使用量已超過自然資源的再生能

力，繁殖系數(shù)低、容易退化和變種、人工栽培技術(shù)

不完善等問題較突出，致使其生存和增長更新受

到威脅［2-4］

。因此，開展朝鮮淫羊藿人工栽培生產(chǎn)

是緩解野生資源壓力，實現(xiàn)資源可持續(xù)利用的有

效方法。目前，朝鮮淫羊藿在栽培技術(shù)方面已有

一定研究［5-9］

，但有關(guān)朝鮮淫羊藿合理施肥的研

究，特別是氮磷鉀配比施肥對朝鮮淫羊藿產(chǎn)量和

品質(zhì)的影響尚未見報道。因此，本研究采用D-飽

和最優(yōu)試驗設(shè)計，探討氮磷鉀肥料對朝鮮淫羊藿

葉產(chǎn)量、淫羊藿苷及總黃酮積累中的影響，為提出

合理施肥方案，進一步完善朝鮮淫羊藿種植技術(shù)，

實現(xiàn)規(guī)范化生產(chǎn)提供科學依據(jù)和技術(shù)支撐。

1　材料與方法

1. 1　試驗地概況

試驗地位于吉林農(nóng)業(yè)大學藥用植物園（東經(jīng)

125°27′，北緯 43°46′），具有典型的長春市地區(qū)氣

候特征，屬北溫帶大陸性季風氣候。年平均氣溫

4.8 ℃，最熱月平均氣溫 25 ℃，最冷月平均氣溫

-15 ℃，年平均降水量 522～615 mm，夏季降水量

占全年降水量的 60%，無霜期為 145 d，土壤類型

為暗棕色砂壤土。土壤背景值有機質(zhì)3.8%，堿解

氮145 mg/kg，速效磷430 mg/kg，速效鉀59 mg/kg，

pH 7.67。

1. 2　試驗材料

供試朝鮮淫羊藿由采自吉林省臨江市錯草溝

的野生朝鮮淫羊藿根莖繁殖而來。采集的野生朝

鮮淫羊藿根莖，經(jīng)選取修剪一致后，朝鮮淫羊藿行

距 10 cm，株距 10 cm，種植于吉林農(nóng)業(yè)大學藥用

植物園，長勢均勻。供試氮肥選用尿素（含 N

46%），磷肥選用過磷酸鈣（含 P2O5 12%），鉀肥選

用硫酸鉀（含K2O 50%）。

1. 3　試驗方法

本試驗采用氮（N）、磷（P）、鉀（K）3 因子 5 水

平“311-B”D-飽和最優(yōu)設(shè)計。氮磷鉀施肥配比方

法見表 1，試驗設(shè) 11個處理，增加 1個最低編碼值

處理作為對照。為保持原方案的優(yōu)良性，新增處

理不參加回歸分析。試驗3次重復，隨機排列，小

區(qū)面積 10 m2

，小區(qū)間埋入 50 cm 深的地膜作為隔

離層，防止水肥相互滲透。覆蓋一層遮陰網(wǎng)，透光

率為70%。氮、磷、鉀肥料均在朝鮮淫羊藿返青前

一次性施入。試驗期間采用滴灌等量供水，保持

各處理水分供給一致。

在前期研究的基礎(chǔ)上［9］

，并結(jié)合田間調(diào)查，于

朝鮮淫羊藿盛花期（5 月中旬）、初果期（6 月上

265

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

旬）、果熟期（6 月下旬）、綠葉期（7 月中旬），隨機

采集每處理植株 30 株。60 ℃烘箱中烘干至恒

重，稱取葉片干質(zhì)量后，將葉片粉碎，過 0.6 mm

（30 目）篩備用，本研究中葉產(chǎn)量為單株葉干質(zhì)

量。參照《中國藥典》（2015年版）方法［1］

測定淫羊

藿苷和總黃酮含量。試驗數(shù)據(jù)分析采用 Excel

2007和DPS v7.05軟件進行。

2　結(jié)果與分析

2. 1　葉產(chǎn)量回歸模型的建立

表 2 為不同時期不同處理朝鮮淫羊藿葉產(chǎn)

量、淫羊藿苷、總黃酮測定結(jié)果。以氮、磷、鉀編碼

值（表1）為自變量，葉產(chǎn)量為因變量，進行三元二

次回歸分析，得出朝鮮淫羊藿葉產(chǎn)量與氮磷鉀施

用量之間的回歸模型。表3式中Y為葉產(chǎn)量，N為

施氮量，P為施磷量，K為施鉀量。經(jīng)檢驗，模型回

歸關(guān)系顯著，均屬于典型肥效模型，能夠反映氮、

磷、鉀施入量與葉產(chǎn)量之間的相關(guān)關(guān)系，可對葉產(chǎn)

量進行預測。

表1　朝鮮淫羊藿氮磷鉀配比設(shè)計

Table 1 Ratio design of N， P and K in E. koreanum

處理

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

ck

編碼值

N

0

0

-0.751

2.106

0.751

-2.106

0.751

2.106

-0.751

-2.106

0

-2.106

P

0

0

2.106

0.751

-2.106

-0.751

2.106

-0.751

-2.106

0.751

0

-2.106

K

2.45

-2.45

1

1

1

1

-1

-1

-1

-1

0

-2.45

施肥量（/ kg·667m-2

）

N

15.01

15.01

9.67

30.02

20.34

0

20.34

30.02

9.67

0

15.01

0

P2

O5

15.01

15.01

30.02

20.34

0

9.67

30.02

9.67

0

20.34

15.01

0

K2

O

30.02

0

21.14

21.14

21.14

21.14

8.87

8.87

8.87

8.87

15.01

0

表2　不同氮磷鉀配比對朝鮮淫羊藿葉產(chǎn)量和有效成分含量的影響

Table 2 Effects of different ratios of N， P and K on yield and bioactive components of E. koreanum

處理

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

ck

單株葉產(chǎn)量/g

盛花期

0.630

0.533

0.722

0.709

0.398

0.444

0.672

0.565

0.261

0.545

0.623

0.215

初果期

0.853

0.756

0.956

0.912

0.738

0.662

0.813

0.836

0.662

0.782

0.944

0.556

果熟期

0.815

0.665

0.934

1.118

0.778

0.963

0.995

1.088

0.660

0.763

1.230

0.574

綠葉期

1.160

0.730

1.172

1.108

0.948

1.063

1.030

1.005

0.683

0.877

1.235

0.529

綠葉期

淫羊藿苷含量/%

0.826

0.885

0.585

0.808

0.996

0.838

0.685

0.647

0.758

1.215

0.629

0.779

總黃酮含量/%

23.583

13.602

19.113

16.417

19.811

14.559

19.336

21.872

16.633

22.326

20.957

21.020

266

張碩，等：氮磷鉀配施對朝鮮淫羊藿產(chǎn)量和質(zhì)量的影響

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 Journal of Jilin Agricultural University

2. 2　葉產(chǎn)量模型的單因素效應分析

2. 2. 1 主因子效應分析 分析回歸模型中的一

次項偏回歸系數(shù)，對葉產(chǎn)量的影響次序表現(xiàn)為模

型（1）和（2）中 P>N>K；模型（3）中 N>P>K；模型

（4）中 K>P>N，說明朝鮮淫羊藿盛花期和初果期

磷肥對產(chǎn)量貢獻最大，果熟期氮肥對產(chǎn)量貢獻最

大，而在果后綠葉期鉀肥對產(chǎn)量的貢獻最大。模

型中二次項系數(shù)均為負值，說明過多施肥既浪費

又降低增產(chǎn)效果。

2. 2. 2 單因素效應分析 為進一步探討各因素

的單獨效應，對回歸模型進行降維，將3因素中任

意2個因素固定為零水平，可得到剩余1個因素對

產(chǎn)量的一元二次子模型，即分別得到氮、磷、鉀與

產(chǎn)量的單因素效應方程，本研究中該系列方程所

示的各因素的產(chǎn)量效應均為開口向下的拋物線。

各拋物線的頂點是各單因素的最高產(chǎn)量值及其對

應的最佳施肥量。由表 3 可知，盛花期相對其他

時期，肥料高投入量獲得高產(chǎn)量；果熟期、綠葉期

最高產(chǎn)量趨于穩(wěn)定。鑒于實際生產(chǎn)中果熟期處

于生殖生長期，從獲取種子角度不宜采收，因此，

本文對果后的綠葉期進行重點分析。綠葉期因

素對產(chǎn)量的一元二次子模型為YN=1.235+0.023N0.033N2

；YP=1.235+0.0571P-0.047P2

；YK=1.235+

0.088K-0.048K2

。

從圖 1 中看出，朝鮮淫羊藿產(chǎn)量的氮磷鉀單

因素效應均為拋物線，產(chǎn)量均隨著施用量的增加

而增加，到達最適投入量時，產(chǎn)量最高。但投入量

繼續(xù)加大，產(chǎn)量則隨之減小。分析得出，在該階段

下，達到最大產(chǎn)量時，氮的最佳投入量為0.344（編

碼值），換算為實際用量 17.46 kg/667m2

，此時單

株產(chǎn)量可達 1.239 g；磷的最適投入量為 0.604（編

碼值），即 19.31 kg/667m2

，此時單株產(chǎn)量可達

1.252 g；鉀的最適投入量為 0.906（編碼值），即

20.56 kg/667m2

，此時單株產(chǎn)量可達1.275 g。

2. 2. 3 單因素邊際分析 對綠葉期單因素效應

方程求一階偏導，分別得到氮磷鉀的各因素的邊

際效應方程：dy/dx=0.023-0.066N；dy/dx =0.057-

0.095P；dy/dx =0.088-0.097K。

將不同編碼值代入，令 dy/dx=0，求得各因素

的邊際產(chǎn)量效應隨著投入量增加的變化情況。從

圖2中看出，氮、磷、鉀3因素邊際效益隨投入量的

表3 氮磷鉀施肥編碼值與不同生育時期朝鮮淫羊藿葉產(chǎn)量的多元回歸分析

Table 3 Multiple regression analysis of N， P and K fertilization code value and dry weight of E. koreanum in differ?

ent growth stages

生育

時期

盛花期

初果期

果熟期

綠葉期

養(yǎng)分

N

P2

O5

K2

O

N

P2

O5

K2

O

N

P2

O5

K2

O

N

P2

O5

K2

O

回歸方程

（1）

Y=0.623+0.025N+0.084P+0.019K-0.013N2

-

0.022P2

-0.007K2

-0.018NP-0.011NK-0.002PK

（2）

Y=0.944+0.030N+0.046P+0.021K-0.024N2

-

0.026P2

-0.023K2

-0.021NP+0.007NK+0.018PK

（3）

Y=1.230+0.057N+0.045P+0.033K-0.029N2

-

0.066P2

-0.082K2

+0.014NP-0.036NK-0.001PK

（4）

Y=1.235+0.023N+0.057P+0.088K-0.033N2

-

0.047P2

-0.048K2

-0.009NP-0.030NK-0.006PK

R2

0.999 9

0.998 1

0.999 6

0.999 9

F值

3 255.39

576.52

317.40

17 635.29

P值

0.014

0.032

0.044

0.006

編碼值

0.925

1.933

1.379

0.607

0.897

0.446

0.990

0.347

0.200

0.344

0.604

0.906

最佳施肥量

（kg·667m-2

）

21.60

28.78

23.45

19.33

21.40

17.74

22.06

17.48

16.23

17.46

19.31

20.56

單株

產(chǎn)量/g

0.635

0.704

0.637

0.953

0.965

0.948

1.258

1.238

1.233

1.239

1.252

1.275

圖1　葉產(chǎn)量的氮磷鉀單因素效應

Fig. 1 Single effect of N， P and K on leaf yield

267

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 2024 年 4 月

Journal of Jilin Agricultural University 2024，April

增加均呈遞減趨勢，以施鉀、施磷量的邊際效益遞

減率大，說明磷鉀投入量很低時，效益增加明顯，

對產(chǎn)量影響明顯較大，起主導作用；隨投入量的增

加，邊際效益遞減，與x軸相交（P：0.604，K：0.906）

之處為最適投入量，以后隨著投入量的增加，邊際

效益遞減，甚至出現(xiàn)負效益。氮肥的邊際效益遞

減率比磷肥、鉀肥小，說明此階段單位水平氮肥投

入量引起邊際產(chǎn)量的減少量小，對朝鮮淫羊藿增

產(chǎn)的影響小于磷肥、鉀肥。

2. 2. 4 交互作用效應分析 產(chǎn)量回歸模型中，

氮磷、氮鉀和磷鉀的交互項偏回歸系數(shù)均達顯著

水平，說明各因素間對產(chǎn)量存在顯著的交互效應。

從圖 3 中可以看出，在編碼值內(nèi)，氮磷、氮鉀和磷

鉀對產(chǎn)量的交互效應均呈拋物線曲面，產(chǎn)量先升

高后降低，符合報酬遞減定律。對氮而言，鉀的交

互效應大于磷；對磷而言，鉀的交互效應大于氮；

對鉀而言，磷的交互效應大于氮。三因素互作效

應對朝鮮淫羊藿葉片產(chǎn)量影響表現(xiàn)為磷鉀>氮

鉀>氮磷。某一單因素的偏高或偏低均不利于產(chǎn)

量的形成，優(yōu)化各因素投入量可提升產(chǎn)量。

圖2　單因素邊際效益

Fig. 2 Marginal benefit of each factor

2. 3　施肥方法的選優(yōu)

在分析各單項因素效應的基礎(chǔ)上，經(jīng)過優(yōu)化

方法模擬尋優(yōu)，得出單株葉產(chǎn)量>1 g 的施肥方法

（表 4），淫羊藿苷含量>1%的施肥方法（表5）和總

黃酮含量>20%的施肥方法（表6）。從表中看出，

當 施 氮 量 12.89~17.30 kg/667m2

、施磷量 16.45~

19.90 kg/667m2

、施鉀量 17.24~20.82 kg/667m2 時

單株葉產(chǎn)量>1 g；當施氮量 6.46~15.80 kg/667m2

、

施 磷 量 8.88~17.26 kg/667m2

、施 鉀 量 9.35~

19.25 kg/667m2 時 淫 羊 藿 苷 含 量 >1% ；當 施

氮 量 12.83~18.57 kg/667m2

、施 磷 量 12.85~

18.32 kg/667m2

、施鉀量 16.78~21.01 kg/667m2

時

總黃酮含量>20%。通過分析對比，綜合考慮產(chǎn)

量和品質(zhì)，同時滿足單株葉產(chǎn)量>1 g、淫羊藿苷

含量>1%、總黃酮含量>20% 的施肥量為最優(yōu)施

肥方法，通過取交集得出，朝鮮淫羊藿優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)的施

肥量：施氮量12.89~15.80 kg/667m2

、施磷量16.45~

17.26 kg/667m2

、施 鉀 量 17.24~19.25 kg/667m2

，

N∶P2O5

∶K2O的最優(yōu)施肥量配比為1∶（1.04~1.34）∶

（1.34~1.49）。

圖3　交互作用分析

Fig. 3 Interaction effect analysis

268

張碩，等：氮磷鉀配施對朝鮮淫羊藿產(chǎn)量和質(zhì)量的影響

吉林農(nóng)業(yè)大學學報 Journal of Jilin Agricultural University

表4　朝鮮淫羊藿單株葉產(chǎn)量超過1 g的因素頻率分布

Table 4 Frequency distribution of factors for target yield of E. koreanum content over 1 g per plant

項目

加權(quán)平均數(shù)

標準誤

95%置信區(qū)間

施肥量（/ kg·667m-2

）

N

水平

-2.106

-0.751

0

0.751

2.106

0.012

0.158

-0.298~0.321

12.89~17.30

次數(shù)

10

14

16

15

10

頻率

0.154

0.215

0.246

0.231

0.154

P2

O5

水平

-2.106

-0.751

0

0.751

2.106

0.444

0.123

0.203~0.686

16.45~19.90

次數(shù)

0

16

18

18

13

頻率

0

0.246

0.277

0.277

0.200

K2

O

水平

-2.45

-1

0

1

2.45

0.658

0.149

0.365~0.950

17.24~20.82

次數(shù)

0

13

18

19

15

頻率

0

0.200

0.277

0.292

0.231

表5　淫羊藿苷含量超過1%的因素頻率分布

Table 5 Frequency distribution of factors for icariin content over 1%

項目

加權(quán)平均數(shù)

標準誤

95%置信區(qū)間

施肥量（/ kg·667m-2

）

N

水平

-2.106

-0.751

0

0.751

2.106

-0.544

0.334

-1.199~0.111

6.46~15.80

次數(shù)

12

4

2

2

6

頻率

0.462

0.154

0.077

0.077

0.231

P2

O5

水平

-2.106

-0.751

0

0.751

2.106

-0.272

0.300

-0.860~0.316

8.88~17.26

次數(shù)

8

5

4

4

5

頻率

0.308

0.192

0.154

0.154

0.192

K2

O

水平

-2.45

-1

0

1

2.45

-0.115

0.412

-0.923~0.692

9.35~19.25

次數(shù)

9

5

1

2

9

頻率

0.346

0.192

0.038

0.077

0.346

表6　總黃酮含量超過20%的因素頻率分布

Table 6 Frequency distribution of factors for total flavonoid content over 20%

項目

加權(quán)平均數(shù)

標準誤

95%置信區(qū)間

施肥量（/ kg·667m-2

）

N

水平

-2.106

-0.751

0

0.751

2.106

0.097

0.206

-0.306~0.500

12.83~18.57

次數(shù)

8

8

9

11

9

頻率

0.178

0.178

0.200

0.244

0.200

P2

O5

水平

-2.106

-0.751

0

0.751

2.106

0.080

0.196

-0.303~0.464

12.85~18.32

次數(shù)

7

9

10

11

8

頻率

0.156

0.200

0.222

0.244

0.178

K2

O

水平

-2.45

-1

0

1

2.45

0.636

0.176

0.290~0.981

16.78~21.01

次數(shù)

1

6

14

15

9

頻率

0.022

0.133

0.311

0.333

0.200

269