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(責(zé)任編輯:顧文亮)

46 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào),2024,38(1):47-51

JournalofAnhuiScienceandTechnologyUniversity

收稿日期:2023-08-28

基金項(xiàng)目:安徽省重點(diǎn)研究與開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(202204c06020069)。

作者簡(jiǎn)介:唐靖雯(1998-),女,安徽天長(zhǎng)人,碩士研究生,主要從事園藝植物生物技術(shù)研究,E-mail:1515006898@qq.com。

通信作者:張從宇,研究員,E-mail:841968190@qq.com。

水稻愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化培養(yǎng)體系建立

唐靖雯, 錢晶晶, 王 寧, 曹柳晴, 洪文靜, 張從宇*

(安徽科技學(xué)院,安徽 鳳陽 233100)

摘 要:目的:篩選高效誘導(dǎo)水稻愈傷組織及不定芽分化培養(yǎng)體系的培養(yǎng)基,為水稻基因工程育種奠定基

礎(chǔ)。方法:以優(yōu)質(zhì)水稻品種(潤(rùn)珠香占)成熟胚為外植體,研究成熟胚愈傷組織出愈情況、不同培養(yǎng)基以及

植物生長(zhǎng)物質(zhì)濃度配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化的影響。結(jié)果:水稻愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基出愈率大小為

N6>B5>MS>WPM,N6 與 B5、MS、WPM 差異顯著;2,4-D 濃度愈傷組織誘導(dǎo)率大小為 B4>B3>

B5>B6>B2>B1,B4 與各處理組之間差異顯著;植物生長(zhǎng)物質(zhì)濃度配比對(duì)愈傷組織不定芽分化率大小為

T5>T7>T6>T1>T8>T3>T2>T4,T5 與各處理組之間差異顯著。結(jié)論:水稻成熟胚愈傷誘導(dǎo)的最佳

培養(yǎng)基及2,4-D質(zhì)量濃度分別為 N6、2.0mg/L;不定芽分化最佳植物生長(zhǎng)物質(zhì)6-BA、KT、NAA 質(zhì)量濃

度比為1∶1∶1,不定芽分化率最高。

關(guān)鍵詞:水稻;成熟胚;愈傷組織;不定芽分化

中圖分類號(hào):S852.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1673-8772(2024)01-0047-05

開放科學(xué)(資源服務(wù))標(biāo)識(shí)碼(OSID): DOI:10.19608/j.cnki.1673-8772.2024.0008

Inductionofricecallusandestablishmentofadventitious

buddifferentiationculturesystem

TANGJingwen, QIANJingjing, WANGNing,

CAOLiuqing, HONG Wenjing, ZHANGCongyu*

(AnhuiScienceandTechnologyUniversity,Fengyang233100,China)

Abstract:Objective:Screening efficient medium forinducing rice callus and adventitious bud

differentiationculturesystem,layingthefoundationforricegeneticengineeringbreeding.Methods:

Usingmatureembryosofhigh-qualityricevariety(Runzhuxiangzhan)asexplants,studiedthecallus

inductionofmatureembryos,theeffectsofdifferentmediaandplantgrowthsubstanceconcentrations

oncallusinductionandadventitiousbuddifferentiation.Results:Thecallusinductionrateofrice

mediumwasN6 >B5 >MS> WPM,N6wassignificantlydifferentfrom B5、MS、WPM.Thecallus

inductionrateof2,4-DconcentrationwasB4>B3>B5>B6>B2>B1,significantdifferencebetweenB4

andeachtreatmentgroup.Theratioofplantgrowthsubstanceconcentrationto Adventistbud

differentiationofcalluswasT5>T7>T6>T1>T8>T3>T2>T4,significantdifferencebetweenT5and

eachtreatmentgroup.Conclusion:Theoptimalculturemediumand2,4-Dconcentrationforinducing

ricematureembryocallusareN6,2.0mg/L.Theoptimalconcentrationofplantgrowthsubstancesfor

adventitiousbuddifferentiationis6-BA,KT,andNAAataratioof1∶1∶1,withthehighestrateof

adventitiousbuddifferentiation.

Keywords:Rice;Matureembryo;Callus;Adventitiousbuddifferentiation

水稻(Oryzasativa.L)是人類重要的糧食作物之一[1-2],養(yǎng)育了全球超過1/2的人口。60多年來,中

國(guó)科學(xué)家們圍繞水稻高產(chǎn)目標(biāo),通過一系列的品種選育與應(yīng)用推廣,極大地提高了水稻的產(chǎn)量,為保障中

國(guó)和世界糧食安全做出了巨大的貢獻(xiàn)[3]。如今,隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展,中國(guó)水稻育種技術(shù)迎來新的挑

戰(zhàn)和機(jī)遇。傳統(tǒng)育種面臨水稻產(chǎn)量低、抗性差等問題[4]。水稻育種技術(shù)的深入研究和基因組學(xué)技術(shù)的進(jìn)

步為水稻育種提供了新的思路[5-6]。因此,采用傳統(tǒng)育種和分子育種結(jié)合的方法,可以快速、準(zhǔn)確地鑒定品

種基因型,在保證其原有優(yōu)良性狀的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)多基因聚合選育,從而獲得高產(chǎn)、穩(wěn)定、優(yōu)質(zhì)、多抗等優(yōu)良

性狀的水稻新品種,以滿足未來市場(chǎng)的需求。

但水稻分子育種依然面臨許多技術(shù)問題[7],其中建立高效的再生體系是實(shí)現(xiàn)分子育種的必要前提[8]。

水稻再生體系受基因型、外植體類型、基本培養(yǎng)基、植物生長(zhǎng)物質(zhì)和培養(yǎng)條件(光周期和溫度)等諸多因素

影響[9]。目前,有關(guān)水稻組織培養(yǎng)已有相關(guān)報(bào)道[10-11],但存在分化率低、不定芽生長(zhǎng)能力弱等問題[12]。因

此,如何提高水稻的組培再生能力成了亟待解決的問題。

本研究以‘潤(rùn)珠香占’成熟胚為外植體,探究不同培養(yǎng)基以及植物生長(zhǎng)物質(zhì)濃度配比對(duì)愈傷組織和不

定芽誘導(dǎo)的影響,建立高效水稻愈傷組織誘導(dǎo)與不定芽分化培養(yǎng)體系,以期為水稻的快繁提供參考,同時(shí)

為優(yōu)良品種選育、遺傳轉(zhuǎn)化及基因功能研究等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試水稻品種為‘潤(rùn)珠香占’,由湖北中香種業(yè)科技股份有限公司提供。選取飽滿的成熟胚為外植體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體消毒 挑選飽滿成熟水稻種子,手工剝?nèi)シf殼,用自來水沖洗30min,在超凈工作臺(tái)上用

無菌水沖洗4次,75%乙醇浸泡30s,0.1% HgCl2 消毒8min,再用無菌水沖洗4~6次。將成熟胚接種

于不同類型的培養(yǎng)基中,置于(25±2)℃溫度下、光周期為12h/d、光照為1500~2000lx、相對(duì)濕度為

60%~70%的培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 不同培養(yǎng)基類型對(duì)愈傷的誘導(dǎo) 每種培養(yǎng)基(N6、B5、MS、WPM)內(nèi)加入30.0g/L蔗糖和6.0g/L

瓊脂,pH 調(diào)至6.0±0.2,加入2.0mg/L2,4-D、0.1mg/LVB8、1.0mg/LVB1、1.0mg/LVB6,放入高

壓滅菌鍋中121℃下滅菌20min。在超凈工作臺(tái)上將成熟胚放進(jìn)培養(yǎng)基中,共4種類型的培養(yǎng)基,每種

培養(yǎng)基處理7瓶,每瓶接入成熟胚3個(gè),15d后,觀察水稻種子成熟胚出愈情況并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.3 不同濃度2,4-D對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo) 以 N6 為基本培養(yǎng)基,加入30.0g/L蔗糖、6.0g/L瓊脂、

pH 調(diào)至6.0±0.2,加入0.1mg/LVB8、1.0mg/LVB1、1.0mg/LVB6 后,分別加入6種不同質(zhì)量濃度

2,4-D(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/L),放入高壓滅菌鍋中121℃下滅菌20min,在超凈工作臺(tái)上完成

接種工作。共6個(gè)梯度,每個(gè)濃度重復(fù)3次,每個(gè)濃度梯度接種5瓶,每瓶3個(gè)接入愈傷組織。接種完成

后,置黑暗條件下36d,觀察記錄并計(jì)算誘導(dǎo)率。

1.2.4 不同植物生長(zhǎng)物質(zhì)濃度配比對(duì)愈傷組織不定芽的分化 將分化能力強(qiáng)的愈傷組織接種至 N6+

30.0g/L蔗糖+6.0g/L瓊脂,pH 調(diào)至6.0±0.2,加入0.1mg/LVB8、1.0mg/LVB1、1.0mg/LVB6

48 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

后,加入8種不同濃度的6-BA、KT、NAA,放入高壓滅菌鍋中121℃下滅菌20min。在超凈工作臺(tái)上選

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的愈傷組織為外植體,接至不同濃度6-BA、KT、NAA 的培養(yǎng)基中。共8組處理,每組

3次重復(fù)。32d后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并計(jì)算愈傷分化率。

1.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

使用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單向方差分析、雙向方差分析和鄧肯多重范圍檢驗(yàn),P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基類型對(duì)愈傷誘導(dǎo)的影響

由表1可知,培養(yǎng)15d后,B5、MS與 N6 培養(yǎng)基差異不顯著,WPM 與 N6、B5、MS培養(yǎng)基差異顯著。

且 N6 培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織為淡黃色,分化能力強(qiáng)。因此,N6 為水稻愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基。

表1 不同培養(yǎng)基類型對(duì)愈傷誘導(dǎo)的影響

Table1 Effectsofdifferentmediatypesoncallusinduction

培養(yǎng)基類型 出愈率/% 愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)

N6 100.00a 淡黃色,顆粒狀

B5 96.82±0.06a 白色,緊實(shí)

MS 92.85±0.03a 白色,緊實(shí)

WPM 76.19±0.05b 褐色,糊狀

注:表中不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2 不同2,4-D濃度對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織的影響

由表2可知,不同2,4-D濃度誘導(dǎo)的水稻愈傷組織之間存在顯著差異。B4 與B1、B2、B3、B5、B6 處理

組之間存在顯著差異;B1、B2、B5、B6 與B3處理組之間存在顯著差異;B5 和B6 處理組之間差異不顯著。

因此,水稻愈傷組織誘導(dǎo)適宜的2,4-D濃度為2.0mg/L。

表2 不同2,4-D濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

Table2 Effectsofdifferent2,4-Dconcentrationsoncallusinduction

處理組 ρ(2,4-D)/(mg/L) 誘導(dǎo)率/% 愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)

B1 0.5 28.33±0.04e 褐色,顆粒狀

B2 1.0 40.53±0.01d 褐色,顆粒狀

B3 1.5 78.89±0.04b 白色,緊實(shí)

B4 2.0 100.00a 淡黃色,致密顆粒狀

B5 2.5 60.00±0.05c 白色,緊實(shí)

B6 3.0 53.89±0.03c 白色,緊實(shí)

2.3 不同植物生長(zhǎng)物質(zhì)濃度配比對(duì)愈傷組織不定芽分化的影響

將愈傷組織切成0.5cm2 的小塊接至分化培養(yǎng)基中,培養(yǎng)20d后愈傷組織長(zhǎng)出嫩綠色小芽,32d左

右長(zhǎng)出肉眼可見的嫩芽(見圖1)。由表3可知,T5 處理組與其他處理組存在顯著差異;T7 與 T1、T2、T3、

T4、T6、T8 處理組之間差異顯著;T6 與 T1、T3、T8 處理組之間差異不顯著。當(dāng) NAA 濃度為0.5mg/L

時(shí),愈傷組織分化率較低,且叢生芽生長(zhǎng)情況由黃色逐漸變?yōu)楹稚?甚至死亡;但隨著 NAA 濃度增加至

1.0mg/L時(shí),愈傷組織分化率顯著高于0.5 mg/L;當(dāng)其為1.0 mg/L 時(shí),加入1.0 mg/L6-BA 和

1.0mg/LKT,愈傷分化率為71.67%;而加入1.0mg/L6-BA和2.0mg/LKT,愈傷組織分化不定芽的

能力較弱,低于50%。因此,當(dāng)6-BA、KT、NAA的濃度為1∶1∶1時(shí),愈傷組織分化不定芽能力強(qiáng)。

第38卷第1期 唐靖雯,等:水稻愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化培養(yǎng)體系建立 49

圖1 水稻愈傷組織的誘導(dǎo)及不定芽分化培養(yǎng)生長(zhǎng)過程

Fig.1 Inductionofricecallusandgrowthprocessofadventitiousbuddifferentiationculture

注:A為 N6 培養(yǎng)基中成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織(15d);B為愈傷組織生長(zhǎng)情況(36d);C為愈傷組織誘導(dǎo)的不定芽生長(zhǎng)情況(32d);

D為愈傷組織誘導(dǎo)的不定芽生長(zhǎng)情況(50d)。

表3 不同植物生長(zhǎng)物質(zhì)濃度配比對(duì)愈傷組織從生芽分化的影響

Table3 Effectsofdifferentplantgrowthsubstanceconcentrationsandproportionsoncallusdifferentiationfrombuds

處理組

試驗(yàn)因素

ρ(6-BA)/(mg/L) ρ(KT)/(mg/L) ρ(NAA)/(mg/L)

分化率/%

T1 1.0 1.0 0.5 28.00±0.04cd

T2 2.0 1.0 0.5 23.00±0.03d

T3 1.0 2.0 0.5 24.67±0.02cd

T4 2.0 2.0 0.5 20.33±0.03d

T5 1.0 1.0 1.0 71.67±0.04a

T6 2.0 1.0 1.0 33.33±0.09c

T7 1.0 2.0 1.0 43.00±0.06b

T8 2.0 2.0 1.0 25.67±0.10cd

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過對(duì)培養(yǎng)基類型、植物生長(zhǎng)物質(zhì)濃度等對(duì)水稻組織培養(yǎng)過程的影響進(jìn)行篩選得出,N6 為誘

導(dǎo)水稻愈傷組織的最佳培養(yǎng)基,出愈率達(dá)到100%。最佳培養(yǎng)基配方為 N6+30.0g/L蔗糖+6.0g/L瓊

脂+2.0mg/L2,4-D+0.1mg/LVB8+1.0mg/LVB1+1.0mg/LVB6,誘導(dǎo)出的愈傷組織結(jié)構(gòu)緊實(shí)、

顏色微黃,適于誘導(dǎo)分化苗。在探討不同植物生長(zhǎng)物質(zhì)濃度比例對(duì)水稻愈傷組織不定芽分化的影響中,當(dāng)

6-BA、KT、NAA的質(zhì)量濃度比為1∶1∶1時(shí),愈傷組織分化率達(dá)到71.67%,即最佳培養(yǎng)基配方為 N6+

30.0g/L蔗糖+6.0g/L瓊脂+1.0mg/L6-BA+1.0mg/LKT+1.0mg/LNAA+2.0mg/L2,4-D+

0.1mg/LVB8+1.0mg/LVB1+1.0mg/LVB6。本研究建立了水稻愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化培養(yǎng)

體系,為水稻育種奠定了研究基礎(chǔ)。

通過試驗(yàn)得出,不同培養(yǎng)基對(duì)水稻組織培養(yǎng)具有一定的影響。以成熟胚為外植體,采用 N6、B5、MS

培養(yǎng)基為主。本研究得出,N6 較其他培養(yǎng)基而言,對(duì)水稻愈傷組織的誘導(dǎo)有著積極的作用。張玲等[13]在

水稻組織培養(yǎng)研究中表明 N6 對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)有較好的促進(jìn)作用;本研究結(jié)果與張智奇等[14]、袁云香

等[15]研究結(jié)果一致。

研究表明,植物生長(zhǎng)物質(zhì)在植物組織培養(yǎng)中起著較大的作用[16-17]。本試驗(yàn)中2.0mg/L2,4-D愈傷

50 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

組織誘導(dǎo)為100%,與閻麗娜等[18]研究結(jié)果相同。郭曉麗等[19]研究同樣表明加2.0mg/L2,4-D可提高

愈傷組織的誘導(dǎo)率,與本研究結(jié)果相同。生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素共同作用對(duì)于誘導(dǎo)不定芽的分化和生長(zhǎng)有

著積極的作用[20]。本試驗(yàn)NAA是重要的激素之一,同時(shí)配以6-BA、KT效果較好,與朱克明等[21]所用的

激素名稱一致,具體濃度不一致,可能是因?yàn)椴煌酒贩N對(duì)激素的耐受能力及敏感性不同。

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(責(zé)任編輯:顧文亮)

第38卷第1期 唐靖雯,等:水稻愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化培養(yǎng)體系建立 51

安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào),2024,38(1):52-57

JournalofAnhuiScienceandTechnologyUniversity

收稿日期:2023-04-30

基金項(xiàng)目:安徽省自然科學(xué)基金(2308085MC90);作物抗逆育種與減災(zāi)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室開放基金(NELCOF20190102);安徽

省高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目(KJ2017A510,KJ2019A0814);安徽省重點(diǎn)研究與開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(202104a06020001);鳳陽縣科技

計(jì)劃項(xiàng)目(NY2022-05);國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(202110879085)。

作者簡(jiǎn)介:楊勝雨(1999-),女,安徽廣德人,碩士研究生,主要從事植物病害化學(xué)防治研究,E-mail:17856097851@163.com。

通信作者:段海明,副教授,E-mail:duanhm@ahstu.edu.cn。

18種化學(xué)殺菌劑及混配組合對(duì)高粱附球菌的抑制效果

楊勝雨1, 段海明2* , 孟祥濤1, 陳 甦2, 周 慧1

(1.安徽科技學(xué)院 資源與環(huán)境學(xué)院,安徽 鳳陽 233100;2.安徽科技學(xué)院 農(nóng)學(xué)院,安徽 鳳陽 233100)

摘 要:目的:探究化學(xué)殺菌劑單劑及其混配對(duì)高梁附球菌(E.sorghinum)的抑制活性,旨在找出抑菌效

果最佳的混配組合。方法:采用 Horsfall的方法設(shè)計(jì)2種化學(xué)殺菌劑的混配試驗(yàn),采用菌絲生長(zhǎng)速率法求

出各配比的抑菌率和毒性比率。結(jié)果:咯菌腈對(duì)高粱附球菌的抑制活性最高,EC50 達(dá)0.32mg/L;其次為

咪鮮胺和氟硅唑,EC50 分別為0.38、0.52mg/L。百菌清、溴菌腈和代森錳鋅對(duì)病菌的抑制活性較弱,EC50

分別為69.24、79.51、84.40mg/L。氟硅唑和克菌丹以6∶4的比例混配抑制效果最佳,毒性比率達(dá)1.40,

以2∶8比例的混配毒性比率達(dá)1.35;咪鮮胺與咯菌腈以3∶7的比例混配,毒性比率達(dá)1.34;以5∶5的

比例混配毒性比率為1.31。溴菌腈與百菌清以8∶2的比例混配毒性比率最高,為1.33,其次為7∶3的

比例混配毒性比率為1.30。氟硅唑與百菌清以4∶6的比例混配,毒性比率為1.31;溴菌腈與代森錳鋅以

7∶3的比例混配,毒性比率為1.28。結(jié)論:不同化學(xué)殺菌劑的混配對(duì)于高粱附球菌能夠表現(xiàn)出較好的增

效抑制活性,且大多為選擇性殺菌劑和保護(hù)性殺菌劑混配,能夠較好發(fā)揮預(yù)防和治療的效果,其中以氟硅

唑和克菌丹的混配組合增效最佳,其次是咪鮮胺和咯菌腈的混配組合。

關(guān)鍵詞:高粱附球菌;化學(xué)殺菌劑;混配;抑制效果;毒力測(cè)定

中圖分類號(hào):S482.2+99 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1673-8772(2024)01-0052-06

開放科學(xué)(資源服務(wù))標(biāo)識(shí)碼(OSID): DOI:10.19608/j.cnki.1673-8772.2024.0009

Inhibitoryeffectsof18chemicalfungicidesandtheir

mixedcombinationsonEpicoccumsorghinum

YANGShengyu1, DUAN Haiming

2* , MENGXiangtao1, CHENSu2, ZHOU Hui1

(1.CollegeofResourceandEnvironment,AnhuiScienceandTechnologyUniversity,Fengyang233100,China;

2.CollegeofAgriculture,AnhuiScienceandTechnologyUniversity,Fengyang233100,China)

Abstract:Objective:Theinhibitoryactivityofsinglechemicalfungicidesandtheirmixedcombinations

againstE.sorghinum wasinvestigatedinordertofindoutthebestmixedcombinationofantifungal

effects.Methods:ThemixedtestoftwochemicalfungicideswasdesignedbyHorsfallmethod.The

inhibitionrateofeachratiowasdeterminedbymycelialgrowthratemethod,andthetoxicityratiowas

calculated.Results:FludioxonilhadthehighestinhibitoryactivityagainstE.sorghinum withEC50 of

0.32mg/L,followedbyprochlorazandflusilazolewithEC50 of0.38,0.52 mg/L,respectively.The

inhibitoryactivitiesofchlorothalonil,bromothalonilandmancozebwereweak,andtheEC50was69.24,

79.51,84.40mg/L,respectively.Themixtureofflusilazoleandcaptanataratioof6∶4hadthebest

inhibitoryeffect,withatoxicityratioof1.40,andthemixtureataratioof2∶8hadatoxicityratioof

1.35.Prochlorazandfludioxonilweremixedataratioof3∶7,andthetoxicityratiowas1.34.The

toxicityratioof5∶5was1.31.Thehighesttoxicityratioofbromothalonilandchlorothalonilinthe

ratioof8∶2was1.33,followedby7∶3toxicityratioof1.30.Flusilazoleandchlorothalonilwere

mixedataratioof4∶6,andthetoxicityratiowas1.31.Thetoxicityratioofbromothalonilto

mancozebat7∶3was1.28.Conclusion:Themixtureofdifferentchemicalfungicidescouldshowgood

synergisticinhibitoryactivityagainstE.sorghinum,and mostofthem were mixed withselective

fungicidesandprotectivefungicides,whichcouldbetterplaytheroleofpreventionandtreatment.

Amongthem,themixedcombinationofflusilazoleandcaptanhadthebestsynergisticeffect,followed

bythecombinationofprochlorazandfludioxonil.

Keywords:Epicoccumsorghinum;Fungicide;Mixture;Inhibitioneffect;Toxicitydetermination

高梁附球菌(E.sorghinum)是熱帶及亞熱帶地區(qū)的一種常見植物病原菌,通常在作物收獲前后泛

濫,導(dǎo)致植物發(fā)生病害并造成較大損失[1-3],同時(shí)也是植物葉鞘組織最常見的內(nèi)生真菌之一[4]。目前,全球

氣候變暖等不利環(huán)境因素致使植物病害的發(fā)生情況復(fù)雜多變,發(fā)生危害范圍正逐步擴(kuò)大[5]?？梢灶A(yù)測(cè),高

粱附球菌的傳播蔓延對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有較大的潛在危害性,甚至?xí)葑兂蔀橹匾闹参锊≡?。因?對(duì)

高粱附球菌的高效防治措施研究已迫在眉睫。

有報(bào)道稱,高粱附球菌可以侵染玉米莖葉,使玉米植株產(chǎn)生多種病害,并在其它多種農(nóng)作物上也發(fā)現(xiàn)

了由E.sorghinum 引起的植物葉斑病[6-7]。該真菌的寄主范圍廣泛,包括禾本科[8-10]、蠟梅科[11]、獼猴桃

科[12]、菊科[13]、茶科[14]、酢漿草科[15]、十字花科[16]、百合科[17]等科屬,可侵染包括葉、莖、根系在內(nèi)的多種

植物器官,在病菌適宜生長(zhǎng)條件下可導(dǎo)致植物大面積受害,甚至死亡。但目前關(guān)于不同化學(xué)殺菌劑對(duì)高粱

附球菌的毒力測(cè)定研究鮮見報(bào)道,對(duì)于其危害防控經(jīng)驗(yàn)更是不足。為了減少高粱附球菌對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成

的潛在損失,盡早開展相對(duì)應(yīng)的化學(xué)殺菌劑篩選具有重要意義,篩選出增效混配組合是實(shí)現(xiàn)藥劑減量化的

一種重要手段[18-20]。因此,本研究在殺菌劑單劑篩選的基礎(chǔ)上,開展混配組合篩選,旨在篩選新型高效的

復(fù)配劑,為該病菌引起病害的治理工供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試藥劑:96.2%氟硅唑原藥、95.6%丙環(huán)唑原藥、97.5%咪鮮胺原藥、95%吡唑醚菌酯原藥、98%異

菌脲原藥、96.4%苯醚甲環(huán)唑原藥、95%己唑醇原藥、97.5%肟菌酯原藥、97%戊唑醇原藥、95%克菌丹原

藥、98%咯菌腈原藥、95%己唑醇原藥、97.2%氟環(huán)唑原藥、95%腈菌唑原藥、95%溴菌腈原藥、96%醚菌酯

原藥,均由安徽省錦江農(nóng)化有限公司提供。98.5%腐霉利原藥和85%代森錳鋅原藥分別由江西禾益化工

股份有限公司和山東濰坊雙星農(nóng)藥有限公司提供。

供試菌株:高粱附球菌(E.sorghum)由安徽科技學(xué)院植物病害防治實(shí)驗(yàn)室保存。

供試培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基[21]。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目及分析方法

1.2.1 不同化學(xué)殺菌劑對(duì)高粱附球菌的毒力測(cè)定 18種化學(xué)殺菌劑原藥用丙酮溶解配制成5g/L母

液。通過預(yù)試驗(yàn),確定藥劑濃度范圍后,將母液進(jìn)行梯度稀釋,配制成不同濃度的藥液備用(表1)。利用

菌絲生長(zhǎng)速率法[22]測(cè)定百菌清、咪鮮胺、腐霉利、代森錳鋅、丙環(huán)唑等18種化學(xué)殺菌劑對(duì)高粱附球菌的抑

第38卷第1期 楊勝雨,等:18種化學(xué)殺菌劑及混配組合對(duì)高粱附球菌的抑制效果 53

制活性。接種完菌餅后放置于26℃培養(yǎng)箱中恒溫恒濕培養(yǎng)120h,采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑均值。

采用SPSS25.0軟件分別求出18種化學(xué)殺菌劑對(duì)病菌的毒力回歸方程、EC50、95%置信區(qū)間和R2。

表1 18種藥劑質(zhì)量濃度梯度設(shè)置

Table1 Concentrationsettingofeighteenfungicides

藥劑 藥劑質(zhì)量濃度/(mg/L)

咯菌腈 0.20 0.40 0.80 1.20 1.60 2.00

咪鮮胺 0.50 1.00 2.00 4.00 8.00 12.00

氟硅唑 1.00 2.00 4.00 8.00 12.00 24.00

己唑醇 0.20 0.40 0.80 1.60 3.20 4.80

苯醚甲環(huán)唑 0.10 0.20 0.40 0.60 0.80 1.60

異菌脲 0.50 1.00 2.00 4.00 8.00 16.00

丙環(huán)唑 0.50 1.00 2.00 4.00 6.00 8.00

腐霉利 0.50 1.00 2.00 4.00 8.00 16.00

氟環(huán)唑 1.00 2.00 4.00 8.00 12.00 16.00

腈菌唑 1.00 2.00 4.00 8.00 16.00 32.00

吡唑醚菌酯 1.00 2.00 4.00 8.00 16.00 32.00

肟菌酯 2.00 4.00 8.00 16.00 32.00 48.00

戊唑醇 2.00 4.00 8.00 16.00 24.00 32.00

醚菌酯 4.00 8.00 16.00 32.00 48.00 64.00

克菌丹 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00

百菌清 2.00 4.00 8.00 16.00 24.00 32.00

溴菌腈 1.00 2.00 4.00 8.00 16.00 24.00

代森錳鋅 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00

1.2.2 室內(nèi)混配藥劑篩選 基于不同作用機(jī)制以及保護(hù)性和選擇性殺菌劑相配合的原則,開展藥劑的混

配試驗(yàn)。代森錳鋅、百菌清、克菌丹為多作用位點(diǎn)殺菌劑,其余15種均為現(xiàn)代選擇性殺菌劑;咯菌腈、異菌

脲和腐霉利為信號(hào)轉(zhuǎn)換抑制劑,醚菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯為細(xì)胞色素bc1Qo位泛醌醇氧化酶抑制劑,

溴菌腈為具有高度親電子中心的選擇性抑制劑,其它11種都是麥角甾醇生物合成抑制劑。按上述原則選

定的2種化學(xué)殺菌劑開展混配試驗(yàn)[23]。按其EC50 值劑量的比例分別設(shè)置0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、

5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0等11個(gè)配比,每個(gè)配比設(shè)置6個(gè)重復(fù),用無菌水處理組作對(duì)照。采用

菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定各配比的抑菌率,計(jì)算出實(shí)際抑菌率、理論抑菌率以及毒性比率[24]。當(dāng)毒性比率>1

時(shí),為增效作用;當(dāng)毒性比率<1時(shí),為拮抗作用;當(dāng)毒性比率為1時(shí),為相加作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同殺菌劑對(duì)高粱附球菌的毒力測(cè)定

由表2可以得出,己唑醇、咯菌腈、咪鮮胺、氟硅唑、苯醚甲環(huán)唑和異菌脲等6種藥劑對(duì)高粱附球菌均

具有較好的抑制效果,EC50 均低于1.00mg/L。其中,咯菌腈對(duì)高粱附球菌的抑制活性最強(qiáng),EC50 達(dá)

0.32mg/L,其次為咪鮮胺和氟硅唑,EC50 分別為0.38、0.52mg/L。百菌清、溴菌腈和代森錳鋅對(duì)病菌

的抑制活性較弱,EC50 分別為69.24、79.51、84.40mg/L。

2.2 不同化學(xué)殺菌劑混配對(duì)高粱附球菌的毒性比率

從圖1可以看出,氟硅唑和克菌丹、百菌清配合,溴菌腈和百菌清、代森錳鋅的配合以及咪鮮胺和咯菌

腈的配合對(duì)高粱附球病菌的抑制效果均表現(xiàn)為增效作用。其中以6∶4比例的氟硅唑與克菌丹混配抑制

效果最佳,毒性比率達(dá)1.40。以3∶7的比例混配咪鮮胺與咯菌腈,毒性比率為1.34;當(dāng)二者混配比為

5∶5時(shí),毒性比率為1.31。溴菌腈和百菌清以8∶2的比例混配時(shí)毒性比率最高,為1.33;其次為7∶3

比例時(shí)毒性比率為1.30。氟硅唑與百菌清以4∶6的比例混配時(shí)毒性比率為1.31。溴菌腈與己唑醇、苯

醚甲環(huán)唑混配則表現(xiàn)出拮抗作用。由圖2可以看出,高粱附球菌對(duì)照處理組菌落內(nèi)緣有輕微紅褐色出現(xiàn),

外緣部呈白色,菌絲舒展正常,而經(jīng)過殺菌劑混配處理的菌落直徑與對(duì)照組直徑對(duì)比則明顯減小,部分混

配比例還產(chǎn)生了紅色分泌物,而且抑制效果越好的組合,中央暗褐色面積越大,顏色更深。高粱附球菌對(duì)

54 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

照組菌絲較細(xì)、近乎無色、表面光滑,混配增效組處理后的高粱附球菌菌絲較粗、表面粗糙、菌絲彎曲、顏色

多呈現(xiàn)褐色,部分菌絲膨脹,有大量囊泡出現(xiàn)。

表2 18種化學(xué)殺菌劑對(duì)高粱附球菌的室內(nèi)毒力

Table2 Indoortoxicityof18chemicalfungicidestoE.sorghinum

藥劑名稱 毒力回歸方程(y=a+bx) EC50/(mg/L)(95%置信區(qū)間) R2

咯菌腈 y=0.49+0.99x 0.32(0.23~0.41) 0.93

咪鮮胺 y=0.23+0.56x 0.38(0.27~0.68) 0.92

氟硅唑 y=0.21+0.68x 0.52(0.21~0.89) 0.95

己唑醇 y=0.30+1.41x 0.61(0.48~0.74) 0.96

苯醚甲環(huán)唑 y=0.10+0.99x 0.79(0.64~1.05) 0.92

異菌脲 y=0.01+2.50x 0.97(0.86~1.08) 0.94

丙環(huán)唑 y=-0.23+0.89x 1.82(1.42~2.27) 0.96

腐霉利 y=-0.646+1.62x 2.50(1.87~3.50) 0.90

氟環(huán)唑 y=-1.09+1.55x 5.06(4.38~5.93) 0.98

腈菌唑 y=1.21+1.38x 7.52(6.43~8.87) 0.96

吡唑醚菌酯 y=-0.81+0.89x 8.04(6.41~10.35) 0.93

肟菌酯 y=0.44+0.48x 12.21(7.69~20.27) 0.96

戊唑醇 y=-2.85+2.52x 13.47(11.69~15.49) 0.94

醚菌酯 y=-0.57+0.46x 17.28(10.39~27.29) 0.93

克菌丹 y=3.77+2.25x 47.17(43.18~52.06) 0.97

百菌清 y=-1.50+0.82x 69.24(44.06~146.64) 0.93

溴菌腈 y=-1.99+1.04x 79.51(43.54~326.78) 0.90

代森錳鋅 y=-2.62+1.36x 84.40(66.49~138.06) 0.97

圖1 化學(xué)藥劑混配對(duì)高粱附球菌的毒性比率

Fig.1 ToxicityratioofchemicalagentsmixedwithE.sorghinum

圖2 化學(xué)藥劑混配對(duì)高粱附球菌的抑制效果

Fig.2 SynergisticeffectofchemicalagentsontheinhibitionofE.sorghinum

注:A為對(duì)照;B為咪鮮胺∶異菌脲=9∶1;C為氟硅唑∶克菌丹=7∶3;D為氟硅唑∶克菌丹=6∶4;E為對(duì)照菌絲生長(zhǎng)情況;F為

復(fù)配處理后菌絲生長(zhǎng)情況。

第38卷第1期 楊勝雨,等:18種化學(xué)殺菌劑及混配組合對(duì)高粱附球菌的抑制效果 55

3 結(jié)論與討論

高粱附球菌是高粱籽粒霉菌復(fù)合體中最常見的真菌之一,一直被視為一種植物弱寄生菌[25-26],也有

研究表明高粱附球菌可以作為植物幼苗根部的病原菌[27]。高粱附球菌侵染種子的包皮及胚乳且讓感染

的種子表面產(chǎn)生蟲害[28]。目前,高粱附球菌已從大約80個(gè)不同的寄主植物屬以及牛飼料和家禽飼料等

基質(zhì)中分離出來,足以說明該菌在自然環(huán)境中存在的廣泛性,應(yīng)引起足夠重視。

目前,化學(xué)殺菌劑種類繁多,化學(xué)防治仍是防治各種植物病害最有效的手段之一。有研究表明,通過

藥劑混配可以使藥效提升、毒力增大。另一方面可以降低藥液使用量和使用次數(shù)[29]。但現(xiàn)有研究對(duì)高粱

附球菌的化學(xué)抑制研究較少且不深入。王晗等[30]報(bào)道了7種殺菌劑對(duì)高粱附球菌菌絲的生長(zhǎng)抑制情況,

表明在殺菌劑質(zhì)量濃度為300mg/L時(shí),苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇和異菌脲等3種供試殺菌劑對(duì)高粱附球菌的

抑制率分別達(dá)到100.0%、97.7%和98.5%;當(dāng)殺菌劑終質(zhì)量濃度達(dá)到1mg/L時(shí),噁霜·錳鋅、戊唑醇、

精甲霜·錳鋅、異菌脲、苯醚甲環(huán)唑等5種供試殺菌劑可以完全抑制病原菌在PDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)。苯

醚甲環(huán)唑?qū)Ω吡桓角蚓^高的抑制性與本研究結(jié)果一致。曾慧蘭等[31]的室內(nèi)篩選結(jié)果表明,啶酰菌胺對(duì)

高粱附球菌的抑制作用最強(qiáng),其次是咯菌腈和嘧菌環(huán)胺,EC50 值分別達(dá)到0.011、0.671、0.966mg/L;其

中嘧霉胺的效果最差,EC50 為2.168mg/L,本研究結(jié)果同樣表明,咯菌腈對(duì)高梁附球菌的抑制效果最佳,

其次為咪鮮胺、氟硅唑等唑類殺菌劑。Li等[32]報(bào)道高粱附球菌和其它4種病原菌相互作用引發(fā)楊梅枝枯

病;室內(nèi)殺菌劑篩選的結(jié)果表明,咪鮮胺(銅鹽)是田間應(yīng)用防效最好的殺菌劑,其次是吡唑醚菌酯、15%苯

醚甲環(huán)唑+15%丙環(huán)唑、苯醚甲環(huán)唑和腈菌唑。張艷婷[33]發(fā)現(xiàn)氟啶胺與解淀粉芽孢桿菌LAJ5按3∶7比

例混配后,對(duì)高粱附球菌引起的草莓莖基腐病的防治起到明顯增效作用。段寶忠等[34]用嘧菌酯、多菌靈

和三唑酮等內(nèi)吸性殺菌劑與代森錳鋅等保護(hù)性殺菌劑進(jìn)行混配來防治由高粱附球菌引起的滇重樓葉斑

病,可以對(duì)其產(chǎn)生較好的防治效果?，F(xiàn)有對(duì)抑制高粱附球菌的混配殺菌劑研究較少,但從已有的研究結(jié)果

可以看出,殺菌劑混配使用可以促使藥效得到進(jìn)一步的提升。本試驗(yàn)結(jié)果表明麥角甾醇生物合成抑制劑

氟硅唑和多作用位點(diǎn)保護(hù)劑克菌丹混配比例為6∶4時(shí)毒性比率達(dá)到最高,對(duì)高粱附球菌的抑制效果也最

好,其次為麥角甾醇生物合成抑制劑咪鮮胺和信號(hào)轉(zhuǎn)換抑制劑咯菌腈混配比例為3∶7時(shí)毒性比率可達(dá)到

1.34?？梢酝茰y(cè)不同作用機(jī)制的殺菌劑在混合施用時(shí)攻擊病原菌多個(gè)位點(diǎn),從而使病菌對(duì)藥劑的敏感性

增強(qiáng),表現(xiàn)出較為顯著的增效結(jié)果。但由于室內(nèi)環(huán)境與田間存在較大差異,下一步可通過盆栽和大田試驗(yàn)

進(jìn)一步驗(yàn)證研究所得結(jié)果的可靠性。

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(責(zé)任編輯:顧文亮)

第38卷第1期 楊勝雨,等:18種化學(xué)殺菌劑及混配組合對(duì)高粱附球菌的抑制效果 57

安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào),2024,38(1):58-64

JournalofAnhuiScienceandTechnologyUniversity

收稿日期:2023-04-13

基金項(xiàng)目:農(nóng)業(yè)農(nóng)村部生物有機(jī)肥創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(BOFA202010);安徽省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(S202210879123);

安徽省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(皖農(nóng)科函〔2021〕711號(hào));蕪湖市“兩強(qiáng)一增”科技專項(xiàng)(2022ly17)。

作者簡(jiǎn)介:趙丹丹(1998-),女,安徽亳州人,碩士研究生,主要從事富硒有機(jī)肥應(yīng)用研究,E-mail:zdd697298@163.com。

通信作者:邢素芝,教授,E-mail:Xingsz0906@qq.com。

葉面噴施亞硒酸鈉對(duì)基質(zhì)栽培辣椒產(chǎn)量和品質(zhì)的影響

趙丹丹1, 周滬生1, 陳 鵬1, 裴文霞1, 袁先福1, 汪建飛1,2, 邢素芝1,2*

(1.安徽科技學(xué)院 資源與環(huán)境學(xué)院,安徽 鳳陽 233100;

2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部生物有機(jī)肥創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 蚌埠 233400)

摘 要:目的:研究葉面噴施亞硒酸鈉對(duì)辣椒的產(chǎn)量、品質(zhì)、硒及相關(guān)微量元素含量的影響,解析辣椒對(duì)亞

硒酸鈉的積累及耐受特性,并篩選出有利于辣椒生長(zhǎng)的最佳葉面噴施的亞硒酸鈉濃度。方法:采用基質(zhì)栽

培法,以“汴椒1號(hào)”辣椒品種為研究對(duì)象,設(shè)置5個(gè)亞硒酸鈉質(zhì)量濃度(0、50、100、150、200mg/L),各處

理辣椒噴施亞硒酸鈉量均為50mL,每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。培育60d后,對(duì)辣椒的產(chǎn)量、品質(zhì)、硒及相

關(guān)微量元素含量進(jìn)行測(cè)定分析。結(jié)果:亞硒酸鈉的施用對(duì)辣椒產(chǎn)量表現(xiàn)出“低濃度促進(jìn)、高濃度抑制”的劑

量效應(yīng)。亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為100mg/L時(shí),較對(duì)照處理(CK)產(chǎn)量增幅最大,達(dá)29%;當(dāng)亞硒酸鈉質(zhì)量濃度

為150mg/L時(shí),辣椒出現(xiàn)減產(chǎn)現(xiàn)象,較CK減產(chǎn)幅度達(dá)22.05%。當(dāng)施用亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為0~200mg/L

時(shí),辣椒硒含量呈逐漸上升趨勢(shì),差異顯著;辣椒果實(shí)中有機(jī)硒占總硒的百分比隨著噴施亞硒酸鈉濃度的

增加呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)。對(duì)于各試驗(yàn)處理,當(dāng)亞硒酸鈉濃度逐漸增加時(shí),辣椒果實(shí)中鈣、鐵、銅含量均

上升,但鎂、鋅含量無顯著差異,粗蛋白、維生素C、總糖等品質(zhì)指標(biāo)含量均呈上升趨勢(shì)。結(jié)論:葉面噴施適

宜濃度的亞硒酸鈉能顯著提高辣椒產(chǎn)量和果實(shí)中的硒、鈣和鐵的含量,有效改善辣椒品質(zhì)。葉面噴施亞硒

酸鈉質(zhì)量濃度以50~100mg/L為宜。因此,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,亞硒酸鈉的合理使用是富硒農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要

方向之一,也是促進(jìn)作物高產(chǎn)高效生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)。

關(guān)鍵詞:辣椒;亞硒酸鈉;葉面噴施;硒含量;產(chǎn)量;品質(zhì)

中圖分類號(hào):S5-33 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1673-8772(2024)01-0058-07

開放科學(xué)(資源服務(wù))標(biāo)識(shí)碼(OSID): DOI:10.19608/j.cnki.1673-8772.2024.0010

Effectoffoliarseleniumenrichmentonyieldandfruitqualityofpepper

ZHAODandan1, ZHOU Husheng

1, CHENPeng

1, PEIWenxia1,

YUANXianfu1, WANGJianfei1,2, XINGSuzhi1,2*

(1.CollegeofResourcesandEnvironment,AnhuiScienceandTechnologyUniversity,Fengyang233100,China;

2.KeyLaboratoryofBio-organicFertilizerCreation,MinistryofAgricultureandRuralAffairs,Bengbu233400,China)

Abstract:Objective:Tostudytheeffectsoffoliarsprayingsodium seleniteontheyield,quality,

selenium and related trace elementcontent of pepper,analyzethe accumulation and tolerance

characteristicsofpeppertosodiumselenite,andselectthebestconcentrationofsodiumselenitefor

peppergrowth.Methods:Thesubstratecultivation methodwasusedinthisstudy.BianjiaoNo.1

peppervarietywastakenastheresearchobject.Fiveconcentrationsofsodiumselenitewereset,which

were0,50,100,150,200mg/L,respectively.Theamountofsodiumselenitesprayedonpepperin

eachtreatmentwas50mL,andthreereplicatesweresetineachtreatment.After60daysofcultivation,

theyield,quality,seleniumandrelatedtraceelementsofpepperweredeterminedandanalyzed.Results:

Theapplication ofsodium seleniteshowedadoseeffectof\"low concentration promoting,high

concentrationinhibiting\"onpepperyield.Whentheconcentrationofsodiumselenitewas100mg/L,the

yieldincreasedby29%comparedwithCK.Whentheconcentrationofsodiumselenitewas150mg/L,

theyieldofpepperdecreasedby22.05%comparedwithCK.Whentheconcentrationofsodiumselenite

wasintherangeof0-200mg/L,theseleniumcontentofpeppershowedagradualupwardtrend,with

significantdifference;Thepercentageoforganicseleniumintotalseleniuminpepperfruitsincreased

firstandthendecreased withtheincreaseofsodium seleniteconcentration.Foreachexperimental

treatment,whentheconcentrationofsodiumselenitegraduallyincreased,thecontentofcalcium,iron

andcopperinpepperfruitsincreased,aswellascrudeprotein,vitaminC,totalsugarandotherquality

indicators,butthecontentofmagnesiumandzinchadnosignificantdifference.wererising.Conclusion:

Sprayingtheappropriateconcentrationofsediumseleniteontheleavescouldsignificantlyincreasethe

yieldandthecontentsofselenium,calciumandironinthefruits,andeffectivelyimprovethequalityof

pepper.Theoptimumconcentrationofsediumseleniteis50-100mg/L.Therefore,therationaluseof

sediumseleniteisoneoftheimportantdirectionsinthedevelopmentofSe-enrichedagriculture,itisalso

animportantlinktopromotehigh-yieldandefficientproductionofcrops.

Keywords:Pepper;Sediumselenite;Foliarspraying;Seleniumcontent;Output;Quality

目前研究已證實(shí)硒是構(gòu)成哺乳動(dòng)物體內(nèi)30多種含硒蛋白質(zhì)與含硒酶(如谷胱甘肽過氧化物酶、硫氧

還原蛋白酶以及碘化甲腺原氨酸脫碘酶等)的重要組成成分,具有防衰老、抗腫瘤、抗毒等重要生理功能。

硒是人體必需的微量元素,人體缺硒易導(dǎo)致多種疾病,已查證有40多種疾病都因缺硒引起,嚴(yán)重缺硒還會(huì)

引發(fā)心肌病、心肌衰竭、大骨節(jié)病和克山病等[1-3]。這些病癥的發(fā)生多與當(dāng)?shù)赝寥乐形枯^低、膳食中硒

含量不足相關(guān)。據(jù)報(bào)道,中國(guó)缺硒地區(qū)高達(dá)72%,缺硒省份有22個(gè),缺硒程度存在地域差異,部分地區(qū)極

度缺硒[3-4]。正在開展的全國(guó)第三次土壤普查首次把總硒含量作為土壤理化性質(zhì)必檢指標(biāo),足見國(guó)家對(duì)硒

與人體健康的重視。近年來,隨著功能農(nóng)業(yè)概念的普及推廣,通過富硒農(nóng)產(chǎn)品適當(dāng)補(bǔ)硒、消除“隱性饑餓”、

促進(jìn)身體健康的理念已被城鄉(xiāng)居民廣泛接受[5]。中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)把硒列為15種人體必需的營(yíng)養(yǎng)元素,建議

成人每日硒攝入量為50~250μg。科學(xué)補(bǔ)硒工作越來越受到重視,通過開發(fā)富硒農(nóng)產(chǎn)品被認(rèn)為是最佳的

補(bǔ)硒方式[6]。

辣椒(Capsicumannuum)屬茄科(Solanaceae)辣椒屬(Capsicum)草本植物,又名海椒、辣子、辣角、辣

茄等,是中國(guó)各地普遍種植的蔬菜品種之一。辣椒因其果實(shí)富含多種對(duì)人體有益的成分,如維生素C、維

生素E、礦物質(zhì)、氨基酸和抗氧化物質(zhì)而深受大眾青睞[7-9]。趙玉玲等[10]對(duì)比了土壤穴施與葉面噴施硒肥

兩種施肥方式,發(fā)現(xiàn)相比于土壤穴施,葉面噴施有機(jī)肥更有利于提高辣椒果實(shí)中總硒和有機(jī)硒含量以及果

實(shí)中有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率。然而,富硒土壤生長(zhǎng)的農(nóng)產(chǎn)品不一定達(dá)到富硒標(biāo)準(zhǔn)[11],而不同的作物品種、生產(chǎn)環(huán)

境、栽培方式需要采取不同的富硒技術(shù),才能生產(chǎn)出硒營(yíng)養(yǎng)達(dá)標(biāo)的功能農(nóng)產(chǎn)品。當(dāng)前,在溫室或者植物工

廠環(huán)境下,采用基質(zhì)栽培的辣椒面積不斷擴(kuò)大,如何在這一生產(chǎn)環(huán)境中,開發(fā)出相關(guān)的辣椒富硒生產(chǎn)技術(shù),

對(duì)于提高辣椒附加值、市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力以及農(nóng)戶增收都具有重要的意義。

本研究通過基質(zhì)栽培試驗(yàn),開展噴施不同濃度的亞硒酸鈉對(duì)辣椒產(chǎn)量、總硒及有機(jī)硒含量、礦質(zhì)元素

含量以及營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)指標(biāo)影響的研究,在探討作物硒元素營(yíng)養(yǎng)作用機(jī)理的同時(shí),為溫室和工廠化生產(chǎn)富硒辣

第38卷第1期 趙丹丹,等:葉面噴施亞硒酸鈉對(duì)基質(zhì)栽培辣椒產(chǎn)量和品質(zhì)的影響 59

椒提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試?yán)苯菲贩N為河南紅綠辣椒種業(yè)有限公司培育而成的“汴椒1號(hào)”,供試亞硒酸鈉(Na2SeO3,分析

純)購(gòu)于天津市福晨化學(xué)試劑廠,純度為99%。

1.2 栽培基質(zhì)

將泥炭土、蛭石、珍珠巖按1∶1∶1質(zhì)量比充分混勻,制成培育基質(zhì)[12-15]。將混勻的基質(zhì)裝入50個(gè)規(guī)

格為18cm(直徑)×20cm(高)的塑料缽,裝入量以基質(zhì)表面距盆缽口沿下方1cm的位置為準(zhǔn)。

1.3 基質(zhì)盆栽辣椒

試驗(yàn)在安徽科技學(xué)院種植科技園2號(hào)溫室大棚中進(jìn)行。2019年11月12日,將辣椒種子催芽育苗;

2020年1月9日,將辣椒苗移栽到預(yù)先裝好基質(zhì)的培養(yǎng)缽中,每缽定植1株辣椒苗。統(tǒng)一進(jìn)行日常水肥

和病蟲害防治管理。

1.4 辣椒噴施亞硒酸鈉試驗(yàn)方案

采用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì),設(shè)置5個(gè)不同質(zhì)量濃度亞硒酸鈉處理,其含量分別為0(CK)、50、

100、150、200mg/L。每個(gè)處理3次重復(fù),每缽噴施亞硒酸鈉溶液用量均為50mL。

1.5 試驗(yàn)實(shí)施

為減少試驗(yàn)誤差,待盆栽辣椒進(jìn)入初花期,從定植的50缽辣椒中選取植株長(zhǎng)勢(shì)基本一致的25缽,用

于試驗(yàn)。

2020年4月24日,將同一濃度處理的5缽辣椒排成一排,5個(gè)處理濃度由低到高共排成5排。將

250mL亞硒酸鈉溶液(CK是蒸餾水)裝入手持噴霧器中,對(duì)同一處理的一排5缽辣椒噴施亞硒酸鈉溶

液。噴施時(shí),調(diào)整好噴霧速度和噴嘴方向,以保證富硒劑液滴盡可能均勻地分布在葉片上,同時(shí),要保證同

一處理的每株辣椒葉片上噴施的溶液量基本一致。噴施作業(yè)時(shí)按照亞硒酸鈉溶液濃度由低到高的順序

進(jìn)行。

分3次(2020年5月18日、6月1日、6月14日)采摘盆缽中長(zhǎng)度達(dá)到7cm及以上的辣椒果實(shí),稱量

鮮質(zhì)量;同一缽辣椒前后3次采樣鮮果組成1個(gè)樣品,果質(zhì)量累加值作為每缽辣椒的產(chǎn)量。每個(gè)處理選取

產(chǎn)量居中的3個(gè)盆缽辣椒,作為試驗(yàn)的平行樣本。

采摘的辣椒果實(shí)清洗晾干后,置于-4℃冰柜保存,鮮樣用于測(cè)定總糖和維生素C含量;同時(shí)根據(jù)需

要從每個(gè)樣品中選取部分果實(shí)殺青、烘干,用于測(cè)定總硒、有機(jī)硒、礦質(zhì)元素以及粗蛋白含量。

1.6 指標(biāo)測(cè)定方法

總硒和有機(jī)硒含量測(cè)定參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB5009.93—2017《食品中硒的測(cè)定》;總糖含量采用硫酸蒽酮比

色法測(cè)定;維生素C含量采用2,6-二氯靛酚法測(cè)定;粗蛋白質(zhì)含量測(cè)定參照《土壤農(nóng)化分析》中的方法;微量

元素鈣、鎂、鐵、鋅、銅等含量測(cè)定分別參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB5009.92—2016《食品中鈣的測(cè)定》、GB5009.241—2017

《食品中鎂的測(cè)定》、GB5009.90—2016《食品中鐵的測(cè)定》、GB5009.14—2017《食品中鋅的測(cè)定》、

GB5009.13—2017《食品中銅的測(cè)定》。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 噴施亞硒酸鈉對(duì)辣椒產(chǎn)量的影響

從圖1可以看出,隨著葉面噴施亞硒酸鈉濃度的增加,辣椒產(chǎn)量呈現(xiàn)出先增后降的趨勢(shì)。噴施

100mg/L亞硒酸鈉的辣椒產(chǎn)量最高,3缽辣椒平均鮮果質(zhì)量為617.9g,比對(duì)照增產(chǎn)29%,差異顯著

(P<0.05);隨著噴施亞硒酸鈉濃度的增加,辣椒產(chǎn)量則梯次下降。當(dāng)噴施質(zhì)量濃度為200mg/L時(shí),每缽

60 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

辣椒的平均產(chǎn)量只有413.7g,僅為對(duì)照產(chǎn)量的86.4%,減產(chǎn)顯著(P<0.05)?？梢?噴施50~100mg/L亞

硒酸鈉可以提高辣椒產(chǎn)量,而亞硒酸鈉質(zhì)量濃度超過150mg/L時(shí),則會(huì)抑制辣椒產(chǎn)量的增加。

圖1 噴施不同濃度亞硒酸鈉對(duì)基質(zhì)栽培辣椒產(chǎn)量的影響

Fig.1 Effectofsprayingdifferentconcentrationsofdisodiumseleniteonpepperyieldinsubstrateculture

注:不同英文字母表示差異顯著(P<0.05),CK為對(duì)照處理。

2.2 噴施亞硒酸鈉對(duì)辣椒果實(shí)硒含量的影響

葉面噴施不同質(zhì)量濃度的亞硒酸鈉對(duì)辣椒果實(shí)中硒含量、形態(tài)都有一定的影響(表1)。由表1可以

看出,隨著葉面噴亞硒酸鈉質(zhì)量濃度的梯次增加,辣椒果實(shí)中總硒含量也逐步增加;相較于低濃度亞硒酸

鈉處理,高濃度處理辣椒果實(shí)中總硒含量的增幅則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。本試驗(yàn)中最高濃度亞硒酸鈉噴施處理

的辣椒果實(shí)中總硒含量亦達(dá)到最大值,平均含量為2.322mg/kgDW。當(dāng)噴施低于100mg/L亞硒酸鈉

時(shí),辣椒果實(shí)中有機(jī)硒含量隨著噴施溶液濃度的增加而快速增加;當(dāng)噴施大于100mg/L亞硒酸鈉時(shí),辣

椒果實(shí)中有機(jī)硒含量則不再增加,而是呈現(xiàn)一定的波動(dòng)狀態(tài)。

回歸擬合分析發(fā)現(xiàn),辣椒果實(shí)中總硒含量(YTSe)、有機(jī)硒含量(YOSe)與葉面噴施亞硒酸鈉質(zhì)量濃度

(x)之間存在著較顯著的二次多項(xiàng)式相關(guān)性,其回歸方程為YTSe=-0.1031x2+1.2232x-1.2041,R2=

0.9180;YOSe=-0.1160x2+1.0825x-1.0403,R2=0.8815。

表1數(shù)據(jù)還表明,辣椒果實(shí)中有機(jī)硒占總硒的百分比隨著噴施亞硒酸鈉濃度的增加呈現(xiàn)出先升后降

的趨勢(shì)。當(dāng)亞硒酸鈉噴施質(zhì)量濃度為50mg/L時(shí),辣椒果實(shí)中有機(jī)硒占總硒比例為78.1%,是5個(gè)處理

中的最高值;當(dāng)亞硒酸鈉噴施質(zhì)量濃度為100mg/L時(shí),辣椒果實(shí)中有機(jī)硒占總硒比例降為76.9%,降幅

有限;噴施150、200 mg/L 亞硒酸鈉時(shí),辣椒果實(shí)中有機(jī)硒占總硒比例分別為69.5%、63.0%,均低

于70%。

表1 噴施不同濃度亞硒酸鈉辣椒果實(shí)中總硒和有機(jī)硒含量

Table1 Totalandorganicseleniumcontentsinpepperfruitssprayedwithsodiumseleniteofdifferentconcentrations

ρ(亞硒酸鈉)/(mg/L) 總硒含量/(mg/kg) 有機(jī)硒含量/(mg/kg) 有機(jī)硒占總硒百分比/%

0(CK) 0.056±0.021d 0.039±0.012d 70.1

50.0 0.424±0.034c 0.331±0.039c 78.1

100.0 1.918±0.019b 1.474±0.051a 76.9

150.0 1.938±0.028b 1.347±0.114b 69.5

200.0 2.322±0.169a 1.462±0.144a 63.0

注:同列不同字母表示差異顯著(P<0.05),CK為對(duì)照處理。下同。

2.3 噴施不同濃度亞硒酸鈉對(duì)辣椒果實(shí)中礦質(zhì)元素含量的影響

從表2可以看出,辣椒果實(shí)中Ca的含量隨著葉面噴施亞硒酸鈉溶液質(zhì)量濃度的增加而增加,且質(zhì)量

濃度高于100mg/L的3個(gè)處理辣椒果實(shí)中Ca含量均顯著高于對(duì)照(P<0.05)。不同質(zhì)量濃度亞硒酸

鈉噴施處理的辣椒果實(shí)中的 Mg含量均低于對(duì)照,但各處理間差異不顯著(P>0.05)。辣椒果實(shí)中微量

元素Fe的含量隨著噴施硒濃度的增加而增加,且4個(gè)施用硒肥的處理均顯著高于不施硒肥的對(duì)照

第38卷第1期 趙丹丹,等:葉面噴施亞硒酸鈉對(duì)基質(zhì)栽培辣椒產(chǎn)量和品質(zhì)的影響 61

(P<0.05)。微量元素Zn、Cu的含量則隨著葉面噴施亞硒酸鈉溶液濃度的增加呈先增后降趨勢(shì),當(dāng)噴施

質(zhì)量濃度為150mg/L時(shí),辣椒果實(shí)中Zn的含量為37.29mg/kg,Cu的含量為48.33mg/kg,均為各處

理中的最高值,顯著高于對(duì)照(P<0.05)。

表2 噴施不同濃度亞硒酸鈉對(duì)辣椒礦質(zhì)元素含量的影響

Table2 Effectsofsprayingdifferentconcentrationsofsodiumseleniteonthecontentofmineralelementsinpepper

ρ(亞硒酸鈉)/(mg/L) Ca/(mg/kg) Mg/(mg/kg) Fe/(mg/kg) Zn/(mg/kg) Cu/(mg/kg)

0(CK) 393.6±30.3b 489.4±3.1 52.32±7.38b 28.08±1.55c 40.97±0.28c

50.0 399.9±16.8b 484.7±2.6 66.34±8.02a 28.67±2.83c 45.70±0.47bc

100.0 459.4±10.4a 488.9±4.3 68.41±4.42a 35.14±2.09ab 48.14±0.61a

150.0 489.6±15.9a 481.4±5.8 77.78±8.72a 37.29±0.39a 48.33±0.50a

200.0 493.5±22.2a 487.6±3.4 78.07±4.61a 32.62±1.52b 46.87±0.84ab

2.4 噴施不同濃度亞硒酸鈉對(duì)辣椒果實(shí)品質(zhì)的影響

由表3可知,葉面噴施亞硒酸鈉對(duì)辣椒果實(shí)中粗蛋白、總糖和維生素C含量等3項(xiàng)品質(zhì)指標(biāo)均有一定

的影響。施用亞硒酸鈉4個(gè)處理的辣椒果實(shí)中粗蛋白的含量均有所增加,且噴施質(zhì)量濃度為50、

100mg/L處理組顯著高于不施硒肥的對(duì)照組(P<0.05);噴施亞硒酸鈉的質(zhì)量濃度高于100mg/L后,

辣椒果實(shí)中粗蛋白的含量又呈現(xiàn)下降態(tài)勢(shì),但差異不顯著(P<0.05)。辣椒果實(shí)中維生素C含量受噴施

亞硒酸鈉濃度影響的響應(yīng)趨勢(shì)與粗蛋白含量的變化規(guī)律相似,即施用亞硒酸鈉的辣椒果實(shí)中維生素C的含

量均高于對(duì)照,其中質(zhì)量濃度為100mg/L的處理辣椒中維生素C含量最高,平均值為34.90mg/100gFW,

顯著高于不施硒肥的對(duì)照(P<0.05),但高濃度(>100mg/L)的亞硒酸鈉對(duì)維生素C含量的增加卻有抑

制作用。與對(duì)粗蛋白、維生素C含量的影響不同,隨著亞硒酸鈉質(zhì)量濃度的增加,辣椒果實(shí)中總糖的含量

一直呈現(xiàn)增加趨勢(shì),施硒各處理的總糖含量依次比對(duì)照(CK)提高2.70%、8.10%、19.59%和58.78%,亞

硒酸鈉噴施質(zhì)量濃度為200mg/L的處理辣椒果實(shí)總糖含量最高,平均值為2.35mg/kgFW,顯著高于

對(duì)照(P<0.05)。

表3 噴施不同濃度亞硒酸鈉對(duì)辣椒果實(shí)品質(zhì)的影響

Table3 Effectsofsprayingdifferentconcentrationsofsodiumseleniteonpepperfruitquality

ρ(亞硒酸鈉)/(mg/L) ω(粗蛋白)/% 總糖/(mg/kg) 維生素C/(mg/100g)

0(CK) 12.61±0.29c 1.48±0.24b 30.48±1.15d

50.0 14.48±1.03ab 1.52±0.17b 33.51±0.56ab

100.0 15.22±1.41a 1.60±0.15b 34.90±1.15a

150.0 13.02±0.42bc 1.77±0.30b 32.66±0.57bc

200.0 13.69±0.76abc 2.35±0.49a 31.30±1.14cd

3 結(jié)論與討論

目前硒元素還沒有明確為植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的營(yíng)養(yǎng)元素,但眾多研究表明,低濃度硒具有促進(jìn)植物

生長(zhǎng)、提高植物耐受能力的功能。本試驗(yàn)結(jié)果與這一提法吻合,當(dāng)葉面噴施50~100mg/L亞硒酸鈉溶液

時(shí),可以顯著提高基質(zhì)栽培辣椒的產(chǎn)量。這可能與硒可促進(jìn)植物抗氧化系統(tǒng)功能發(fā)揮、提高光合效率、修

復(fù)對(duì)環(huán)境脅迫造成的膜結(jié)構(gòu)損傷密切相關(guān)[16]。Haghighi等[17]研究發(fā)現(xiàn),在春夏季節(jié)溫室中高溫環(huán)境下,

施用適量的硒可以提高辣椒葉片POD(過氧化物酶)和SOD(超氧化物歧化酶)活性,降低 MDA(丙二醛)

含量,有利于開花坐果,減少高溫引起的落花落果,促進(jìn)產(chǎn)量的提高。

需要指出的是,硒作為一種有益的微量元素,其有益與毒害作用之間的閾值較小,大部分植物在高濃

度硒環(huán)境下表現(xiàn)出中毒現(xiàn)象,即呈現(xiàn)出“低濃度促進(jìn)、高濃度抑制”的劑量效應(yīng)[18-19]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)噴施

亞硒酸鈉質(zhì)量濃度高于150mg/L時(shí),對(duì)辣椒增產(chǎn)有抑制作用。噴施硒肥5d后,2個(gè)高濃度處理的辣椒

葉片出現(xiàn)了米粒至黃豆大小的淡黃色失綠斑點(diǎn),之后逐漸壞死、焦枯,且噴施濃度越高,葉片上中毒壞死的

斑點(diǎn)越多。這種毒害作用直接影響到葉片的光合作用,最終會(huì)影響辣椒產(chǎn)量。因此,在生產(chǎn)實(shí)踐中,要根

據(jù)作物品種和環(huán)境條件,通過試驗(yàn)確定作物適宜的噴硒濃度與劑量,才能保證在獲得富硒農(nóng)產(chǎn)品的同時(shí),

62 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

農(nóng)作物的產(chǎn)量不降低甚至增產(chǎn)。

噴施硒肥的主要目的是增加辣椒果實(shí)中硒含量,生產(chǎn)富硒農(nóng)產(chǎn)品,滿足人們對(duì)硒營(yíng)養(yǎng)的需求。本試驗(yàn)

條件下,隨著噴施亞硒酸鈉濃度的增加,辣椒果實(shí)中總硒的含量逐漸增加。伴隨著總硒含量的增加,辣椒

果實(shí)中有機(jī)硒的含量也相應(yīng)增加。特別地,當(dāng)噴施亞硒酸鈉質(zhì)量濃度大于100mg/L時(shí),辣椒果實(shí)中有機(jī)

硒含量不再相應(yīng)增加,而呈現(xiàn)出一定的波動(dòng)(表1)。隨著噴施亞硒酸鈉濃度的增加,辣椒果實(shí)中有機(jī)硒占

總硒的比例逐步下降,說明從葉片轉(zhuǎn)移到果實(shí)中的硒越多,以無機(jī)形態(tài)存在的量就更多。中華人民共和國(guó)

供銷合作行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《富硒農(nóng)產(chǎn)品》(GH/T1135—2017)規(guī)定,富硒蔬菜(以干質(zhì)量計(jì))的標(biāo)準(zhǔn)是總硒含量為

0.10~1.00mg/kg,硒代氨基酸占總硒的比例大于65%。顯然,本試驗(yàn)中噴施濃度為200mg/L的處理

的辣椒果實(shí)中兩項(xiàng)指標(biāo)均不達(dá)標(biāo)。硒鹽的毒理研究表明,無機(jī)硒均具有較大的毒性,有機(jī)硒化合物毒性

低,生物利用率高。因此,從食物安全的角度考慮,不宜噴施高濃度的硒肥。

施用硒肥還可以影響植物對(duì)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收與利用,進(jìn)而影響到食用器官中礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素的含

量[20]。王晉民等[21]研究發(fā)現(xiàn),葉面噴施硒肥可不同程度提高胡蘿卜 Ca、Mg、Fe、K 等礦質(zhì)元素的含量;

Wen

[22]指出高濃度硒(Se)對(duì)作物食用器官中Ca、Mg和Zn含量有負(fù)面影響,然而,適宜的硒濃度則具有

積極影響。本試驗(yàn)結(jié)果也表明,適宜濃度的亞硒酸鈉溶液,可以提高辣椒果實(shí)中Ca、Mg、Fe、Zn、Cu的含

量,而濃度較高時(shí),除了Fe元素,其他4個(gè)元素的含量均有下降態(tài)勢(shì)。李磊等[23]研究表明,隨著噴施硒溶

液濃度的上升辣椒果實(shí)中Ca的含量呈上升趨勢(shì),Mg的含量呈先下降后上升態(tài)勢(shì),Fe、Cu的含量則呈現(xiàn)

逐漸下降的趨勢(shì),這與本試驗(yàn)結(jié)果存在較大差異。Ragályi等[24]研究發(fā)現(xiàn),隨著灌溉水中硒含量的增加,

不同蔬菜食用器官中 Mg、Fe、Zn、Cu等元素的含量變化因蔬菜品種、土壤類型不同有較大的差異。

Longchamp等[20]添加不同濃度、不同形態(tài)的硒進(jìn)行水培玉米試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)無論硒的形態(tài)與濃度如何,對(duì)玉

米植株中鐵的積累都沒有影響;添加低濃度的硒對(duì)Ca、Mg、Zn、Mn、Cu等元素含量沒有影響;添加高濃度

的硒酸鹽則有利于玉米植株中Ca、Mg、Zn、Mn、Cu元素積累,而亞硒酸鹽或者是硒酸鹽/亞硒酸鹽混合物

則傾向于減少Ca、Mg、Zn、Mn、Cu元素積累,且2種鹽的混合物對(duì)元素積累的抑制作用更顯著。王建

偉[25]研究也發(fā)現(xiàn),無論是土施,還是葉面噴施硒肥,對(duì)玉米、小麥產(chǎn)量及生物量均無顯著影響,對(duì)2種作物

籽粒的 N、P、K、S、Ca、Mg、Fe、Mn、Cu等大中微量元素含量也無顯著影響;而單獨(dú)土施,對(duì)馬鈴薯、小白

菜、大豆等作物的產(chǎn)量、生物量及可食部位上述9種礦質(zhì)元素含量無顯著影響。不難看出,硒對(duì)作物食用

器官中礦質(zhì)元素含量的影響,因作物種類、栽培方式、硒肥形態(tài)及其用量用法、土壤類型等因素不同而存在

較大差異,有待于進(jìn)一步全面而深入的研究。

本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),葉面噴施亞硒酸鈉可以提高辣椒果實(shí)粗蛋白、總糖、維生素C等品質(zhì)指標(biāo)含量,但高

濃度的亞硒酸鈉對(duì)粗蛋白、維生素C含量有抑制效應(yīng)。這與李磊等[23]研究結(jié)果基本一致。陳蓉等[26]研

究表明,臍橙通過葉面施硒能提高果實(shí)中的可溶性糖、維生素C的含量。龔天芝等[27]研究發(fā)現(xiàn),核桃施入

一定量的外源硒,能夠提高核桃果實(shí)品質(zhì)。武文玥等[28]研究表明,隨著亞硒酸鈉濃度的增加,甜蕎籽粒的

蛋白質(zhì)含量與還原糖含量均呈升高的趨勢(shì)。王晉民等[21]研究表明,隨著施用硒濃度增加,胡蘿卜中維生

素C含量呈下降趨勢(shì)。院金謁等[29]研究發(fā)現(xiàn),適量的硒使大蒜中還原糖含量下降。顯然,硒對(duì)作物品質(zhì)

的影響也受到作物種類與品種、施用方法與用量等多種因素的影響。

葉面噴施適量的亞硒酸鈉溶液可以提高溫室環(huán)境下基質(zhì)栽培辣椒果實(shí)的產(chǎn)量和品質(zhì)。在一定的噴施

濃度范圍內(nèi),隨著硒濃度的增加,辣椒產(chǎn)量顯著增加,總硒和有機(jī)硒含量增加,果實(shí)中礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素含量以

及粗蛋白、維生素C、總糖等品質(zhì)指標(biāo)含量均呈上升態(tài)勢(shì)。但噴施高濃度的亞硒酸鈉會(huì)造成辣椒減產(chǎn),且

果實(shí)中硒的總量超標(biāo),有機(jī)硒占比下降,粗蛋白和維生素C含量的提升也受到抑制。綜上,在本試驗(yàn)條件

下,既能增加基質(zhì)栽培辣椒果實(shí)中總硒和有機(jī)硒含量,又有利于提高品質(zhì)和產(chǎn)量,保證食品安全,節(jié)約硒肥

投入成本,葉面噴施50~100mg/L亞硒酸鈉為宜。

第38卷第1期 趙丹丹,等:葉面噴施亞硒酸鈉對(duì)基質(zhì)栽培辣椒產(chǎn)量和品質(zhì)的影響 63

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(責(zé)任編輯:顧文亮)

64 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào),2024,38(1):65-70

JournalofAnhuiScienceandTechnologyUniversity

收稿日期:2023-03-21

基金項(xiàng)目:作 物 抗 逆 育 種 與 減 災(zāi) 國(guó) 家 地 方 聯(lián) 合 工 程 實(shí) 驗(yàn) 室 開 放 基 金 (NELCOF20190102);安 徽 省 高 校 自 然 科 學(xué) 研 究 項(xiàng) 目

(KJ2017A510,KJ2019A0814);安徽省重點(diǎn)研究與開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(202104a06020001);鳳陽縣科技計(jì)劃項(xiàng)目(NY2022-05)。

作者簡(jiǎn)介:周慧(1986-),女,安徽蚌埠人,碩士研究生,主要從事植物病害生物防治研究,E-mail:61787447@qq.com。

通信作者:段海明,副教授,E-mail:duanhm@ahstu.edu.cn。

生防菌代謝產(chǎn)物與化學(xué)殺菌劑對(duì)棉花枯萎病菌的

抑制活性研究

周 慧, 段海明* , 楊勝雨, 張 健

(安徽科技學(xué)院 農(nóng)學(xué)院,安徽 鳳陽 233100)

摘 要:目的:為更有效防治棉花枯萎病和研制新型生物農(nóng)藥提供技術(shù)依據(jù),本研究探究生防菌代謝產(chǎn)物

與化學(xué)殺菌劑對(duì)棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum)的抑制活性。方法:采用對(duì)峙

培養(yǎng)法、菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定生防菌、發(fā)酵上清液、脂肽粗提物以及化學(xué)殺菌劑對(duì)棉花枯萎病菌的抑制特性。

結(jié)果:對(duì)峙培養(yǎng)法得出生防菌SJ06對(duì)棉花枯萎病菌的抑制率為78.24%。發(fā)酵上清液的濃度從6.25μL/mL

增至100.00μL/mL對(duì)病菌的抑制率從46.90%增至80.30%,其對(duì)病菌的EC50 為7.37μL/mL;脂肽粗

提物的質(zhì)量濃度從673.96μg/mL增至8120.00μg/mL對(duì)病菌的抑制率從19.90%增至77.30%,對(duì)病

菌的EC50 為2720.20μg/mL。棉花枯萎病菌對(duì)多菌靈、戊唑醇的敏感性較高,戊唑醇和多菌靈對(duì)病菌的

EC50 分別為0.34、0.49μg/mL;其次分別為腈菌唑、苯醚甲環(huán)唑和丙環(huán)唑,其對(duì)病菌的EC50 分別為1.07、

1.34、1.54μg/mL,而丙森鋅對(duì)病菌的抑制活性較差,EC50 為63.25μg/mL。結(jié)論:解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵

代謝物和戊唑醇等麥角甾醇生物合成抑制劑對(duì)棉花枯萎病菌具有較好的抑制活性。

關(guān)鍵詞:棉花枯萎病;生防菌代謝產(chǎn)物;化學(xué)殺菌劑

中圖分類號(hào):S471 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1673-8772(2024)01-0065-06

開放科學(xué)(資源服務(wù))標(biāo)識(shí)碼(OSID): DOI:10.19608/j.cnki.1673-8772.2024.0011

Inhibitoryactivityofmetabolitesofbiocontrolbacteriaandchemical

fungicidesagainstFusariumoxysporumf.sp.vasinfectum

ZHOU Hui, DUAN Haiming

* , YANGShengyu, ZHANGJian

(CollegeofAgriculture,AnhuiScienceandTechnologyUniversity,Fengyang233100,China)

Abstract:Objective:Inordertoprovidetechnicalbasisformoreeffectivepreventionandcontrolof

cottonFusarium wiltandthedevelopmentofnew biologicalpesticides,thisstudyexploredthe

inhibitoryactivityof metabolitesofbiocontrolbacteriaandchemicalfungicidesagainstFusarium

oxysporumf.sp.vasinfectum.Methods:Theinhibitioncharacteristicsofbiocontrolbacteria,fermentation

supernatant,lipopeptidecrudeextractandchemicalfungicidesoncottonFusariumwiltweredetermined

byconfrontationculture methodand mycelialgrowthrate method.Results:Theinhibitionrateof

biocontrolstrainSJ06againstcottonFusarium wiltwas78.24% byconfrontationculture.Whenthe

concentrationoffermentationsupernatantincreasedfrom6.25μL/mLto100.00μL/mL,theinhibitionrate

increasedfrom46.90%to80.30%,andtheEC50 was7.37μL/mL.Theinhibitionrateincreasedfrom

19.90%to77.30% whentheconcentrationoflipopeptidecrudeextractincreasedfrom673.96μg/mLto

8120.00μg/mL,andtheEC50oflipopeptidecrudeextracttopathogenwas2720.20μg/mL.Cotton

Fusariumwiltwashighlysensitivetocarbendazimandtebuconazole.TheEC50tothepathogenwas

0.34μg/mLand0.49μg/mL,respectively.TheEC50 ofmyclobutanil,difenoconazoleandpropiconazole

againstpathogenswere1.07,1.34,1.54μg/mL,respectively.Theinhibitoryactivityofpropinebagainst

bacteriawaspoor,theEC50 was63.25μg/mL.Conclusion:Bacillusamyloliquefaciensfermentation

metabolitesandergosterolbiosynthesisinhibitorssuchastebuconazolehavegoodinhibitoryactivity

againstFusariumoxysporumf.sp.vasinfectum.

Keywords:CottonFusariumwilt;Metabolitesofbiocontrolbacteria;Chemicalfungicides

棉花是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一,其產(chǎn)量一直位于世界前列,然而棉花枯萎病對(duì)我國(guó)乃至全球范圍內(nèi)

的棉花產(chǎn)量與質(zhì)量均造成嚴(yán)重?fù)p失,屬于毀滅性病害[1]。棉花枯萎病在棉花整個(gè)生育期都會(huì)引起危害,苗

期會(huì)引起棉苗大量死亡,棉花生長(zhǎng)后期會(huì)導(dǎo)致植株枯萎、鈴重減輕,對(duì)棉花種子的發(fā)芽率、成熟度以及棉花

纖維的強(qiáng)度與長(zhǎng)度都會(huì)產(chǎn)生重要影響,開展該病害的防治措施研究具有重要意義[2]。

目前,棉花枯萎病的防治措施主要以化學(xué)防治為主。李海微等[3]得出0.30%四霉素水劑可有效防治

南疆地區(qū)棉花枯萎病 DD11和 DD22菌株,抑菌效果分別達(dá)97.91%和99.35%;郭明程等[4]研究表明

60%吡唑醚菌酯·代森聯(lián) WG以1080g/hm2 的劑量防治棉花枯萎病,防效為58.52%~62.84%,并具

有促生增產(chǎn)作用;鄭德有等[5]發(fā)現(xiàn)寧南霉素對(duì)棉花枯萎病菌抑制率達(dá)68.24%,EC50 為8.03mg/L。生物

防治由于綠色無污染而日益引起研究者的重視。戴蓬博等[6]采用生物學(xué)特性觀察和16SrDNA基因序列

分析等方法得出菌株SC11為壯觀鏈霉菌(Streptomycesspectabilis)是一株棉花枯萎病拮抗菌,其防效可

達(dá)42.51%,且能提高棉花產(chǎn)量。張克誠(chéng)等[7]進(jìn)行了室內(nèi)和田間試驗(yàn)得出了鏈霉菌(Streptomycesspp.)

S-5能有效抑制棉花枯萎病菌,防治效果為66.50%;Hao等[8]從棉花根組織分離得到的內(nèi)生細(xì)菌 DG3-1

抑制棉花枯萎病同時(shí)增加葉綠素含量,鑒定為耐鹽農(nóng)桿菌(Agrobacteriumspp.)。趙瑩瑩等[9]采用枯草

芽孢桿菌 KXZ-33發(fā)酵液處理種子和地上部噴施10mg/L的甲基硫菌靈相結(jié)合可以提高防治棉花枯萎

病的效果;高景凱等[10]從廣東石豆蘭中篩選內(nèi)生細(xì)菌-枯草芽孢桿菌BK27發(fā)酵液,其對(duì)棉花枯萎病尖孢鐮

刀菌萎蔫?；鸵种坡蕿?0.78%。化學(xué)農(nóng)藥大量過頻使用會(huì)引起病菌抗藥性、藥物殘留和環(huán)境污染等突出

問題威脅農(nóng)產(chǎn)品安全[11]。生物防治對(duì)環(huán)境無污染,但是對(duì)病害發(fā)揮效應(yīng)較為緩慢。因此,化學(xué)防治和生物防

治結(jié)合起來開展棉花枯萎病的防治具有重要意義。本研究開展了8種化學(xué)殺菌劑對(duì)棉花枯萎病菌的室內(nèi)抑

制活性和解淀粉芽孢桿菌所產(chǎn)發(fā)酵上清液和脂肽粗提物對(duì)病菌的的抑制效果研究,旨在篩選出對(duì)棉花枯萎

病菌抑制效果較好的化學(xué)藥劑和生防菌株,從而為后續(xù)棉花枯萎病的綜合治理提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試殺菌劑 95%苯醚甲環(huán)唑原藥、96%戊唑醇原藥、96%腈菌唑原藥、96%多菌靈原藥、95%甲

基硫菌靈原藥、97.6%萎銹靈原藥、95.6%丙環(huán)唑原藥由安徽省錦江農(nóng)化有限公司提供。70%丙森鋅可濕

性粉劑由拜耳作物科學(xué)有限公司提供。多菌靈使用0.1mol/LHCl溶液配成1.0×104μg/mL,其它殺菌

劑原藥采用丙酮溶解,配制成1.0×104μg/mL母液,置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?丙森鋅由滅菌水溶解配

制而成。

1.1.2 供試菌株和培養(yǎng)基 棉花枯萎病病菌(Fusariumoxysporiumf.sp.vasinfectum)和解淀粉芽孢

66 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)SJ06由本研究室提供。供試培養(yǎng)基包括PDA 培養(yǎng)基、NA 培養(yǎng)基和

NB培養(yǎng)基[12]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 解淀粉芽孢桿菌SJ06與棉花枯萎病菌的對(duì)峙培養(yǎng) 接種環(huán)挑取SJ06菌苔接入距PDA平板中心

相互垂直2cm的四點(diǎn)處,再將棉花枯萎病菌菌餅(直徑7mm)接至平板中心,以不接細(xì)菌的平板為對(duì)照,

重復(fù)3次,置于26℃恒溫箱中培養(yǎng),4d后測(cè)量病菌直徑,計(jì)算抑制率。

1.2.2 不同稀釋倍數(shù)的發(fā)酵上清液對(duì)棉花枯萎病菌的抑制活性測(cè)定 接種解淀粉芽孢桿菌SJ06至 NB

培養(yǎng)基中,發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為72h。培養(yǎng)結(jié)束后以10000r/min,4℃離心制得發(fā)酵上清液分別稀釋到不同

的濃度,然后取5mL加入到冷卻到50℃左右的45mLPDA培養(yǎng)基充分混勻,使得發(fā)酵上清液在PDA

培養(yǎng)基中的終濃度分別為6.25、8.33、12.50、25.00和100.00μL/mL,中央接種病菌后置于26℃恒溫箱

中培養(yǎng)96h,然后按照十字交叉法測(cè)定不同稀釋倍數(shù)的發(fā)酵上清液處理病菌的菌落直徑,采用SPSS13.0

軟件計(jì)算發(fā)酵上清液對(duì)棉花枯萎病菌的EC50。

1.2.3 脂肽粗提物的制備及抑制活性測(cè)定 采用李寶慶等[13]方法制備脂肽粗提物,將制得的脂肽粗提

物稀釋不同梯度,取5mL的脂肽粗提物與冷卻到50℃的45mLPDA培養(yǎng)基充分混勻,使得脂肽粗提物

的含量分別為673.96、1015.00、2030.00、4060.00、8120.00μg/mL。然后計(jì)算脂肽粗提液對(duì)棉花枯萎

病菌的EC50。

1.2.4 8種化學(xué)殺菌劑對(duì)棉花枯萎病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定 測(cè)定苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇、腈菌唑、丙環(huán)唑、萎

銹靈、多菌靈、甲基硫菌靈和丙森鋅對(duì)棉花枯萎病菌的抑制活性,8種化學(xué)殺菌劑在PDA中培養(yǎng)基的終濃

度見表1。接種完畢后置于26℃恒溫箱中培養(yǎng)96h,用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。采用SPSS13.0軟件

求出8種化學(xué)殺菌劑對(duì)病菌的毒力回歸方程、EC50 值、95%置信區(qū)間和R2。

表1 8種化學(xué)殺菌劑質(zhì)量濃度設(shè)置

Table1 Concentrationgradientof8fungicides

殺菌劑 質(zhì)量濃度梯度/(μg/mL)

苯醚甲環(huán)唑 0.1 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0

戊唑醇 0.05 0.10 0.20 0.40 0.80 1.60

腈菌唑 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 16.0

丙環(huán)唑 0.2 0.4 0.8 1.6 3.2 6.4

萎銹靈 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 16.0

多菌靈 0.1 0.2 0.4 0.8 1.6 3.2

甲基硫菌靈 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 16.0

丙森鋅 2 5 50 100 200 500

2 結(jié)果分析

2.1 解淀粉芽孢桿菌SJ06與棉花枯萎病菌對(duì)峙培養(yǎng)結(jié)果

由圖1可見,菌株 SJ06對(duì)棉花枯萎病菌抑制效果明顯,能抑制病菌菌絲生長(zhǎng),抑制率平均值為

78.24%,而且發(fā)現(xiàn)生防菌菌株SJ06可以將病原菌完全包圍,阻止其進(jìn)一步發(fā)生擴(kuò)展下一步可進(jìn)行菌株產(chǎn)

發(fā)酵上清液和脂肽粗提物對(duì)病菌的抑制活性研究。

圖1 解淀粉芽孢桿菌SJ06與棉花枯萎病菌對(duì)峙結(jié)果

Fig.1 EffectofconfrontationculturebetweenB.amyloliquefaciensSJ06andF.oxysporumf.sp.vasinfectum

注:A為菌株SJ06與病菌對(duì)峙結(jié)果;B為對(duì)照。

第38卷第1期 周 慧,等:生防菌代謝產(chǎn)物與化學(xué)殺菌劑對(duì)棉花枯萎病菌的抑制活性研究 67

2.2 不同稀釋倍數(shù)的發(fā)酵上清液對(duì)棉花枯萎病菌的抑制活性

由表2可見,解淀粉芽孢桿菌SJ06發(fā)酵上清液的濃度從6.25μL/mL增至100.00μL/mL,在26℃

恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h對(duì)棉花枯萎病菌的抑制率從46.90%增至80.30%,高濃度的發(fā)酵上清液對(duì)

棉花枯萎病菌抑制作用較強(qiáng)(圖2)。經(jīng)SPSS13.0軟件分析得出發(fā)酵上清液對(duì)棉花枯萎病菌的EC50 為

7.37μL/mL(R2=0.95)。

表2 不同稀釋倍數(shù)的發(fā)酵上清液對(duì)棉花枯萎病菌的抑制率

Table2 InhibitionrateofdifferentdilutiontimesofB.amyloliquefaciensfermentationsupernatanttoF.oxysporiumf.sp.vasinfectum

稀釋倍數(shù) 發(fā)酵上清液濃度/(μL/mL) 抑制率/%

10 100.00 80.30±0.40

40 25.00 71.80±1.10

80 12.50 66.50±1.00

120 8.33 60.20±1.00

160 6.25 46.90±1.00

注:A、B、C、D、E分別為菌株SJ06發(fā)酵上清液稀釋10、40、80、120、160倍;F為對(duì)照。

圖2 不同稀釋倍數(shù)的發(fā)酵上清液對(duì)棉花枯萎病菌的抑制效果

Fig.2 InhibitoryeffectoffermentationsupernatantwithdifferentdilutiontimesonF.oxysporiumf.sp.vasinfectum

2.3 不同稀釋倍數(shù)的脂肽粗提物對(duì)棉花枯萎病菌的抑制活性

由表3、圖3可知,脂肽粗提物的濃度從673.96μg/mL增至8120.00μg/mL,在27℃恒溫恒濕培養(yǎng)

箱中培養(yǎng)96h對(duì)棉花枯萎病菌的抑制率從19.90%增至77.30%(表3),分析得出脂肽粗提物對(duì)棉花枯萎

病菌的EC50 為2720.20μg/mL(R2=0.98)。

表3 不同稀釋倍數(shù)的脂肽粗提物對(duì)棉花枯萎病菌的抑制率

Table3 InhibitionrateofdifferentdilutiontimesofcrudelipopeptideextracttoF.oxysporiumf.sp.vasinfectum

稀釋倍數(shù) 脂肽粗提物質(zhì)量濃度/(μg/mL) 抑菌率/%

100 8120.00 77.30±1.00

200 4060.00 60.50±0.80

400 2030.00 37.80±0.90

800 1015.00 28.60±0.70

1200 673.96 19.90±0.60

注:A為對(duì)照;B、C、D、E、F為脂肽粗提物稀釋1200、800、400、200、100倍。

圖3 不同稀釋倍數(shù)的脂肽粗提物對(duì)棉花枯萎病菌的抑制效果

Fig.3 InhibitoryeffectofcrudelipopeptideextractswithdifferentdilutiontimesonF.oxysporiumf.sp.vasinfectum

68 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

2.4 8種化學(xué)殺菌劑對(duì)棉花枯萎病菌的抑制活性

由表4可知,棉花枯萎病病菌對(duì)戊唑醇的敏感性最高,EC50 為0.34μg/mL,其次為多菌靈,其對(duì)病菌

的EC50 為0.49μg/mL。苯醚甲環(huán)唑和腈菌唑?qū)γ藁菸【腅C50 分別為1.34μg/mL和1.07μg/mL,

丙環(huán)唑?qū)Σ【腅C50 為1.54μg/mL。甲基硫菌靈對(duì)病菌的EC50 為7.87μg/mL,萎銹靈對(duì)病菌的EC50

為10.65μg/mL。丙森鋅對(duì)病菌的抑制活性最差,其EC50 為63.25μg/mL。

表4 8種化學(xué)殺菌劑對(duì)棉花枯萎病菌的毒力測(cè)定

Table4 Toxicitylevelsof8chemicalfungicidestoF.oxysporiumf.sp.vasinfectum

殺菌劑 毒力回歸方程 EC50/(μg/mL) 95%置信區(qū)間 R2

戊唑醇 y=0.057x+1.034 0.34 0.30~0.39 0.94

多菌靈 y=0.036x+0.53 0.49 0.42~0.51 0.94

腈菌唑 y=0.033x-0.141 1.07 0.93~1.22 0.96

苯醚甲環(huán)唑 y=0.034x-0.141 1.34 1.12~1.62 0.91

丙環(huán)唑 y=0.032x-0.26 1.54 1.39~1.71 0.97

甲基硫菌靈 y=0.042x-0.71 7.87 6.51~9.88 0.91

萎銹靈 y=0.035x-0.65 10.65 8.68~13.48 0.98

丙森鋅 y=0.980x-1.91 63.25 56.05~71.36 0.97

3 結(jié)論與討論

棉花枯萎病是棉花生產(chǎn)中的重要土傳病害,一旦發(fā)病難以防治,對(duì)于棉花生產(chǎn)造成了重大威脅[14]。

陳淑珍等[15]在棉花現(xiàn)蕾前連續(xù)使用10%惡霉靈納米乳1500倍液灌根20d之后對(duì)棉花枯萎病菌的防治

效果為97.22%。劉春英[16]發(fā)現(xiàn)多菌靈對(duì)棉花尖孢鐮刀菌的EC50 是0.06mg/L;韓新才等[17]采用生長(zhǎng)

速率法測(cè)定了多菌靈對(duì)棉花枯萎病菌的抑制活性,EC50 達(dá)10.30μg/mL。本研究通過菌絲生長(zhǎng)速率法比

較了8種化學(xué)殺菌劑對(duì)棉花枯萎病的抑制活性得出戊唑醇對(duì)棉花枯萎病的抑制活性優(yōu)異,其 EC50 為

0.34μg/mL;其次多菌靈EC50 為0.49μg/mL,可以看出棉花枯萎病菌對(duì)同一種藥劑的毒力水平存在較

大差異,這與不同來源的菌株有關(guān),所以不同地區(qū)的棉花枯萎病的防控推薦用藥應(yīng)根據(jù)當(dāng)?shù)夭【乃幟粜?/p>

作具體分析隨著農(nóng)藥使用量零增長(zhǎng)以及植病生防的推廣,生防菌的使用能夠明顯減少化學(xué)藥劑的用量,用

于棉花枯萎病的生防菌報(bào)道有短小芽孢桿菌[18]、蠟狀芽孢桿菌 YUPP-10

[19]、壯觀鏈霉菌SC11

[6]等。李

玉洋等[20]采用平板稀釋法分離獲得一株對(duì)棉花枯萎病抑制活性為65.19%的菌株SN06;丁建朋等[21]通

過田間試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌 HFW217對(duì)棉花枯萎病的防效達(dá)80.97%。張一白等[22]通過田間試驗(yàn)

得出奧瑞根(地衣芽孢桿菌制成)可濕性粉劑對(duì)棉花枯萎病的防治效果為28.4%~51.5%。余利等[23]將

解淀粉芽孢桿菌脂肽粗提物分別與克菌丹質(zhì)量比1∶100、代森錳鋅5∶100時(shí),增效系數(shù)SR達(dá)1.78和

1.74。本試驗(yàn)通過菌絲生長(zhǎng)速率法檢測(cè)解淀粉芽孢桿菌SJ06發(fā)酵上清液的10倍稀釋液對(duì)棉花枯萎病菌

的抑制率達(dá)80.2%,而脂肽粗提物100倍稀釋液對(duì)病菌的抑制率達(dá)到77.30%,在棉花枯萎病的生物防控

方面具有潛在的利用價(jià)值。本研究初步探索了生防菌發(fā)酵上清液、脂肽粗提物和8種化學(xué)殺菌劑對(duì)棉花

枯萎病菌的抑制效果,為進(jìn)一步探究化學(xué)殺菌劑和生防菌劑的復(fù)配及其抑制機(jī)理提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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(責(zé)任編輯:顧文亮)

70 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào),2024,38(1):71-76

JournalofAnhuiScienceandTechnologyUniversity

收稿日期:2023-04-25

基金項(xiàng)目:安徽省高校協(xié)同創(chuàng)新項(xiàng)目(GXXT-2021-089);安徽省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金(小麥);國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)

訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(202110879079)。

作者簡(jiǎn)介:陶庭余(2001-),男,安徽蕪湖人,本科生,主要從事作物栽培生理生態(tài)研究,E-mail:taotingyu2023@163.com。

通信作者:李文陽,教授,E-mail:liwy@ahstu.edu.cn。

密度和鉀肥及其互作對(duì)小麥莖稈

形態(tài)特征與抗倒性的影響

陶庭余, 王榮圓, 魏 鵬, 閆素輝, 李文陽*

(安徽科技學(xué)院 農(nóng)學(xué)院,安徽 鳳陽 233100)

摘 要:目的:探索安徽沿淮地區(qū)小麥品種對(duì)種植密度及鉀肥的響應(yīng)。方法:以‘華成3366’為材料,設(shè)置

2個(gè)種植密度(240萬株/hm2、300萬株/hm2)和3個(gè)鉀肥水平(60、120、180kg/hm2)二因素裂區(qū)試驗(yàn),對(duì)

其株高、重心高度、基部第2節(jié)形態(tài)特征及內(nèi)含物、莖稈機(jī)械強(qiáng)度及抗倒伏指數(shù)等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果:在

D2 水平下小麥的株高、重心高和節(jié)間長(zhǎng)較D1 水平下有所增加,分別增加3.92、2.29、0.58cm。在 D2 水

平下的節(jié)間直徑、節(jié)間壁厚、節(jié)間干質(zhì)量、纖維素、半纖維素、木質(zhì)素以及節(jié)間針刺力和節(jié)間抗折力較 D1

有所減少,導(dǎo)致莖粗系數(shù)、節(jié)間充實(shí)度、抗倒伏指數(shù)降低,分別降低0.04、3.21g/mm2、0.08。在 K1 水平

下小麥株高、重心高、節(jié)間長(zhǎng)較 K2、K3 水平下有所增加。在 K1 水平下小麥節(jié)間直徑、節(jié)間壁厚、節(jié)間干質(zhì)

量、纖維素、半纖維素、木質(zhì)素以及節(jié)間針刺力和節(jié)間抗折力較 K2、K3 水平下有所減少,導(dǎo)致莖粗系數(shù)、節(jié)

間充實(shí)度、抗倒伏指數(shù)減少。相關(guān)性分析表明,株高、重心高與抗倒伏指數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān),與節(jié)間壁厚、

纖維素呈顯著正相關(guān)。結(jié)論:本試驗(yàn)條件下,隨著鉀肥水平的提高,小麥莖粗系數(shù)、節(jié)間直徑和節(jié)間干質(zhì)量

增加,進(jìn)而增強(qiáng)小麥的抗倒伏能力,因此可通過增加鉀肥施用量提高小麥抗倒伏性能。

關(guān)鍵詞:小麥;鉀肥;莖稈;抗倒伏

中圖分類號(hào):S852.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1673-8772(2024)01-0071-06

開放科學(xué)(資源服務(wù))標(biāo)識(shí)碼(OSID): DOI:10.19608/j.cnki.1673-8772.2024.0012

Effectsofdensity,potassiumfertilizerandtheirinteractiononstem

morphologicalcharacteristicsandlodgingresistanceofwheat

TAOTingyu, WANGRongyuan, WEIPeng, YANSuhui, LIWenyang

*

(CollegeofAgriculture,AnhuiScienceandTechnologyUniversity,Fengyang233100,China)

Abstract:Objective:Toexploretheresponseofwheatvarietiestoplantingdensityandpotassium

fertilizerinAnhuialongtheHuaiheRiverregion.Methods:TakingHuacheng3366asthematerial,a

two-factorsplit-plotexperimentwassetupwithsowingrate(2.4million/hm2,3million/hm2)and

potassiumfertilizerlevel (60,120,180kg/hm2).Theplantheight,heightofcenterofgravity,

morphologicalcharacteristicsandinclusionsofthesecondsectionofthebase,culm mechanicalstrength

andlodgingresistanceindexweremeasured.Results:Theresultsshowedthattheplantheight,height

ofcenterofgravityandinternodelengthofwheatunderD2levelincreasedby3.92,2.29,0.58cm,

respectively,comparedwiththoseunderD1level.AttheD2level,theinternodediameter,internode

wallthickness,internodedry weight,cellulose,hemicellulose,lignin,andinternodepin-staband

internodefractureresistancewerereducedcomparedwithD1,resultinginstemindiameter,internode

fillingrate,andlodgingresistanceindexdecreasedby0.04,3.21g/mm2and0.08,respectively.The

plantheight,heightofcenterofgravityandinternodelengthatK1levelwerehigherthanthoseatK2

andK3levels.Comparedwith K2 andK3levels,theinternodediameter,internodewallthickness,

internodedryweight,cellulose,hemicellulose,lignin,andinternodepin-stabandinternodefracture

underK1levelwerereduced,resultingreductioninstemindiameter,internodefillingrate,andlodging

resistanceindex.Correlationanalysisshowedthatplantheightandheightofcenterofgravitywere

significantlynegativelycorrelatedwithlodgingresistanceindex,andsignificantlypositivelycorrelated

withinternodewallthicknessandcellulose.Conclusion:Undertheconditionsofthisexperiment,with

theincreaseofpotassiumfertilizerlevels,thestemindiameter,internodediameterandinternodedry

weightofwheatincreased,thusenhancingthelodgingresistanceofwheat.Therefore,thelodging

resistanceofwheatcouldbeimprovedbyincreasingtheamountofpotassiumfertilizer.

Keywords:Wheat;Potassiumfertilizer;Stem;Antiinversion

高產(chǎn)是小麥生產(chǎn)追求的重要目標(biāo),而倒伏是限制小麥高產(chǎn)的關(guān)鍵因素之一[1]。特別是在小麥生育后

期,遇連續(xù)陰雨天氣,小麥極易發(fā)生倒伏[2]。且大量的降水會(huì)松動(dòng)根部土壤,加重倒伏的可能性。安徽省

沿淮地區(qū)屬于過渡性氣候,自然災(zāi)害頻繁。沿淮地區(qū)每年約有15%面積小麥田發(fā)生倒伏,致使減產(chǎn)約

25%

[3]。在實(shí)際生產(chǎn)中,會(huì)通過增加播種密度和施肥量來提高產(chǎn)量,但基本苗過多以及施肥的不合理會(huì)導(dǎo)

致倒伏的發(fā)生[4-5]。

小麥倒伏的發(fā)生受品種特性和外部因素的影響,品種特性是由基因型導(dǎo)致的莖稈形態(tài)結(jié)構(gòu)等性狀差

異,外部因素歸結(jié)為栽培措施和自然環(huán)境[6]。關(guān)于小麥倒伏的影響因素,國(guó)內(nèi)外學(xué)者有多方面的研究,但

結(jié)論不一。有學(xué)者研究表明小麥的抗倒性能與莖稈基部節(jié)間的機(jī)械強(qiáng)度、形態(tài)特征有關(guān)[7-9];但也有學(xué)者

研究木質(zhì)素和纖維素的含量對(duì)倒伏的影響[10-12]。

本試驗(yàn)以小麥品種‘華成3366’為材料,設(shè)置不同種植密度和鉀肥處理,研究不同種植密度和鉀肥對(duì)

其株高、重心高、節(jié)間長(zhǎng)、節(jié)間直徑、節(jié)間壁厚和節(jié)間干質(zhì)量等6個(gè)農(nóng)藝性狀,抗折力和針刺力2個(gè)力學(xué)特

性以及半纖維素、纖維素和木質(zhì)素含量等3個(gè)非結(jié)構(gòu)性碳水化合物等的影響,進(jìn)而分析抗倒伏指數(shù)與莖稈

農(nóng)藝性狀等參數(shù)的關(guān)系,旨在為小麥抗倒伏育種和豐產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2018—2019年在安徽科技學(xué)院種植園進(jìn)行。以小麥品種華成3366為試驗(yàn)材料,試驗(yàn)采用大田

種植,裂區(qū)設(shè)計(jì),密度處理為主區(qū),鉀肥為副區(qū),試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù),與10月下旬播種,試驗(yàn)地前茬作物為玉米,

設(shè)2個(gè)密度水平(240萬株/hm2(D1)、300萬株/hm2(D2))和3個(gè)鉀肥水平(60kg/hm2(K1)、120kg/hm2(K2)、

180kg/hm2(K3))。小區(qū)面積為9m2(3m×3m),行距15cm。田間管理同常規(guī)生產(chǎn)。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1 株高、重心高的測(cè)定 于乳熟期在每個(gè)小區(qū)選取15株有代表性的小麥,用鋼尺測(cè)量株高和重心

高度。

72 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2023年

1.2.2 節(jié)間長(zhǎng)、節(jié)間直徑、節(jié)間壁厚和莖粗系數(shù)的測(cè)定 于乳熟期在每個(gè)小區(qū)選取15株有代表性的小

麥,用直尺和游標(biāo)卡尺測(cè)定其基部二節(jié)間的節(jié)間長(zhǎng)、節(jié)間直徑及節(jié)間壁厚。莖粗系數(shù)為節(jié)間直徑/節(jié)間長(zhǎng)

的數(shù)值[13]。

1.2.3 節(jié)間干質(zhì)量和節(jié)間充實(shí)度的測(cè)定 于乳熟期在每個(gè)小區(qū)選取15株有代表性的小麥,取小麥基部

第二節(jié)間莖稈,放入烘箱內(nèi),105℃殺青30min,在80℃下烘干至質(zhì)量恒定,稱量基部節(jié)間干質(zhì)量。節(jié)間

充實(shí)度為節(jié)間干質(zhì)量/節(jié)間長(zhǎng)的數(shù)值。

1.2.4 莖稈半纖維素、纖維素和木質(zhì)素含量的測(cè)定 于乳熟期在每個(gè)小區(qū)選取15株有代表性的小麥,取

小麥基部二節(jié)間莖稈,烘干至質(zhì)量恒定,粉碎,過篩,參照 Van-soest等[14]方法測(cè)定半纖維素、纖維素及木

質(zhì)素含量。

1.2.5 莖稈機(jī)械強(qiáng)度和抗倒伏指數(shù)的測(cè)定 于乳熟期在每個(gè)小區(qū)選取15株有代表性的小麥,取小麥基

部二節(jié)間莖稈,用 YDD-1莖稈強(qiáng)度測(cè)定儀(浙江托普儀器有限公司)測(cè)定基部二節(jié)間抗折力、針刺力?？?/p>

倒伏指數(shù)為抗折力/重心高的數(shù)值[15]。

1.3 數(shù)據(jù)分析與處理

采用Excel2016、DPS進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用 Origin作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種植密度和鉀肥對(duì)株高與重心高的影響

由圖1~2可知,種植密度、鉀肥對(duì)小麥的株高和重心高有極顯著影響。種植密度和鉀肥互作對(duì)小麥

的株高和重心高有極顯著影響。隨種植密度的增加,小麥的株高和重心也隨著增高,在D2 水平下株高和

重心高較D1 增加3.92、2.29cm。隨鉀肥水平的增加,小麥的株高和重心高均隨之顯著降低,在 K3 水平

下株高較 K1、K2 降低4.36、0.20cm,重心高較 K1、K2 降低3.83、1.07cm。由此可見,種植密度的增加

會(huì)增加小麥的株高,在相同的種植密度下,鉀肥會(huì)降低重心高。

圖1 密度和鉀肥水平對(duì)株高的影響

Fig.1 Effectsofdensityandpotassiumlevelonplantheight

圖2 密度和鉀肥水平對(duì)重心高的影響

Fig.2 Effectsofdensityandpotassiumlevelonhighcenterofgravity

注:誤差線為標(biāo)準(zhǔn)誤,小寫字母表示P<0.05。

2.2 不同種植密度和鉀肥對(duì)莖粗系數(shù)的影響

由表1可知,種植密度、鉀肥對(duì)小麥的節(jié)間長(zhǎng)、節(jié)間直徑、莖粗系數(shù)有極顯著的影響。種植密度和鉀肥

互作對(duì)小麥的節(jié)間長(zhǎng)和莖粗系數(shù)有極顯著影響,對(duì)節(jié)間直徑有顯著影響。隨密度的增加,小麥的節(jié)間長(zhǎng)增

加,節(jié)間直徑和莖粗系數(shù)降低,在D2 水平下節(jié)間長(zhǎng)較 D1 增加0.58cm,節(jié)間直徑和莖粗系數(shù)較 D1 降低

0.11m和0.04。隨著鉀肥水平增加,小麥的節(jié)間長(zhǎng)降低,節(jié)間直徑和莖粗系數(shù)增加,在 K1 水平下節(jié)間長(zhǎng)

較K2、K3 降低0.65、0.92cm,在K3 水平下節(jié)間直徑較K1、K2 增加0.12、0.02cm,莖粗系數(shù)較K1、K2 增

加0.08、0.01。

第37卷第6期 陶庭余,等:密度和鉀肥及其互作對(duì)小麥莖稈形態(tài)特征與抗倒性的影響 73

表1 密度和鉀肥水平對(duì)基部二節(jié)間的影響

Table1 Effectsofdensityandpotassiumfertilizerlevelsonthebasalinter-segment

種植密度 鉀肥水平 節(jié)間長(zhǎng)/cm 節(jié)間直徑/cm 莖粗系數(shù)

D1 K1 7.91±0.48b 3.76±0.4c 0.45±0.01d

K2 7.58±0.57cd 3.84±0.35ab 0.52±0.01a

K3 7.45±0.36d 3.87±0.38a 0.52±0.01a

D2 K1 9.01±0.77a 3.64±0.24d 0.41±0.01e

K2 8.04±0.66b 3.74±0.39c 0.47±0.01c

K3 7.62±0.56c 3.76±0.36bc 0.49±0.01b

F D 179.17** 8.92** 222.60**

K 200.69** 23.41** 166.98**

D×K 44.51** 0.03 8.17**

注:同列不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05);* 為0.05水平,差異顯著;** 為0.01水平,差異顯著,D為密度;K為鉀肥。

下同。

2.3 不同種植密度和鉀肥對(duì)節(jié)間充實(shí)度的影響

由表2可知,種植密度、鉀肥對(duì)小麥的節(jié)間壁厚和節(jié)間充實(shí)度均有極顯著影響,對(duì)節(jié)間干質(zhì)量有顯著

影響。種植密度和鉀肥互作對(duì)節(jié)間壁厚有極顯著影響,對(duì)節(jié)間干質(zhì)量和節(jié)間充實(shí)度沒有顯著差異。隨密

度增加小麥的節(jié)間壁厚、節(jié)間干質(zhì)量和節(jié)間充實(shí)度下降,在D2 水平下節(jié)間壁厚、節(jié)間干質(zhì)量和節(jié)間充實(shí)度

較D1 降低0.12m、0.01g、3.21g/mm2。隨鉀肥的增加節(jié)間壁厚、節(jié)間干質(zhì)量和節(jié)間充實(shí)度增加。節(jié)間壁

厚在 K3 水平下較 K1、K2 增加0.17、0.07m。節(jié)間干質(zhì)量在 K3 水平下較 K1、K2 增加0.02、0.01g。節(jié)

間充實(shí)度在 K3 水平下較 K1、K2 增加4.02、1.74g/mm2。

表2 密度和鉀肥水平對(duì)基部二節(jié)間充實(shí)度的影響

Table2 Effectsofdensityandpotassiumfertilizerlevelonthefullnessofthebaseinter-segment

種植密度 鉀肥 節(jié)間壁厚/m 節(jié)間干質(zhì)量/g 節(jié)間充實(shí)度/(g/mm2)

D1 K1 0.61±0.09d 0.15±0.02b 18.93±1.8bc

K2 0.76±0.12b 0.16±0.01ab 20.94±1.6ab

K3 0.87±0.15a 0.17±0.02a 23.08±2.19a

D2 K1 0.58±0.15e 0.14±0.02b 15.62±1.68d

K2 0.64±0.09c 0.15±0.02b 18.19±1.55c

K3 0.66±0.12c 0.15±0.01b 19.52±1.28bc

F D 142.60** 5.34* 15.02**

K 208.40** 8.28* 28.53**

D×K 37.86** 0.52 0.16

2.4 不同種植密度和鉀肥對(duì)結(jié)構(gòu)性碳水化合物的影響

由表3可知,種植密度、鉀肥對(duì)小麥的半纖維素和木質(zhì)素均有極顯著影響,對(duì)纖維素有顯著影響。隨

密度的增加,小麥的半纖維素、纖維素、木質(zhì)素含量降低,隨著鉀肥水平增加,小麥的半纖維素、纖維素、木

質(zhì)素含量增加。

表3 密度和鉀肥水平對(duì)小麥基部二節(jié)間結(jié)構(gòu)性碳水化合物的影響

Table3 Effectsofdensityandpotassiumfertilizerlevelsoninter-segmentstructuralcarbohydratesatthebaseofwheat

種植密度 鉀肥水平 ω(半纖維素)/% ω(纖維素)/% ω(木質(zhì)素)/%

D1 K1 0.54±0.01bc 0.69±0.01b 0.15±0.01cd

K2 0.57±0.02b 0.73±0.01a 0.17±0.01a

K3 0.60±0.01a 0.74±0.01a 0.16±0.01b

D2 K1 0.49±0.02d 0.65±0.00c 0.13±0.00d

K2 0.53±0.01cd 0.72±0.01b 0.15±0.00bc

K3 0.56±0.01bc 0.70±0.00b 0.15±0.00bc

F D 26.45** 28.04** 15.02**

K 16.56** 22.46** 28.53**

D×K 0.14 0.30 0.16

2.5 不同種植密度和鉀肥對(duì)力學(xué)性狀和抗倒伏指數(shù)的影響

由表4可知,種植密度、鉀肥對(duì)小麥的針刺力、抗折力和抗倒伏指數(shù)有極顯著影響。種植密度和鉀肥

74 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2023年

互作對(duì)針刺力、抗折力和抗倒伏指數(shù)有極顯著影響。隨著密度增加小麥的節(jié)間針刺力、節(jié)間抗折力和抗倒

伏指數(shù)降低,在D2 水平下,節(jié)間針刺力、節(jié)間抗折力和抗倒伏指數(shù)較D1 降低1.71N、1.92N、0.08。隨著

鉀肥水平的增加小麥的節(jié)間針刺力、節(jié)間抗折力和抗倒伏指數(shù)增加。節(jié)間針刺力在 K3 水平下較 K1、K2

增加1.98、0.94N。節(jié)間抗折力在 K3 水平下較 K1、K2 增加1.88、1.24N?？沟狗笖?shù)在 K3 水平下較

K1、K2 增加0.08、0.04。

表4 密度和鉀肥水平對(duì)小麥基部二節(jié)間力學(xué)性狀與抗倒伏指數(shù)的影響

Table4 Effectsofdensityandpotassiumfertilizerlevelsoninter-segmentmechanicaltraitsandlodgingresistanceindexofwheatbase

種植密度 鉀肥水平 針刺力/N 抗折力/N 抗倒伏指數(shù)

D1 K1 9.83±0.76b 11.92±0.79b 0.35±0.04c

K2 11.4±0.51a 12.75±0.65a 0.39±0.02ab

K3 11.13±0.71a 12.95±0.37a 0.41±0.01a

D2 K1 8.03±0.51c 9.55±0.90d 0.25±0.03e

K2 8.53±0.59c 10.00±0.48c 0.31±0.03d

K3 10.68±1.32ab 12.29±0.54b 0.37±0.03bc

F D 18.83** 84.87** 78.98**

K 42.23** 258.09** 171.36**

D×K 7.12** 28.77** 13.06**

2.6 相關(guān)分析

由表5可知,小麥植株抗倒伏指數(shù)與節(jié)間干質(zhì)量、節(jié)間充實(shí)度、節(jié)間直徑、節(jié)間壁厚、莖粗系數(shù)、木質(zhì)

素、纖維素、半纖維素,節(jié)間針刺力和節(jié)間抗折力呈顯著正相關(guān),而與株高、重心高、節(jié)間長(zhǎng)、木質(zhì)素、纖維

素、半纖維素呈顯著負(fù)相關(guān)。

表5 小麥植株基部二節(jié)間特性與抗倒伏能力的相關(guān)性分析

Table5 Correlationanalysisoftheinter-ganglioncharacteristicsofwheatplantbaseandlodgingresistance

指標(biāo) 抗倒伏指數(shù)

株高 -0.92**

重心高 -0.94**

節(jié)間長(zhǎng) -0.97**

節(jié)間干質(zhì)量 0.88**

節(jié)間充實(shí)度 0.96**

節(jié)間直徑 0.96**

節(jié)間壁厚 0.81*

莖粗系數(shù) 0.92**

節(jié)間針刺力 0.96**

節(jié)間抗折力 0.97**

半纖維素 0.98**

纖維素 0.83*

木質(zhì)素 0.88**

3 結(jié)論與討論

因?qū)π←溞枨蟮奶嵘?較大的播種密度成為小麥高產(chǎn)的保障。在生產(chǎn)中播種密度過大,莖稈發(fā)育力

差[16],倒伏發(fā)生時(shí)期提前,倒伏程度嚴(yán)重[17],同時(shí)株高增加,加大了倒伏風(fēng)險(xiǎn)[18],適當(dāng)?shù)牟シN密度可提高

單株分蘗數(shù)和莖稈質(zhì)量,構(gòu)建合理的群體結(jié)構(gòu),從而有利于防倒伏,增加產(chǎn)量。同時(shí)密度對(duì)節(jié)間壁厚無顯

著影響,莖粗系數(shù)隨密度的增大而減少。研究表明,播種密度會(huì)影響小麥的干物質(zhì)的累積,進(jìn)而影響產(chǎn)

量[19]。本研究中,隨著播種密度增大,株高等農(nóng)藝性狀隨之上升,而節(jié)間直徑、抗折力等隨之降低。

研究表明,合理的鉀肥施用有利于根系生長(zhǎng)[20],小麥莖稈逐漸粗壯,抗倒伏能力增強(qiáng),成穗率提高,籽

粒飽滿[21]。袁志華等[22]研究表明,施用鉀肥對(duì)力學(xué)特性有不同程度的影響,施用鉀肥可顯著提高灌漿期

第37卷第6期 陶庭余,等:密度和鉀肥及其互作對(duì)小麥莖稈形態(tài)特征與抗倒性的影響 75

莖稈基部二節(jié)間的彎曲強(qiáng)度及抗彎剛度。許文燕等[23]認(rèn)為,充足的鉀肥會(huì)使植株莖稈粗壯、強(qiáng)度增大、機(jī)

械性能改善,抗倒伏能力提高。本研究表明,隨著鉀肥水平的提高,小麥莖粗系數(shù)、節(jié)間直徑和節(jié)間干質(zhì)量

增加,進(jìn)而提高小麥的抗倒伏能力,因此可通過增加鉀肥施用量提高小麥抗倒性能。

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(責(zé)任編輯:顧文亮)

76 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2023年

安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào),2024,38(1):77-87

JournalofAnhuiScienceandTechnologyUniversity

收稿日期:2023-10-20

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31970312,32170315);安徽省科技重大專項(xiàng)(202003a06020011)。

作者簡(jiǎn)介:孫紅葉(1995-),女,安徽合肥人,博士研究生,主要從事大豆等農(nóng)產(chǎn)品加工儲(chǔ)藏與綜合利用研究,E-mail:1041228728@qq.com。

通信作者:金日生,助理研究員,E-mail:jinrisheng@hfut.edu.cn。

大豆磷脂酶 D的固定化及其催化功能

孫紅葉, 朱夢(mèng)男, 姚改芳, 張 華, 金日生*

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230009)

摘 要:目的:單因素試驗(yàn)研究大豆磷脂酶D(phospholipaseD,PLD)的固定化工藝以及固定化PLD催化

合成大豆磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)的最佳工藝。方法:首先通過非極性溶劑輔助St?ber法

制備納米級(jí)介孔二氧化硅作為固定化酶的載體,通過吸附-沉淀-交聯(lián)方式將PLD固定,單因素試驗(yàn)優(yōu)化

固定化條件,并對(duì)固定化后的PLD進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征和熱穩(wěn)定性及貯存穩(wěn)定性研究;然后利用固定化PLD以

大豆卵磷脂和L-絲氨酸為底物催化合成PS,并通過單因素試驗(yàn)確定最佳合成工藝;最后對(duì)固定化PLD的

循環(huán)使用性能進(jìn)行研究。結(jié)果:非極性溶劑輔助 St?ber法制備的介孔二氧化硅 BET 比表面積為

948m2/g,氣孔體積為1.35cm3/g,孔徑為8.20nm,平均粒徑為335.10nm,掃描電鏡確定載體的形貌為

近球形結(jié)構(gòu);當(dāng)加入5.00mL乙醇、1.00mL酶液(溫度為35℃、pH 為6.50)、0.40mL戊二醛時(shí),固定化

PLD的相對(duì)酶活達(dá)到最大值(88.39%±1.00%),蛋白固定化率為80.76%±1.30%;70℃時(shí)游離PLD的相

對(duì)酶活剩余15.30%,而固定化PLD的相對(duì)酶活仍然有66.40%,且游離PLD被固定化后半衰期由20d延長(zhǎng)

到50d;當(dāng)乙酸乙酯與乙酸鈉/醋酸緩沖溶液的比為6∶1,卵磷脂與L-絲氨酸的質(zhì)量比為1∶8,反應(yīng)溫度為

40℃,pH為6.50,固定化PLD的加入量為40%,反應(yīng)時(shí)間為12h時(shí),PS的產(chǎn)率達(dá)86.60%±1.40%,純度為

90.30%,且固定化PLD循環(huán)使用7次PS的產(chǎn)率仍有61.70%±1.60%,而游離PLD循環(huán)使用4次PS

的產(chǎn)率只剩余21.60%±1.80%。結(jié)論:介孔二氧化硅固定化PLD的穩(wěn)定性、催化性能均顯著提高,實(shí)現(xiàn)

了PLD的回收重復(fù)使用,降低了生產(chǎn)成本;同時(shí)為PS的固定化酶法工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞:大豆磷脂酶D;固定化酶;轉(zhuǎn)磷脂?；磻?yīng);大豆磷脂酰絲氨酸

中圖分類號(hào):TS214.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1673-8772(2024)01-0077-11

開放科學(xué)(資源服務(wù))標(biāo)識(shí)碼(OSID): DOI:10.19608/j.cnki.1673-8772.2024.0013

ImmobilizationofsoybeanphospholipaseDanditscatalyticfunction

SUN Hongye, ZHU Mengnan, YAOGaifang, ZHANGHua, JINRisheng

*

(SchoolofFoodandBiologicalEngineering,HefeiUniversityofTechnology,Hefei230009,China)

Abstract:Objective:Aone-waytestwasperformedtoinvestigatetheimmobilizationprocessofsoybean

phospholipaseD (PLD)andtheoptimalprocessforimmobilizedPLDtocatalyzethesynthesisof

soybeanphosphatidylserine (PS).Methods:Firstly,nanoscale mesoporoussilicawaspreparedasa

carrierforimmobilizedenzymebynon-polarsolvent-assistedSt?bermethod,andPLDwasimmobilized

byadsorption-precipitation-cross-linking,and the one-way test wascarried outto optimizethe

immobilizationconditionsandtostudythestructuralcharacterizationandthermalandstoragestability

ofimmobilizedPLD.Then,PSwascatalyticallysynthesizedfromimmobilizedPLDbyusingsoybean

lecithinandL-serineassubstrates,andtheoptimalsynthesisprocesswasdeterminedbyaone-waytest.

Finally,therecyclingperformanceofimmobilizedPLDwasinvestigated.Results:Thespecificsurface

areaofthe mesoporoussilicaBET preparedbythenon-polarsolvent-assistedSt?ber method was

948m2/g,thestomatalvolumewas1.35cm3/g,theporesizewas8.20nm,theaverageparticlesize

was335.10nm,andthemorphologyofthecarrierswasdeterminedtobeanear-sphericalstructureby

scanningelectron microscopy.Whenethanolwasaddedinavolumeof5.00 mL,temperaturewas

35℃,pHwas6.50,volumeofenzymewas1.00mL,andvolumeofglutaraldehydewas0.40mL,the

relativeenzymeactivityoftheimmobilizedPLDreachedamaximumof88.39%±1.00%,andthe

proteinimmobilizationratewas80.76%±1.30%.TherelativeenzymeactivityoffreePLDat70℃ was

15.30%remaining,whiletherelativeenzymeactivityofimmobilizedPLDwasstill66.40%,andthe

half-lifeoffreePLDwasprolongedfrom20to50daysafteritwasimmobilized.Whentheratioofethyl

acetatetosodiumacetate/aceticacidbuffersolutionwas6∶1,themassratiooflecithintoL-serinewas

1∶8,thereactiontemperaturewas40℃,thepHwas6.50,theamountofimmobilizedPLDaddedwas

40%,andthereactiontimewas12h,theyieldofPSreached86.60% ±1.40%,thepuritywas

90.30%,andtheyieldofPSremained61.70%±1.60%after7cyclesofimmobilizedPLD,whileonly

21.60%±1.80%ofPSyieldremainedafter4cyclesoffreePLD.Conclusion:Thestabilityandcatalytic

performanceofmesoporoussilica-immobilizedPLDweresignificantlyimproved,andtherecyclingand

reuseofPLD wasrealizedtoreducetheproductioncost.Atthesametime,technicalsupportwas

providedfortheindustrializedproductionofimmobilizedenzymemethodforPS.

Keywords:SoybeanphospholipaseD;Immobilizedenzyme;Transphosphorylation;Soybeanphosphatidylserine

大豆磷脂酶D(PhospholipaseD,PLD)即磷脂酰膽堿水解酶,是一種高效的生物酶催化劑,催化大豆

卵磷脂(PC)水解產(chǎn)生膽堿和磷脂酸(PA)[1-3],但高溫、極端的pH 及有機(jī)溶劑會(huì)破壞酶蛋白的自身結(jié)構(gòu),

導(dǎo)致其催化效率降低[4-5];且反應(yīng)結(jié)束后,游離酶很難回收和再利用,導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加[6-7],使得酶促反應(yīng)

發(fā)展十分緩慢。研究發(fā)現(xiàn)固定化技術(shù)可以解決上述游離PLD所存在的問題[8]。固定化酶的方法和載體

是影響酶比活和固定化速率的兩個(gè)重要因素[9]。研究表明固定化后的PLD對(duì)pH 的耐受性、熱穩(wěn)定性、

儲(chǔ)藏穩(wěn)定性和運(yùn)行穩(wěn)定性都得到了明顯的提升[10-11]。近幾年納米及帶有多孔材料的載體成為了固定化

酶的研究熱點(diǎn)[12]。由于介孔二氧化硅具有易于合成、可調(diào)節(jié)的孔徑、較大的比表面積、化學(xué)和力學(xué)特性穩(wěn)

定、生物相容性優(yōu)異等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用到固定化酶中[13-14]。磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine,PS)在自

然界中的含量極低[15-16],目前,其合成最有效的方法是利用PLD的轉(zhuǎn)磷脂酰化反應(yīng)在水-有機(jī)界面以大豆

卵磷脂和L-絲氨酸作為反應(yīng)底物進(jìn)行催化合成[17-18]。由于酶轉(zhuǎn)化法合成PS發(fā)生在水-有機(jī)體系中,游離

磷脂酶D與有機(jī)溶劑接觸會(huì)造成酶分子的變性,酶活性降低,導(dǎo)致催化合成PS的產(chǎn)率降低[19-20]。此外,

游離酶不易回收利用,會(huì)使PS的生產(chǎn)成本增加[21]。

因此,本研究首先通過非極性溶劑輔助St?ber法制備納米級(jí)介孔二氧化硅作為固定化酶的載體,通

過吸附-沉淀-交聯(lián)方式將PLD固定到介孔二氧化硅表面,優(yōu)化固定化條件并對(duì)固定化后的PLD進(jìn)行結(jié)構(gòu)

表征和熱穩(wěn)定性及貯存穩(wěn)定性研究;然后利用固定化PLD以大豆卵磷脂和L-絲氨酸為底物催化合成PS,

并確定最佳合成工藝;最后對(duì)固定化PLD的循環(huán)使用性能進(jìn)行研究,旨在通過固定化技術(shù)提高PLD的穩(wěn)

定性及催化性能,增加合成PS的產(chǎn)率,并實(shí)現(xiàn)磷脂酶D的回收重復(fù)使用,降低生產(chǎn)成本。

78 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

1材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

STA449F5同步熱分析儀(德國(guó)耐馳有限公司);Nicolet5700傅里葉變換紅外光譜儀(美國(guó)賽默飛世

爾有限公司);Masterizer2000激光粒度分析儀(上海善福電子科技有限公司);JEM-400LaB6透射電子

顯微鏡(日本電子公司);高分辨場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(日本 Hitachi公司);QuadraSorbSI(美國(guó)康塔儀

器公司);UV-1600紫外分光光度計(jì)(上海菁華儀器有限公司);Agilent-1260高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫

有限公司)。

1.2 試劑與材料

卵磷脂(純度為84.80%)由實(shí)驗(yàn)室制備;磷脂酶D(蛋白含量為8.12×10-4μmol/gprotein)、膽堿標(biāo)

準(zhǔn)品(純度為98.00%)、磷脂酰絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度為98.00%)和L-絲氨酸均購(gòu)于美國(guó)sigma公司;十六

烷基三甲基溴化銨(CTAB)、正硅酸四乙酯、十二烷基硫酸鈉(SDS)、牛血清蛋白(BSA)和乙酸鈉均購(gòu)于

上海阿拉丁試劑有限公司;甲醇和異丙醇為色譜純,均購(gòu)于美國(guó)sigma公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 介孔二氧化硅的制備 參考非極性溶劑輔助St?ber法制備介孔二氧化硅的方法[22]。稱取1.00g

CTAB置于三角瓶中,加入160.00mL去離子水完全溶解;加入8.00mL(25.00%~28.00%)氨水溶液,攪拌

到溶液澄清透明;緩慢加入5.00mL正硅酸四乙酯和20.00mL正己烷的混合溶液;在35℃下200r/min磁

力攪拌器中將上述混合液攪拌成白色乳液狀之后,繼續(xù)攪拌12h。反應(yīng)結(jié)束后,在6000r/min下離心

10min,收集固體,將收集的固體分別用無水乙醇和去離子水清洗3次,在真空干燥箱中40℃干燥12h,

收集固體;將收集的固體置于550℃馬弗爐中高溫煅燒6h,將模板劑CTAB脫除,即得介孔二氧化硅。

1.3.2 介孔二氧化硅的結(jié)構(gòu)表征 將介孔二氧化硅在 180 ℃ 的真空中至少脫氣 6h 后,使用

QuadraSorbSI分析儀測(cè)定介孔二氧化硅的比表面積、氣孔體積及孔徑。采用 KBr壓片法測(cè)定介孔二氧

化硅的紅外官能團(tuán),掃描波長(zhǎng)為4000~400cm-1,掃描次數(shù)為64次。將介孔二氧化硅干燥后,在加速電

壓為200kV的場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)下觀察并拍照。將介孔二氧化硅分散在乙醇溶液中,在透射電

子顯微鏡(TEM)下觀察并拍照。將介孔二氧化硅均勻分散在去離子水中并采用 Masterizer2000馬爾文粒度

分析儀測(cè)定介孔二氧化硅的粒徑大小并繪制曲線圖。

1.3.3 PLD的固定 稱取0.25g介孔二氧化硅,加入7.50mL20mmol/LpH6.50的乙酸鈉-醋酸緩

沖溶液溶解;加入1.00mL20mmol/LpH5.50的PLD酶液,置于35℃下先物理吸附2h,加入5.00mL乙

醇沉淀劑,冰浴1h,將物理吸附未吸附的PLD分子固定在介孔二氧化硅的表面上;最后加入0.40mL25%

戊二醛交聯(lián)劑,交聯(lián)1.5h,在6000r/min下離心10min,收集固體,用pH6.50乙酸鈉-醋酸緩沖溶液洗

滌3次,在真空干燥箱中35℃干燥12h,收集固體,得到固定化PLD。

1.3.4 PLD酶活性的測(cè)定 PLD酶活性的測(cè)定是根據(jù)D'Arrigo等[23]報(bào)道的方法,通過檢測(cè)磷脂酰對(duì)硝

基苯酚(PpNP)在405nm 水解產(chǎn)生的對(duì)硝基苯酚來測(cè)定磷脂酶 D 的活性。取50μL 反應(yīng)混合液

(5mmol/LSDS,10mmol/LPpNP 和5% TritonX-100在10 mmol/L Tris/HCl,pH8.00),加入

400μL(0.10mol/L,pH6.00,含2mmol/LCaCl2)乙酸鈉-醋酸緩沖液和50μL2mg/mL游離PLD溶

液;在30℃下反應(yīng)10min,加入100μL(pH8.00,1.00mol/LTris/HCl含0.10mol/LEDTA)緩沖液

終止反應(yīng)。在405nm處測(cè)定磷脂酶 D的酶活性;酶活性的一個(gè)單位(U)定義為在合適的檢測(cè)條件下,

1min內(nèi)磷脂酶D釋放1.00μmol對(duì)硝基苯酚的量。固定化磷脂酶D酶活性的終止反應(yīng)通過將固定化酶

從反應(yīng)中移除來實(shí)現(xiàn)。

1.3.5 固定化PLD蛋白固定化率的測(cè)定 酶蛋白的固定化率公式如下:蛋白固定化率=(初始酶液總蛋

白-固定后殘余酶液總蛋白)÷初始酶液總蛋白。根據(jù)Bradford法測(cè)定酶液中蛋白質(zhì)含量[24]。以牛血清

蛋白(BSA)的濃度為橫坐標(biāo),595nm測(cè)得的吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取1mL酶液加入到10mL

考馬斯亮藍(lán)溶液中并充分混合均勻,在紫外吸收波長(zhǎng)為595nm 處測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算

PLD中蛋白質(zhì)的濃度。每組試驗(yàn)平行做3次以減少酶液中蛋白質(zhì)含量測(cè)定的試驗(yàn)誤差。

第38卷第1期 孫紅葉,等:大豆磷脂酶D的固定化及其催化功能 79

1.3.6 固定化PLD的單因素試驗(yàn) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,以相對(duì)酶活性和固定化速率為指標(biāo),以沉淀劑(甲

醇、乙醇、丙酮、異丙醇及PEG6000)、最佳沉淀劑加入量(2、3、4、5、6mL)、溫度(30、35、40、45、50℃)、pH

(5.50、6.00、6.50、7.00、7.50)、酶液體積(0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL)、戊二醛體積(0.20、0.40、

0.60、0.80、1.00mL)作為單因素對(duì)固定化PLD的固定化條件加以研究。

1.3.7 固定化PLD的結(jié)構(gòu)表征 采用 KBr壓片法測(cè)定介孔二氧化硅及固定化后磷脂酶 D的介孔二氧

化硅紅外光譜,掃描波長(zhǎng)為4000~400cm-1,掃描次數(shù)為64次。對(duì)介孔二氧化硅及固定化PLD的介孔

二氧化硅進(jìn)行熱重分析。樣品量為6~8mg,Al2O3 坩堝,溫度區(qū)間為30~800℃,升溫速率為10℃/min,保

護(hù)氣為 N2,氣體速率為20mL/min。

1.3.8 磷脂酶D的穩(wěn)定性 將游離和固定化PLD置于20~70℃下,每隔10℃保溫20min后取出一定

量的酶液,對(duì)其進(jìn)行酶活性測(cè)定。將游離和固定化PLD分別在4℃下貯存50d,每隔5天取出一定量的

酶液,對(duì)其進(jìn)行酶活性測(cè)定。

1.3.9 PS的制備 稱取20.00mg磷脂酰膽堿溶解在12mL乙酸乙酯中;稱取160mgL-絲氨酸,加入

2mLpH6.50的乙酸鈉-醋酸緩沖溶液溶解,加入35%的固定化PLD;將水相和有機(jī)相混合置于40℃的

恒溫?fù)u床中反應(yīng)12h,并每隔2h從搖床中取出一定量的反應(yīng)液用 HPLC檢測(cè),并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算PS

的產(chǎn)率。反應(yīng)結(jié)束后,離心收集反應(yīng)液,回收固定化PLD;將反應(yīng)液低溫濃縮后冷凍干燥,得到PS產(chǎn)物。

1.3.10 PS產(chǎn)率的測(cè)定 稱取適量PS產(chǎn)物用5.00mL甲醇溶解后倒入棕色容量瓶中,用甲醇定容至

25.00mL,0.22μm有機(jī)膜過濾后 HPLC上機(jī)檢測(cè)。色譜條件:柱溫為35℃,紫外吸收波長(zhǎng)為205nm,

以異丙醇∶甲醇∶水(64∶26.4∶9.6,V∶V∶V)作為流動(dòng)相等度洗脫,進(jìn)樣量為20μL,流速為

0.50mL/min時(shí),采用EclipsePlusC18(4.60mm×250mm,5μm)色譜柱分離。以PS的峰面積為縱坐

標(biāo),PS的濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算PS的產(chǎn)率。

1.3.11 PS產(chǎn)率的單因素試驗(yàn) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,以磷脂酰絲氨酸產(chǎn)率為指標(biāo),以有機(jī)相(己烷、乙醚、石

油醚和乙酸乙酯)、緩沖液(磷酸二氫鈉-磷酸一氫鈉、檸檬酸-檸檬酸鈉、乙酸鈉-醋酸和 Tris-鹽酸)、溫度

(25、30、35、40、45℃)、pH(5.50、6.00、6.50、7.00、7.50)、底物質(zhì)量比(1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10)、兩

相體積比(1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8)作為單因素對(duì)磷脂酰絲氨酸合成條件加以研究。

1.3.12 固定化PLD的循環(huán)使用性研究 在相同的反應(yīng)條件下測(cè)定游離PLD與固定化PLD分別在循

環(huán)使用(1、2、3、4、5、6、7次)后的PS產(chǎn)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 介孔二氧化硅的結(jié)構(gòu)表征

在相對(duì)壓力為0.04~1.00、測(cè)定溫度為77K時(shí),介孔二氧化硅的N2 吸附-解吸等溫線如圖1A所示,

該等溫線符合IUPAC 定義的IV 型等溫線[25];根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算介孔二氧化硅的總孔隙體積為

1.35cm3/g,表明介孔二氧化硅材料的孔隙率比較大;根據(jù)Brunauer-Emmett-Teller(BET)方法計(jì)算介孔

二氧化硅的BET比表面積為948m2/g。根據(jù)圖1B吸附分支采用BdB球形模型計(jì)算出介孔二氧化硅的

孔徑為8.20nm,孔徑分布比較窄。介孔二氧化硅具有較大的 BET 比表面積、氣孔體積以及與磷脂酶

D(7.60nm×4.80nm×5.70nm)[11]相近的孔徑大小,不僅有利于吸附更多的酶分子,還不容易造成酶分

子在載體上的脫落。介孔二氧化硅的粒徑測(cè)定結(jié)果如圖 1C 所示,介孔二氧化硅的粒徑分布為

100~1000nm,其平均粒徑為335.10nm。介孔二氧化硅的粒徑大小檢測(cè)結(jié)果趨于正態(tài)分布,而且曲線

范圍較為集中,說明非極性溶劑輔助St?ber法制備的介孔二氧化硅粒徑比較均一。介孔二氧化硅的紅外

光譜如圖1D 所示,460cm-1 和800cm-1 附近的波段屬于 Si—O—Si的彎曲振動(dòng)峰和對(duì)稱拉伸,

950cm-1 處的吸收峰為Si—OH 彎曲振動(dòng),1080cm-1 周圍存在強(qiáng)烈的吸收帶,對(duì)應(yīng)Si—O—Si的不對(duì)

稱拉伸振動(dòng)。3429cm-1 處的吸收峰為 O—H 鍵的振動(dòng)吸收峰。胡盛[26]研究得知CTAB的2個(gè)主要紅

外吸收峰分別為2870cm-1 和2950cm-1,而圖1D的紅外光譜中沒有這2個(gè)紅外吸收峰,證明CTAB

模板劑經(jīng)馬弗爐高溫煅燒被脫除。介孔二氧化硅的掃描電鏡圖和透射電鏡圖分別如圖1E、1F所示,介孔

二氧化硅表面存在氣孔結(jié)構(gòu),且介孔二氧化硅具有均勻的微球形結(jié)構(gòu)可以為固定化磷脂酶D提供良好的

80 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

固定化條件。

圖1 介孔二氧化硅的比表面積(A)、氣孔體積及孔徑(B)、粒徑分布(C)、紅外光譜圖(D)、掃描電鏡圖(E)和透射電鏡圖(F)

Fig.1 Measurementsofspecificsurfacearea(A),porevolumeandporesize(B),particlesizedistribution(C),

infraredspectrum (D),SEM (E)andTEM (F)ofmesoporoussilica

2.2 沉淀劑和最佳沉淀劑加入量對(duì)PLD酶活性的影響

研究表明,在固定PLD時(shí)使用不同的沉淀劑會(huì)影響相對(duì)酶活性,使用沉淀劑不當(dāng)時(shí)還會(huì)造成酶蛋白

分子發(fā)生不可逆的失活[11]。當(dāng)溫度為30℃、pH為6.00、酶液加入量為0.60mL、物理吸附時(shí)間為2.00h、戊

二醛加入量為0.60mL、交聯(lián)時(shí)間為1.50h時(shí),研究甲醇、乙醇、丙酮、異丙醇及PEG6000作為沉淀劑對(duì)

PLD相對(duì)酶活性的影響。結(jié)果如圖2A所示,當(dāng)選用乙醇作為沉淀劑時(shí),磷脂酶 D的相對(duì)酶活性為最大

值(85.30%±0.60%);而其它幾種沉淀劑對(duì)磷脂酶D的相對(duì)酶活性都比乙醇作為沉淀劑時(shí)要低。因此,

選取乙醇作為固定PLD的最佳沉淀劑。確定了最優(yōu)沉淀劑之后,還需要對(duì)沉淀劑的加入量進(jìn)行優(yōu)化。當(dāng)

溫度為30℃、pH 為6.00、酶液加入體積為0.60mL、物理吸附時(shí)間為2h、戊二醛加入體積為0.60mL、

交聯(lián)時(shí)間為1.50h,乙醇作為沉淀劑時(shí),研究乙醇加入量對(duì)固定化PLD相對(duì)酶活性的影響。結(jié)果如圖2B

所示,隨著乙醇沉淀劑加入量的增加,PLD的相對(duì)酶活性先上升后降低,在乙醇沉淀劑加入量為5.00mL

時(shí)達(dá)到最大值86.30%±0.50%。綜上所述,乙醇沉淀劑最佳加入量為5.0mL。

第38卷第1期 孫紅葉,等:大豆磷脂酶D的固定化及其催化功能 81

圖2 不同沉淀劑(A)和最佳沉淀劑乙醇加入量(B)對(duì)PLD酶活性的影響

Fig.2 Effectsofdifferentprecipitatingagents(A)andoptimalprecipitatingagentethanolvolume(B)ontheenzymaticactivityofPLD

2.3 溫度和pH對(duì)固定化PLD的影響

當(dāng)pH 為6.00、酶液加入體積為0.60mL、物理吸附時(shí)間為2h、戊二醛加入體積為0.60mL、交聯(lián)時(shí)

間為1.50h、乙醇加入量為5.00mL時(shí),研究溫度對(duì)固定化PLD的影響。試驗(yàn)結(jié)果如圖3A所示,固定化

PLD的相對(duì)酶活和蛋白固定化率均隨著溫度的升高先上升后下降。當(dāng)溫度為35℃時(shí),固定化酶的相對(duì)

酶活性和蛋白固定化率均達(dá)到最大值,分別為86.50%±0.70%和81.80%±0.60%。當(dāng)固定化溫度為

50℃時(shí),PLD的固定化速率及相對(duì)酶活性還分別為68.22%和72.77%,說明固定化技術(shù)提升了PLD對(duì)

溫度的耐受性。當(dāng)溫度為35 ℃、酶液加入體積為0.60mL、物理吸附時(shí)間為2h、戊二醛加入體積為

0.60mL、交聯(lián)時(shí)間為1.50h、乙醇加入量為5.00mL時(shí),研究pH 對(duì)固定化PLD的影響。結(jié)果如圖3B

所示,固定化PLD的相對(duì)酶活性和蛋白固定化率均隨著pH 的增大先升高后降低。當(dāng)pH 為6.50時(shí),固

定化PLD的相對(duì)酶活性和蛋白固定化率均達(dá)到最大值,分別為87.27%±0.80%和82.57%±0.60%。

綜上可知,在溫度為35℃、pH 為6.50時(shí),固定化PLD的蛋白固定化率和相對(duì)酶活性都達(dá)到最大值。

圖3 溫度(A)和pH(B)對(duì)固定化PLD相對(duì)酶活性和蛋白固定化率的影響

Fig.3 Effectsoftemperature(A)andpH (B)ontherelativeenzymeactivityandproteinimmobilizationrateofimmobilizedPLD

2.4 酶液和戊二醛加入量對(duì)固定化PLD的影響

在溫度為35℃、pH 為6.50、物理吸附時(shí)間為2h、戊二醛加入體積為0.60mL、交聯(lián)時(shí)間為1.50h、

乙醇加入量為5.00mL時(shí),研究酶液加入體積對(duì)固定化PLD的影響。結(jié)果如圖4A所示,當(dāng)酶液加入體

積為0.60mL時(shí),蛋白固定化率達(dá)到最大值(85.37%±1.10%)。當(dāng)酶液加入體積為1.00mL時(shí),相對(duì)酶

活性達(dá)到最大值(87.62%±1.20%)。當(dāng)酶液加入體積過大時(shí),PLD在介孔二氧化硅表面的排布會(huì)出現(xiàn)

多層聚集、傳質(zhì)阻力增大的現(xiàn)象,會(huì)導(dǎo)致PLD的相對(duì)酶活性下降,且由于介孔二氧化硅的比表面積有限,

酶液加入體積過多也會(huì)使部分游離的PLD不能固定在介孔二氧化硅上,導(dǎo)致蛋白固定化率降低。因此,

當(dāng)酶液的加入體積為1.00mL時(shí),相對(duì)酶活性達(dá)到最大;當(dāng)酶液的加入體積為0.60mL時(shí),蛋白固定化率

達(dá)到最大值。在溫度為35℃、pH 為6.50、物理吸附時(shí)間為2h、酶液加入體積為1.00mL、交聯(lián)時(shí)間為

1.50h、乙醇加入體積為5.00mL時(shí),研究戊二醛交聯(lián)劑加入體積對(duì)固定化PLD的影響。結(jié)果如圖4B

82 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

所示,當(dāng)戊二醛加入體積為0.40mL時(shí)相對(duì)酶活性達(dá)到最大值88.89%±1.00%;當(dāng)戊二醛加入量為

1.00mL時(shí)蛋白固定化速達(dá)到最大值86.36%±1.30%。綜上可知,戊二醛加入體積為0.40mL時(shí),相對(duì)

酶活性最大;戊二醛加入體積為1.00mL時(shí),蛋白固定化率最大。

圖4 酶液(A)和戊二醛(B)加入量對(duì)固定化PLD相對(duì)酶活性和蛋白固定化率的影響

Fig.4 Effectsofenzymesolutionamount(A)andadditionvolumeofglutaraldehyde(B)ontherelative

enzymeactivityandproteinimmobilizationrateofimmobilizedPLD

2.5 固定化PLD的結(jié)構(gòu)表征

固定化PLD的紅外光譜及熱重分析如圖5所示,圖5A為介孔二氧化硅固定化PLD的紅外光譜圖,

460cm-1 和800cm-1 附近的波段屬于Si—O—Si的彎曲振動(dòng)和對(duì)稱拉伸,950cm-1 處的吸收峰為Si—OH

彎曲振動(dòng),1080cm-1 周圍存在強(qiáng)烈的吸收帶對(duì)應(yīng)Si—O—Si的不對(duì)稱拉伸振動(dòng);這4個(gè)吸收峰也是介孔

二氧化硅和介孔二氧化硅固定化 PLD 所共有的吸收峰。肽鍵的紅外吸收峰分別為1580cm-1 和

1620cm-1[27],而介孔二氧化硅固定化PLD有1580cm-1 和1620cm-1 紅外吸收峰,表明PLD被固定

在介孔二氧化硅載體上。圖5B為介孔二氧化硅固定化PLD的熱重分析(TGA),在30~100℃時(shí),介孔

二氧化硅及固定化PLD的介孔二氧化硅均發(fā)生了下降,分別下降了4.90%和8.10%,這一部分的損失是

因?yàn)榻榭锥趸柚兴值恼舭l(fā)。在100~500℃時(shí),介孔二氧化硅的 TGA 曲線趨于一條直線,說明在

該溫度范圍內(nèi)介孔二氧化硅的質(zhì)量沒有損失;但介孔二氧化硅固定化的PLD的 TGA曲線的質(zhì)量卻下降

了5.30%,這一部分的損失可以歸結(jié)為酶蛋白的損失,通過 TGA再次驗(yàn)證PLD被固定在介孔二氧化硅

載體上。

圖5 固定化PLD的結(jié)構(gòu)表征

Fig.5 StructuralcharacterizationofimmobilizedPLD

注:A為FT-IR;B為TGA。

2.6 固定化PLD的穩(wěn)定性

PLD的熱穩(wěn)定性和貯存穩(wěn)定性的測(cè)定結(jié)果如圖6所示,固定化PLD和游離PLD的初始酶性活均為

100%。從20℃開始,每隔10℃取出一定量的酶液,分別測(cè)定游離及固定化磷脂酶D的相對(duì)酶活性。其

結(jié)果如圖6A所示,在70℃時(shí),固定化PLD的相對(duì)酶活性依然有66.40%;而游離PLD的相對(duì)酶活性只

第38卷第1期 孫紅葉,等:大豆磷脂酶D的固定化及其催化功能 83

剩余15.30%。將游離及固定化PLD分別在4℃冰箱下貯存50d,每隔5天取出一定量的酶液,分別測(cè)定

游離及固定化磷脂酶 D的相對(duì)酶活性。其結(jié)果如圖6B所示:游離的PLD在貯存50天時(shí)相對(duì)酶活性只

剩余17.30%;而固定化PLD在貯存50d時(shí)相對(duì)酶活性依然保留50.10%;固定化后的PLD的半衰期由

20d增加到了50d。

圖6 固定化PLD的穩(wěn)定性(A:熱穩(wěn)定性;B:貯存穩(wěn)定性)

Fig.6 StabilityofimmobilizedPLD(A:thermalstability;B:storagestability)

2.7 有機(jī)溶劑和緩沖溶液對(duì)PS產(chǎn)率的影響

當(dāng)選用水-有機(jī)體系作為合成磷脂酰絲氨酸的反應(yīng)體系之后,需要對(duì)有機(jī)相進(jìn)行篩選。當(dāng)卵磷脂與

L-絲氨酸的質(zhì)量比為1∶8、溫度為35℃,pH 為6.00、有機(jī)相與水相的比為4∶1、固定化PLD的加入量

為35%時(shí),研究有機(jī)相對(duì)PS產(chǎn)率的影響。結(jié)果如圖7A所示,當(dāng)選用己烷、石油醚、乙醚和乙酸乙酯作為有

機(jī)試劑時(shí),PS的產(chǎn)率分別為52.30%±1.40%、47.60%±1.60%、83.40%±1.70%和80.80%±1.50%。因

乙醚比乙酸乙酯毒性高,所以選擇乙酸乙酯作為合成磷脂酰絲氨酸的有機(jī)相。當(dāng)卵磷脂與L-絲氨酸的質(zhì)

量比為1∶8、溫度為35℃、pH 為6.00、有機(jī)相與水機(jī)的比為4∶1、固定化PLD的加入量為35%時(shí),研究

緩沖溶液對(duì)PS產(chǎn)率的影響。結(jié)果如圖7B所示,當(dāng)選用乙酸鈉-醋酸作為緩沖溶液時(shí),磷脂酰絲氨酸的產(chǎn)

率達(dá)到最大值(82.20%±1.50%),因此選取乙酸鈉-醋酸作為合成磷脂酰絲氨酸產(chǎn)率的緩沖溶液。

圖7 有機(jī)溶劑(A)和緩沖溶液(B)對(duì)PS產(chǎn)率的影響

Fig.7 Effectsoforganic(A)andbuffersolution(B)ontheyieldofPS

2.8 兩相體積比、底物質(zhì)量比、溫度和pH對(duì)PS產(chǎn)率的影響

當(dāng)卵磷脂與L-絲氨酸的質(zhì)量為1∶8、反應(yīng)溫度為35℃、pH 為6.00、固定化PLD的加入量為35%

時(shí),研究?jī)上囿w積比對(duì)PS產(chǎn)率的影響。結(jié)果如圖8A所示,隨著有機(jī)相的增加,PS產(chǎn)率逐漸增大,當(dāng)有機(jī)

相與水相的比例為8∶1時(shí),PS的產(chǎn)率達(dá)到最大值(83.40%±1.60%),而當(dāng)有機(jī)相與水相的比例從6∶1

增加到8∶1時(shí),PS產(chǎn)率增加很小。綜合考慮PS轉(zhuǎn)化率和成本,選取有機(jī)相與水相的體積比為6∶1作為

該合成體系的最佳體積比。當(dāng)有機(jī)相與水相的比為6∶1、反應(yīng)溫度為35℃、pH 為6.00、固定化磷脂酶D

的加入量為35%時(shí),研究底物質(zhì)量比對(duì)PS產(chǎn)率的影響。試驗(yàn)結(jié)果如圖8B所示,當(dāng)磷脂酰膽堿與L-絲氨

酸的比例為1∶10時(shí),PS的產(chǎn)率達(dá)到最大值(83.70%±1.80%),在卵磷脂與L-絲氨酸的比例為1∶8和

1∶10時(shí),PS的產(chǎn)率相接近。綜合考慮生產(chǎn)成本的因素,選取卵磷脂與L-絲氨酸的質(zhì)量比為1∶8是較為

84 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

合理的比例。在有機(jī)相與水相的比為6∶1、卵磷脂與 L-絲氨酸的質(zhì)量比為1∶8、pH 為6.00、固定化

PLD的加入量為35%時(shí),研究溫度對(duì)PS產(chǎn)率的影響。試驗(yàn)結(jié)果如圖8C所示,在溫度為40℃時(shí),PS產(chǎn)率

達(dá)到最大值(84.10%±1.70%)。在有機(jī)相與水相的比為6∶1、卵磷脂與L-絲氨酸的質(zhì)量比為1∶8、反

應(yīng)溫度為40℃、固定化PLD的加入量為35%時(shí),研究pH 對(duì)PS產(chǎn)率的影響。試驗(yàn)結(jié)果如圖8D所示,在

pH 為6.50時(shí),PS產(chǎn)率達(dá)到最大值(85.10%±1.60%)。綜上可知,合成PS的pH 為6.50,溫度為40℃

比較適宜。

圖8 兩相體積比(A)、底物質(zhì)量比(B)、溫度(C)和pH(D)對(duì)PS產(chǎn)率的影響

Fig.8 Effectsoftwophasevolumeratio(A),molarratioofsubstrate(B),temperature(C)andpH (D)onPSyield

2.9 固定化PLD的加入量和循環(huán)使用次數(shù)對(duì)PS產(chǎn)率的影響

當(dāng)有機(jī)相與水相的比為6∶1、卵磷脂與 L-絲氨酸的質(zhì)量比為1∶8、反應(yīng)溫度為40℃、pH 為6.50

時(shí),研究了固定化PLD的加入量對(duì)PS產(chǎn)率的影響。結(jié)果如圖9A所示:隨著加酶量的增加,PS的產(chǎn)率先

快速上升后趨于平緩的狀態(tài)。當(dāng)加酶量為40%時(shí),PS的產(chǎn)率達(dá)到最大值(86.60%±1.40%),在最佳條

件下測(cè)得副產(chǎn)物膽堿的含量為6.30%±1.70%、PS的純度為90.30%。因此,綜合考慮磷脂酰絲氨酸的

轉(zhuǎn)化率,選取固定化PLD的加入量為40%時(shí)為最佳。酶的可重復(fù)使用性不僅可以影響經(jīng)濟(jì)效益,也是實(shí)

現(xiàn)工業(yè)化的重要前提[28]。對(duì)固定化PLD和游離PLD的催化性能進(jìn)行比較和研究,結(jié)果如圖9B所示,介

孔二氧化硅固定化PLD重復(fù)使用7次,PS的產(chǎn)率依然有61.30%±1.60%,而游離PLD重復(fù)使用4次,

PS的產(chǎn)率只有21.60%±1.80%。綜上所述,固定化PLD在制備PS時(shí)具有純度高、催化性能好,可實(shí)現(xiàn)

酶的多次重復(fù)使用的優(yōu)點(diǎn)。

3 結(jié)論與討論

本研究利用大豆PLD的轉(zhuǎn)磷脂?；磻?yīng)在水-有機(jī)界面,以大豆卵磷脂和L-絲氨酸作為反應(yīng)底物合

成PS。但游離PLD在高溫、極端的pH 及有機(jī)溶劑中不穩(wěn)定,容易發(fā)生變性,造成酶活性的降低;此外,

游離PLD難以回收再利用,會(huì)增加PS的生產(chǎn)成本。

本研究制備的介孔二氧化硅的BET比表面積為948m2/g、氣孔體積為1.35cm3/g,孔徑大小與磷脂

酶D相接近,為8.20nm,平均粒徑為335.10nm,且形貌為近球形結(jié)構(gòu),因此,選用介孔二氧化硅作為固

定化PLD的載體。當(dāng)溫度為35℃、pH為6.50、物理吸附時(shí)間為2h、酶液加入體積為1.00mL、交聯(lián)時(shí)間為

第38卷第1期 孫紅葉,等:大豆磷脂酶D的固定化及其催化功能 85

圖9 固定化PLD的加入量(A)和循環(huán)使用次數(shù)(B)對(duì)PS產(chǎn)率的影響

Fig.9 Effectsofadditionvolume(A)andrecyclingnumber(B)ofimmobilizedPLDadditionvolumeonPSyield

1.50h、乙醇加入體積為5.00mL、戊二醛加入體積為0.40mL時(shí),固定化PLD的相對(duì)酶活性達(dá)到最大值

(88.89%±1.00%),蛋白固定化率為80.76%±1.30%。使用制得的介孔二氧化硅固定PLD催化合成PS

的最佳工藝條件:有機(jī)相與水相的比為6∶1、卵磷脂與L-絲氨酸的質(zhì)量比為1∶8,反應(yīng)溫度為40℃,pH為

6.50、加酶量為40.00%,此條件下PS的產(chǎn)率為86.60%±1.40%,HPLC測(cè)定PS的純度為90.30%。

70℃時(shí)游離PLD的相對(duì)酶活只剩余15.3%,而固定化PLD的相對(duì)酶活性仍然有66.4%;貯存50%

時(shí)游離PLD的相對(duì)酶活性只剩余11.2%,而固定化PLD的相對(duì)酶活性依然有50.1%。游離PLD被固

定化后酶的半衰期由20d延長(zhǎng)到50d。固定化PLD循環(huán)使用7次,PS的產(chǎn)率依然有61.70%±1.60%;

游離PLD循環(huán)使用4次,PS的產(chǎn)率只有21.60%±1.80%。綜上可知,介孔二氧化硅作為固定化酶的載

體時(shí),PLD分子通過交聯(lián)作用可以形成堅(jiān)固的酶網(wǎng)覆蓋在介孔二氧化硅表面上,使PLD的熱穩(wěn)定性、貯

存穩(wěn)定性、對(duì)pH 的耐受性以及催化性能均得到明顯的提升,并實(shí)現(xiàn)了PLD的多次回收重復(fù)使用。

本研究以高純度的大豆卵磷脂作為反應(yīng)底物,利用PLD的轉(zhuǎn)磷脂?；磻?yīng)合成大豆PS。生物酶法

制備的PS的產(chǎn)品純度較高,具有一定的工業(yè)化應(yīng)用前景。李冰麟[1]選用納米二氧化硅作為固定化PLD

的載體,通過吸附-沉淀-交聯(lián)固定化PLD,酶蛋白的固定化速率可高達(dá)80%;而本研究使用制備的介孔二

氧化硅固定的PLD蛋白固定化率為80.76%±1.30%,表明本研究制備的介孔二氧化硅是較為理想的固

定PLD材料。Zhang等[29]將PLD固定在用十八烷基三甲氧基硅烷修飾的有序介孔硅立方體(OMSC)

中,固定后的PLD在40℃下相對(duì)酶活性為90%以上,固定化后,PLD的半衰期從25d延長(zhǎng)到40d;本研

究中使用制備的介孔二氧化硅固定的PLD在40℃下相對(duì)酶活性在91%以上,在70℃下相對(duì)酶活性仍

然有66.4%,且游離PLD被固定化后酶的半衰期由20d延長(zhǎng)到50d,表明使用本研究制備的介孔二氧化

硅固定PLD可以顯著提高PLD的熱穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性、對(duì)pH 的耐受性以及催化性能。但本研究在酶

催化制備PS時(shí)雖然選用了毒性比乙醚小的乙酸乙酯作為有機(jī)相,但是還具有一定的毒性,后續(xù)可以考慮

其他綠色試劑替代乙酸乙酯有機(jī)溶劑。本研究只選用了納米級(jí)介孔二氧化硅作為固定化PLD的載體,固

定化后的酶活性和固定化速率較為理想,后續(xù)還可考慮將介孔二氧化硅用其他官能團(tuán)修飾作為固定化酶

的載體制備固定化印跡PLD,盡可能使固定化的PLD的酶活性大于初始酶活性,加快PLD的催化性能,

降低生產(chǎn)成本,提高成品的純度。本研究以卵磷脂和L-絲氨酸作為反應(yīng)底物,利用PLD的轉(zhuǎn)磷脂?；?/p>

應(yīng)在乙酸乙酯-水反應(yīng)體系合成PS只是一個(gè)初步的探究,后續(xù)可以通過設(shè)計(jì)流化床式反應(yīng)器,對(duì)該反應(yīng)連

續(xù)生產(chǎn)PS進(jìn)行放大試驗(yàn)。

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(責(zé)任編輯:顧文亮)

第38卷第1期 孫紅葉,等:大豆磷脂酶D的固定化及其催化功能 87

安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào),2024,38(1):88-96

JournalofAnhuiScienceandTechnologyUniversity

收稿日期:2023-06-14

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(31860437);安徽省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(S202312926034);食品科學(xué)與工程安徽省高峰培育學(xué)

科項(xiàng)目;亳州學(xué)院一流學(xué)科項(xiàng)目(BYXKA202202)。

作者簡(jiǎn)介:吳翠芳(1991-),女,安徽亳州人,碩士,工程師,主要從事藥食同源功能食品開發(fā)與安全評(píng)價(jià)研究,E-mail:1151041169@qq.com。

通信作者:王俊鋼,研究員,E-mail:wjgang728@126.com。

沙棘中黃酮類化合物提取及抗氧化活性

吳翠芳1,2, 劉雅宣1, 李宇輝3, 郝奇奇1, 何旭豪1, 王俊鋼1,2*

(1.亳州學(xué)院 生物與食品工程系,安徽 亳州 236800;

2.亳州市天然產(chǎn)物分離純化工程技術(shù)研究中心,安徽 亳州 236800;

3.新疆農(nóng)墾科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,新疆 石河子 832000)

摘 要:目的:優(yōu)化沙棘中總黃酮提取工藝,明確其抗氧化性能。方法:以沙棘為研究對(duì)象,以沙棘黃酮得

率為指標(biāo)值,使用乙醇溶液作為提取劑,采用超聲波輔助萃取法,對(duì)提取時(shí)間(A)、提取溫度(B)、乙醇體積

分?jǐn)?shù)(V乙醇/V總 )(C)、料液比(D)進(jìn)行單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析,考察4個(gè)因素對(duì)總黃酮得率的影響,并對(duì)

沙棘黃酮的體外抗氧化活性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果:在提取時(shí)間23min、提取溫度80 ℃、50%乙醇、料液比

1∶20條件下沙棘黃酮得率最高,為2.316mg/g。各因素對(duì)沙棘黃酮得率的影響大小依次為:料液比、乙

醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度。體外抗氧化結(jié)果表明,沙棘黃酮具有很好的DPPH 自由基和羥自由基

清除能力,當(dāng)沙棘黃酮粗提取物質(zhì)量濃度達(dá)到5mg/mL時(shí),沙棘黃酮對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)87.5%,對(duì)

羥自由基的清除率達(dá)到了77.7%。結(jié)論:沙棘中含有豐富的黃酮類物質(zhì),且具有較好的抗氧化性能。

關(guān)鍵詞:沙棘;黃酮;提取工藝;響應(yīng)面法;抗氧化

中圖分類號(hào):TS255.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1673-8772(2024)01-0088-09

開放科學(xué)(資源服務(wù))標(biāo)識(shí)碼(OSID): DOI:10.19608/j.cnki.1673-8772.2024.0014

Extractionandantioxidantactivityofflavonoidsfromsea-buckthorn

WUCuifang

1,2, LIUYaxuan1, LIYuhui3, HAOQiqi1, HEXuhao1, WANGJungang

1,2*

(1.BiologyandFoodEngineeringDepartment,BozhouUniversity,Bozhou236800,China;

2.BozhouNaturalProductsSeparationandPurificationEngineeringTechnologyResearchCenter,Bozhou236800,China;

3.InstituteofAgro-productsProcessingScienceandTechnology,XinjiangAcademyof

AgriculturalandReclamationScience,Shihezi832000,China)

Abstract:Objective:Inordertooptimizetheextractionprocessoftotalflavonoidsinsea-buckthornand

clarifyitsantioxidantproperty,sea-buckthornwasselectedastheresearchobjectinthisexperiment.

Methods:Theyieldofsea-buckthornflavonoidswasusedastheindexvalue,andethanolsolutionwas

usedastheextractantandcombinedwithultrasonic-assistedextractiontechnology,singlefactortestand

responsesurfacemethodwerecarriedoutonthefourfactorsofextractiontime,extractiontemperature,

ethanolconcentrationandsolid-liquidratio,andtheantioxidantpropertyofsea-buckthornflavonoids

werestudied.Results:Theoptimumextractionconditionswereasfollows:extractiontime23 min,

extractiontemperature80 ℃ ethanolconcentration50%,solid-liquidratio1∶20g/mL.Underthe

conditions,theyieldofsea-buckthornflavonoidswasthehighest,whichwas2.316mg/g.Theeffects

ofvariousfactorsontheyieldofflavonoidsweresolid-liquidratio,ethanolconcentration,extraction

timeandextractiontemperature.Theantioxidantresultsshowedthatsea-buckthornflavonoidshad

excellentscavengingeffectsonDPPHfreeradicalsandhydroxylradicals.Whentheconcentrationofseabuckthornflavonoidsreached5mg/mL,thescavengingrateofDPPHfreeradicalreached87.5%,and

thescavengingrateofhydroxylradicalsreached77.7%.Conclusion:Sea-buckthornisrichinflavonoids,and

undercertainconcentrationconditions,sea-buckthornflavonoidshavegoodantioxidantproperties.

Keywords:Sea-buckthorn;Flavones;Extractionprocess;Orthogonaltest;Antioxidation

沙棘(HippophaerhamnoidesL.),也稱為沙棗、吉漢、酸柳、達(dá)普,是胡頹子科沙棘屬的一種重要的

落葉樹種,具有很好的防風(fēng)固沙作用。目前,沙棘果的營(yíng)養(yǎng)保健及醫(yī)療作用被廣泛關(guān)注[1]。中國(guó)沙棘資源

占全世界上95%以上,素有“沙棘王國(guó)”之稱[2]。沙棘果是一種藥食同源食品,具有極高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)

值,在治療咳嗽、改善胃腸功能、抗炎、抗病毒、提高免疫力、激發(fā)細(xì)胞新陳代謝等方面作用顯著[3]。沙棘富

含黃酮、類胡蘿卜素、甾醇激素、生育酚等[4],其中黃酮類化合物是其最重要的活性成分。研究表明,黃酮

類化合物可以保護(hù)腸道上皮屏障[5-7]、參與免疫調(diào)節(jié)[8-10]、調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)[11-12]、維持細(xì)胞的健康和保護(hù)

內(nèi)皮功能[13]等重要的生理活性。陳薇伊等[14]研究發(fā)現(xiàn),山楂黃酮能顯著提升糖尿病小鼠血清和肝臟中

SOD、T-AOC、GSH-PX酶活性;李雪涵等[15]研究發(fā)現(xiàn)榆莢仁黃酮可顯著增強(qiáng)慢性睡眠剝奪小鼠大腦、肝

臟、十二指腸中SOD、GPX活性和T-AOC。隨著科技的進(jìn)步和人們對(duì)健康的重視程度不斷增加,越來越

多對(duì)人體健康有益的功能性物質(zhì)被挖掘,并驗(yàn)證其功效[16]。張峰等[17]通過構(gòu)建氧化應(yīng)激條件下花青素

對(duì)小鼠脂代謝及抗氧化性能的模型,發(fā)現(xiàn)花青素可以顯著提高小鼠肝臟的抗氧化能力和細(xì)胞的免疫機(jī)能,

從而保護(hù)肝臟功能。吳冕等[18]將滁菊總黃酮和滁菊多糖進(jìn)行配伍,發(fā)現(xiàn)合理的配比可以顯著增強(qiáng)其體內(nèi)

外抗氧化活性?？傊?黃酮類化合物的抗氧化活性和增強(qiáng)動(dòng)物體內(nèi)抗氧化物質(zhì)的表達(dá)等作用使得其研究

被逐漸重視,而沙棘鮮果中含有1500~3000mg/kg總黃酮,其更具研究?jī)r(jià)值。

植物中黃酮類化合物的提取通常選用乙醇法,借助超聲波[19]、表面活性劑[20]等處理手段可增加黃酮

得率。為優(yōu)化沙棘中黃酮的提取方法,提高沙棘黃酮得率,本試驗(yàn)借助超聲輔助提取技術(shù),在單因素試驗(yàn)

基礎(chǔ)上,通過響應(yīng)面方法確定沙棘中黃酮的最佳提取工藝,并對(duì)得到的沙棘黃酮類化合物的體外抗氧化活

性進(jìn)行研究,可為沙棘黃酮的抗氧化性質(zhì)和抗氧化能力提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),為下一步開發(fā)功能性食品、保健食

品等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)原料與試劑

沙棘全果凍干粉(新疆紅螞蟻農(nóng)業(yè)科技有限公司);蘆丁(上海源葉生物科技有限公司);無水乙醇

(AR,海博生物技術(shù)有限公司);亞硝酸鈉,硝酸銀,氫氧化鈉(AR,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑科技有限公司);亞硫

酸鐵,水楊酸(AR,天津市興復(fù)精細(xì)化工研究院);DPPH(AR,上海源葉生物科技有限公司);抗壞血酸

(AR,鄭州市化學(xué)試劑三廠)。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-200VD超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司);HH-4B恒溫水浴鍋(國(guó)華(常州)儀器制造有

限公司);SY204C電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司);FCD-2000恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上?，樮帉?shí)驗(yàn)設(shè)

備有限公司);UV-6000T紫外分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及回歸方程建立 采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法,將20mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶解于

第38卷第1期 吳翠芳,等:沙棘中黃酮類化合物提取及抗氧化活性 89

少量的60%乙醇中,加60%乙醇定容至100mL,得到0.2mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。參照林繼輝等[21]方

法,分別吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL0.2mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別加入6mL30%乙醇溶

液、1mL5%亞硝酸鈉溶液,混勻后放置6min,加入1mL30%硝酸銀溶液,混勻靜置6min,加入10mL

10%氫氧化鈉溶液,加入30%乙醇溶液至25mL,混勻后靜置15min,在510nm 處測(cè)定吸光度。得出回

歸方程y=9.8906x+0.0137,R2=0.9981,表明蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的含量與吸光度有良好的線性關(guān)系(圖1)。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與回歸方程

Fig.1 Standardcurveandregressionequation

1.3.2 單因素試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取2.00g沙棘粉末,固定其他提取因素分別考察提取時(shí)間(20、30、40、50、

60min)、提取溫度(40、50、60、70、80℃)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(40%、50%、60%、70%、80%)、料液比(1∶15、

1∶20、1∶25、1∶30、1∶35g/mL)對(duì)黃酮得率的影響。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn) 利用Design-Expert8.0.6設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)方法,提取時(shí)間(A)、提取

溫度(B)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(V乙醇/V總 )(C)、料液比(D)等4個(gè)影響因素為自變量,黃酮得率為因變量,設(shè)計(jì)四

因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)(表1)。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

Table1 Responsetoflourtestfactorleveltable

因素 水平

提取時(shí)間(A)/min 15 20 25

提取溫度(B)/℃ 60 70 80

乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)/% 40 50 60

料液比(D)/(g/mL) 1∶20 1∶25 1∶30

1.3.4 黃酮得率的測(cè)定 通過準(zhǔn)確吸取已經(jīng)處理好的沙棘黃酮溶液,在510nm 處測(cè)定吸光度 A,獲得

沙棘黃酮質(zhì)量濃度,計(jì)算沙棘黃酮得率。

1.3.5 DPPH 自由基清除率的測(cè)定 參考田建華等[22]方法。準(zhǔn)確稱將沙棘黃酮粗提取物和 Vc對(duì)照品

各0.5g,用75%乙醇定容至100mL,配制成5mg/mL沙棘黃酮粗提取物溶液和 Vc對(duì)照品溶液。然后

分別用75%乙醇溶液將其稀釋配制成1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/mL樣品溶液。稱取0.79gDPPH 粉

末加蒸餾水定容至1000mL配制成2mmol/L的DPPH 溶液。分別吸取2.0mL上述不同質(zhì)量濃度的

沙棘黃酮粗提取物樣液,加入2mL2mmol/LDPPH 溶液,將溶液在常溫下遮光30min后,于517nm下

測(cè)得吸光度 A1;分別吸取2.0mL上述不同濃度的沙棘黃酮粗提取物樣液,加入2.0mL75%乙醇于相同

波長(zhǎng)下分別測(cè)定其吸光度A2;吸取2.0mL2mmol/L的DPPH 溶液加2.0mL75%乙醇在517nm下測(cè)

定吸光度 A0,使用相同的方法測(cè)定 Vc進(jìn)行陽性對(duì)照試驗(yàn)。DPPH 自由基清除率計(jì)算公式如式(1)所示:

DPPH 自由基清除率=(1-

A1 -A2

A0

)×100% (1)

其中,A1 為2.0mL樣品溶液+2.0mL2mmol/L的DPPH溶液吸光度;A2 為2.0mL樣品溶液+2.0mL

75%乙醇溶液吸光度;A0 為2.0mL2mmol/L的DPPH 溶液+2.0mL75%乙醇溶液吸光度。

1.3.6 羥自由基清除率的測(cè)定 參考田建華等[22]方法,略有改進(jìn)。準(zhǔn)確稱將沙棘黃酮粗提取物和 Vc對(duì)

照品各0.5g,用75%乙醇定容至100mL,配制成5mg/mL沙棘黃酮粗提取物溶液和 Vc對(duì)照品溶液。

然后分別用75%乙醇將其稀釋成1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/mL樣品溶液。準(zhǔn)確稱取1.3910g硫酸亞

90 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

鐵加蒸餾水配制成5mmol/L硫酸亞鐵溶液。準(zhǔn)確稱取0.6900g水楊酸加無水乙醇配制成5mmol/L

水楊酸的乙醇溶液、再配制0.1%過氧化氫溶液。分別吸取上述不同質(zhì)量濃度的沙棘黃酮粗提取物樣液

2.0mL,加入5mmol/L硫酸亞鐵溶液、5mmol/L水楊酸乙醇溶液、0.1%過氧化氫溶液各2mL,混勻后

于530nm處測(cè)定其吸光度 A1;分別吸取2.0mL上述不同濃度的沙棘黃酮粗提取物樣液,加入蒸餾水、

0.1%過氧化氫溶液、5mmol/L水楊酸乙醇溶液各2.0mL,混勻后于530nm 處測(cè)定其吸光度 A2;吸取

蒸餾水、5mmol/L硫酸亞鐵溶液、0.1%過氧化氫溶液、5mmol/L水楊酸乙醇溶液各2.0mL,混合均勻

后,于530nm處分別測(cè)定其吸光度 A0,然后使用相同的方法測(cè)定 Vc進(jìn)行陽性對(duì)照試驗(yàn),根據(jù)式(2)計(jì)算

沙棘黃酮粗提取物和 Vc的羥自由基清除率:

羥自由基清除率=(1-

A1 -A2

A0

)×100(%) (2)

其中,A1 為2.0mL樣品溶液+2.0mL硫酸亞鐵溶液+2.0mL過氧化氫溶液+2.0mL水楊酸乙醇溶

液吸光度;A2 為2.0mL樣品溶液+2.0mL蒸餾水+2.0mL過氧化氫溶液+2.0mL水楊酸乙醇溶液

吸光度;A0 為2.0mL蒸餾水+2.0mL硫酸亞鐵溶液+2.0mL過氧化氫溶液+2.0mL水楊酸乙醇溶

液吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,所有試驗(yàn)均測(cè)定3次,結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

P<0.05表示差異顯著,P>0.05表示差異不顯著。采用 Origin8.0軟件作圖。

2 結(jié)果分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖2A結(jié)果可以看出,提取時(shí)間為10~20min時(shí),沙棘黃酮得率隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)呈遞增趨勢(shì),當(dāng)

提取時(shí)間為20min時(shí)沙棘黃酮提取效果最佳,黃酮得率顯著高于(P<0.05)其他水平,為1.44mg/g。

然而當(dāng)提取時(shí)間超出20min后,則黃酮得率逐漸下降(P<0.05),這可能是由于提取時(shí)間太久,黃酮類物

質(zhì)受到熱量的影響而分解、聚集等一系列化學(xué)反應(yīng)會(huì)影響黃酮得率;另一方面,由于乙醇在提取過程容易

揮發(fā),導(dǎo)致黃酮得率降低[23]。因此選取20min為本試驗(yàn)的最佳提取時(shí)間。

從圖2B中可以看出,隨著提取溫度的升高,沙棘黃酮得率整體表現(xiàn)出了先升高后下降的趨勢(shì)。在提

取溫度70℃時(shí),得率達(dá)到了2.09mg/g,顯著高于(P<0.05)其他溫度條件。一般來說,溫度越高,化學(xué)

反應(yīng)越快,提取效果越好,沙棘黃酮得率也就越高,但試驗(yàn)結(jié)果卻顯示在70℃后隨溫度升高黃酮得率反而

下降。其原因是提取液在適宜溫度條件下,液體分子運(yùn)動(dòng)的增加促使了黃酮分子溶出率增高,但是在過高

溫度條件下,沙棘黃酮的結(jié)構(gòu)也可能會(huì)被破壞,也更容易被氧化而生產(chǎn)其他物質(zhì)[24],從而降低沙棘黃酮得

率,故選取70℃為后續(xù)試驗(yàn)的提取溫度。

如圖2C所示,沙棘黃酮的得率會(huì)因乙醇的比例而發(fā)生變化,黃酮得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大呈現(xiàn)出

先增高后降低的趨勢(shì),在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí),黃酮得率最高,為1.72mg/g,顯著高于其他水平(P<

0.05)。Munhoz等[25]研究表明,溶劑的極性對(duì)黃酮的提取萃取有一定的影響,黃酮類化合物在乙醇溶液

中的溶解度比在水溶液中的溶解度高,就是因?yàn)樗臉O性高,而乙醇的極性低,將乙醇溶液和水溶液混合,

降低溶劑極性可以提高黃酮類化合物等酚類化合物的提取率,所以乙醇溶液在溶劑中的濃度越高,極性就

越低,提取效果就越好,沙棘黃酮得率越高。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于50%時(shí),黃酮得率顯著降低(P<0.05),

這可能是沙棘果中其他醇溶性物質(zhì)的溶出影響了沙棘黃酮類物質(zhì)的溶出[26],從而導(dǎo)致沙棘黃酮得率降

低,故選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%條件進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

由圖2D可知,沙棘黃酮得率隨料液比比值的增大總體呈現(xiàn)出增加趨勢(shì),料液比在1∶15~1∶25g/mL

時(shí),沙棘黃酮得率增長(zhǎng)最快,而1∶30~1∶35g/mL時(shí)黃酮得率增長(zhǎng)速度減緩。一般來說,溶劑量添加越

多,沙棘黃酮得率也越高,但當(dāng)料液比增加到一定的比值后,溶液中的黃酮類成分已經(jīng)基本被溶出,故沙棘

黃酮得率增加非常緩慢[27]。為了節(jié)約成本,減少黃酮類化合物干燥過程中的能耗,因此選擇料液比為

1∶25g/mL為最佳料液比。

第38卷第1期 吳翠芳,等:沙棘中黃酮類化合物提取及抗氧化活性 91

圖2 不同提取條件對(duì)沙棘黃酮提取率的影響

Fig.2 Effectsofdifferentextractionconditionsontheextractionrateofseabuckthornflavonoids

注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2 沙棘黃酮提取工藝響應(yīng)面結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 采用 DesignExpert8.0.6軟件,對(duì)沙棘黃酮的提取進(jìn)行Box-Behnken

設(shè)計(jì),響應(yīng)面試驗(yàn)及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)及結(jié)果

Table2 Experimentaldesignandresultsforresponsesurfaceanalysis

編號(hào) 提取時(shí)間(A)/min 提取溫度(B)/℃ 乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)/% 料液比(D)/(g/mL) 黃酮得率/(mg/g)

1 -1 -1 0 0 2.142

2 1 -1 0 0 1.782

3 -1 1 0 0 1.951

4 1 1 0 0 1.977

5 0 0 -1 -1 2.057

6 0 0 1 -1 1.781

7 0 0 -1 1 2.150

8 0 0 1 1 2.159

9 -1 0 0 -1 2.049

10 1 0 0 -1 1.708

11 -1 0 0 1 2.084

12 1 0 0 1 2.113

13 0 -1 -1 0 1.951

14 0 1 -1 0 2.117

15 0 -1 1 0 1.889

16 0 1 1 0 1.873

17 -1 0 -1 0 1.978

18 1 0 -1 0 1.958

19 -1 0 1 0 1.784

20 1 0 1 0 1.784

21 0 -1 0 -1 1.920

22 0 1 0 -1 1.986

23 0 -1 0 1 2.120

24 0 1 0 1 2.329

25 0 0 0 0 2.298

26 0 0 0 0 2.113

27 0 0 0 0 2.110

28 0 0 0 0 2.007

29 0 0 0 0 2.043

92 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

2.2.2 模型建立及顯著性分析 采用DesignExpert8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件,對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分

析,獲得沙棘黃酮得率對(duì)提取時(shí)間(A)、提取溫度(B)、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)(C)和料液比(D)的二次多元回歸模

型為:黃酮得率=2.07-0.056×A+0.036×B-0.078×C+0.12×D+0.097×AB+0.0051×AC+

0.093×AD-0.045×BC+0.036×BD+0.071×CD-0.11×A2-0.018×B2-0.087×C2+0.035×

D2。對(duì)該模型進(jìn)行方差分析(表3)。由表3可知,該回歸模型P<0.0001,極顯著,失擬項(xiàng)P=0.4119,

>0.05,不顯著,表明模型具有較高可靠性。R2=0.9328,R2

Adj=0.8656,試驗(yàn)結(jié)果說明,擬合程度高,誤

差小,因此模型成立,可用于分析、預(yù)測(cè)沙棘中黃酮提取的最佳條件[27]。經(jīng)方差分析,各因素對(duì)黃酮得率

的影響程度為D>C>A>B。其中,一次項(xiàng)中 A、C、D對(duì)沙棘黃酮得率影響極顯著(P<0.01),B對(duì)沙棘

黃酮得率影響顯著(P<0.05);AB、AD之間交互效應(yīng)極顯著(P<0.01),CD之間交互效應(yīng)顯著(P<0.05),

AC、BC和BD之間交互效應(yīng)不顯著(P>0.05)。

表3 響應(yīng)面結(jié)果方差分析

Table3 Analysisofvarianceforthefittedregressionmodel

方差來源 平方和 自由度 均方 F P

模型 0.54 14 0.039 13.88 <0.0001**

A 提取時(shí)間 0.037 1 0.037 13.25 0.0027

B 提取溫度 0.015 1 0.015 5.50 0.0343

C 乙醇體積分?jǐn)?shù) 0.074 1 0.074 26.43 0.0001

D 料液比 0.180 1 0.180 62.91 <0.0001

AB 0.037 1 0.037 13.37 0.0026**

AC 0.000104 1 0.000104 0.037 0.8501

AD 0.034 1 0.034 12.27 0.0035**

BC 0.00826 1 0.00826 2.96 0.1076

BD 0.00507 1 0.00507 1.81 0.1993

CD 0.02 1 0.02 7.25 0.0175*

A2 0.076 1 0.076 27.18 0.0001

B2 0.00201 1 0.00201 0.72 0.4105

C2 0.049 1 0.049 17.59 0.0009

D2 0.00784 1 0.00784 2.8 0.1162

殘差 0.039 14 0.002803

失擬項(xiàng) 0.030 10 0.00302 1.36 0.4119

純誤差 0.0089 4 0.00223

總離差 0.58 28

注:* 為差異顯著(P<0.05);** 為差異極顯著(P<0.01)。

2.2.3 各因素之間交互效用分析 圖3為影響沙棘黃酮提取各因素之間的交互效應(yīng)圖,從圖中可以直觀

看出個(gè)響應(yīng)面最大值所對(duì)應(yīng)的因素水平,另外,還可以通過響應(yīng)面投影的等高線判斷這兩個(gè)因素之間是否

存在顯著的交互效應(yīng)[28]。由圖3a可知,當(dāng)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)和料液比一定時(shí),隨著提取時(shí)間(A)和提取溫度

(B)的增加,黃酮得率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì),從圖形中各因素邊緣曲線的陡峭程度可以看出,提取時(shí)

間對(duì)沙棘中黃酮得率影響要高于提取溫度,且當(dāng)提取時(shí)間和提取溫度之間有一定的拮抗作用,提取時(shí)間會(huì)

限制提取溫度對(duì)沙棘黃酮得率的影響。從圖3c可以看出,提取時(shí)間和料液比(D)之間也有一定的拮抗作

用,當(dāng)提取時(shí)間較小且料液比過大時(shí),沙棘黃酮得率會(huì)明顯增加。圖3f中,乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)和料液比之

間也存在拮抗作用,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的過高的乙醇體積分?jǐn)?shù)反而會(huì)影響沙棘黃酮得率,限制了料液比增

加對(duì)沙棘黃酮得率的影響。

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 結(jié)合響應(yīng)面模型分析結(jié)果,利用軟件 Design-Expert8.0.6對(duì)所求極值與邊界值分析

可得出沙棘總黃酮提取工藝的最佳參數(shù)為:提取時(shí)間23.16min、提取溫度79.95 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)

48.62%、料液比1∶20,在此工藝條件下,沙棘黃酮得率為2.329mg/g?？紤]到提取沙棘黃酮工藝的可

操作性,將提取參數(shù)修正為:提取時(shí)間為23min、提取溫度為80℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、料液比為1∶20。

以此工藝條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn),得到沙棘黃酮提取率分別為:2.295mg/g、2.315mg/g、2.338mg/g,與

模型所得理論值平均誤差僅為0.5%,說明該數(shù)學(xué)模型能夠很好的模擬沙棘中黃酮類化合物的提取工藝。

第38卷第1期 吳翠芳,等:沙棘中黃酮類化合物提取及抗氧化活性 93

圖3 兩因素相互作用對(duì)沙棘黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖

Fig.3 Responsesurfacediagramoftheeffectoftwofactorsontheextractionrateofseabuckthornflavonoids

2.3 沙棘黃酮抗氧化能力的測(cè)定

2.3.1 DPPH 自由基的清除能力 人體機(jī)能通過代謝會(huì)產(chǎn)生大量自由基,自由基會(huì)對(duì)生命大分子如蛋

白質(zhì)、核酸等進(jìn)行攻擊,從而影響身體健康[29]。如果體內(nèi)的自由基過多,則可引起某些疾病,如腫瘤,心腦

血管疾病等等,并且已有科學(xué)研究證明人體衰老和自由基引起的氧化損傷有關(guān),其中DPPH 自由基,是一

個(gè)很穩(wěn)定的自由基,在實(shí)驗(yàn)室研究中常被用于抗氧化成分的體外抗氧化性測(cè)定[30]。由圖4可知,沙棘黃

酮粗提取物與 VC對(duì)照品對(duì)DPPH 自由基的清除作用呈明顯的量效關(guān)系,并且呈現(xiàn)出相同的上升趨勢(shì),

沙棘黃酮粗提取物和 VC的濃度越高,對(duì) DPPH 自由基的清除效果越佳,當(dāng)沙棘總黃酮粗提取物濃度達(dá)

到5mg/mL時(shí),對(duì)羥自由基的清除率達(dá)到了87.5%,說明沙棘黃酮有較強(qiáng)的抗氧化能力。

2.3.2 羥自由基的清除能力 羥自由基有著極強(qiáng)的毒性,是最活潑的自由基,羥自由基作用于人體內(nèi)的

核酸、蛋白質(zhì)、脂類等生物大分子,易對(duì)其細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)和功能造成一定的損傷,造成各類疾病的發(fā)生以及

機(jī)體衰老,影響人體的健康[31]。黃酮類物質(zhì)抗氧化作用的實(shí)現(xiàn)主要是通過酚羥基與自由基反應(yīng),形成一

種穩(wěn)定共振的半醌式自由基來阻斷氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[32]。由圖5可知,沙棘黃酮粗提取物和 Vc濃度越高,對(duì)

94 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào) 2024年

羥自由基的清除效果越佳,當(dāng)沙棘總黃酮粗提取物質(zhì)量濃度達(dá)到5mg/mL時(shí),對(duì)羥自由基的清除率達(dá)到

了77.7%,說明本試驗(yàn)中得到的沙棘黃酮具有較好的抗氧化作用。

圖4 沙棘黃酮對(duì)DPPH自由基清除能力的影響

Fig.4 Effectofsea-buckthornflavonoidson

DPPHfreeradicalscavengingability

圖5 沙棘黃酮對(duì)羥自由基清除能力的影響

Fig.5 Effectofseabuckthornflavonoidson

hydroxylradicalscavengingability

3 結(jié)論

采用沙棘粉末作為原料,乙醇溶液作為提取劑,并與超聲波輔助提取技術(shù)相結(jié)合的方法,分別就提取

時(shí)間(A)、提取溫度(B)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)和料液比(D)等4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn),確定最佳因素水平

為提取時(shí)間20min、提取溫度70℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1∶25g/mL。響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果表明,影

響沙棘黃酮得率的因素順序?yàn)镈>C>A>B,即料液比>乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取時(shí)間>提取溫度,最優(yōu)工藝

參數(shù)為:提取時(shí)間為23min、提取溫度為80℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、料液比為1∶20,在此條件下黃酮得

率為2.316mg/g。

沙棘黃酮粗提取物的抗氧化活性研究表明沙棘黃酮對(duì) DPPH 自由基和羥自由基都具有較好的清除

效果,當(dāng)沙棘總黃酮粗提取物質(zhì)量濃度達(dá)到5mg/mL時(shí),對(duì)DPPH 自由基和羥自由基的清除率分別達(dá)到

87.5%和77.7%。

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