二、研究成果

46

Propionate 19.70±1.7b 20.38±1.32ab 21.88±2.13a 0.028

Isobutyrate 1.81±0.23c 3.05±0.30b 3.71±0.26a <0.001

Butyrate 13.82±1.33c 17.30±1.13b 20.53±1.04a <0.001

Isovalerate 2.88±0.30c 3.64±0.42b 4.73±0.44a <0.001

Valerate 1.54±0.17c 2.10±0.14b 2.38±0.11a <0.001

Acetate: propionate ratio 3.08±0.31a 2.39±0.19b 2.40±0.32b <0.001

3.3、對瘤胃微生物組成的影響

日糧中提高完整和粉碎亞麻籽能夠影響瘤胃菌群的組成，瘤胃菌群組成如

圖 1 所示。在門水平上，如圖 1A 所示，與 CK 組相比，WF 與 GF 組中

Bacteroidetes 的豐度顯著下降，其中 GF 組豐度最低（CK：64.77%, WF：

56.53%, GF：42.84%）。而與 CK 組相比，WF 與 GF 組中 Firmicutes 的豐度顯

著升高，其中 GF 組豐度最高（CK：26.69%; WF：37.28%; GF：47.31%）。日

糧中添加粉碎亞麻籽能夠改變瘤胃中主導的菌，由 Bacteroidetes 轉化為

Firmicutes。在屬水平上，如圖 1B 所示，日糧添加亞麻籽能夠降低

Succiniclasticum （P = 0.005）、Prevotellaceae_UCG-001（P < 0.001）、

Treponema_2（P < 0.001）和 Fibrobacter（P < 0.001）的豐度，變化趨勢呈 CK

＞W(wǎng)F＞GF；然而能夠提高 Ruminococcaceae_NK4A214_group（P < 0.001）、

Christensenellaceae_R-7_group（P = 0.001）、

Eubacterium_coprostanoligenes_group（P = 0.005）、 Candidatus_saccharimonas

（P = 0.002）的豐度，變化趨勢呈 CK＜WF＜GF。

Ruminococcaceae_NK4A214_group 是已知的具有生物氫化的菌，本試驗也有同

樣發(fā)現(xiàn)，除了 Ruminococcaceae_NK4A214_group，Christensenellaceae_R7_group 和 Eubacterium_coprostanoligenes 也可能是潛在的生物氫化菌。同時也

有可能是由各具有生物氫化功能的菌的互相協(xié)作發(fā)揮生物氫化功能。

二、研究成果

47

圖 1（A）門水平上細菌群落的相對豐度（僅列出前 10 個豐度門）。（B）

屬級細菌群落的相對豐度（僅列出前 10 個豐度屬）。

使用 PCoA 對三組的 OTU 進行分析，結果如圖 2A 所示，PCo1=29.98%

PCo2=15.28%，其中 CK 與 GF 組能夠很好的區(qū)分，CK 組樣本全部位于 PCo1

負值一側，而 GF 組樣本主要位于 PCo1 正值一側。而 WF 組與 CK 組和 GF 組

均不能區(qū)分。使用 ANOSIM 檢驗同樣也發(fā)現(xiàn)三組差異極顯著（R = 0.598; P =

0.001），CK 與 GF 組在 PCoA 圖上確實能夠很好的區(qū)分。

圖 2（A） 瘤胃細菌樣品的主成分分析；（B） 三組細菌屬的相似性。

二、研究成果

48

4、結論：

不同形式亞麻籽中 ALA 的釋放是不同的，完整亞麻籽中 ALA 釋放時間比

粉碎亞麻籽時間長，這樣會導致瘤胃中 ALA、EPA 與 n-3 UPFA 的含量保持在

較高的水平，但是瘤胃中 VFA 主要與瘤胃中 ALA 的釋放量有關。每天奶牛攝

入 1500g 粉碎亞麻籽能夠在門水平上改變瘤胃主導菌群。在屬水平上，

Ruminococcaceae_NK4A214_group 是已知的具有生物氫化的菌，本試驗也有同

樣發(fā)現(xiàn)，除了 Ruminococcaceae_NK4A214_group、Christensenellaceae_R7_group、Eubacterium_coprostanoligenes 也可能是潛在的生物氫化菌。

研究成果已于 2021 年 11 月發(fā)表在《Frontiers in Microbiology》雜志。該成

果由國家重點研發(fā)計劃、中國農業(yè)科學院農業(yè)科技創(chuàng)新工程重大產(chǎn)出科研選

題、中國農業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程和現(xiàn)代農業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系專項資金資助，第

一作者為黃國欣，通訊作者為王加啟，張養(yǎng)東。

——Guoxin Huang, Liya Guo, Xiaofeng Chang, Kaizhen Liu, Wenhao Tang, Nan

Zheng, Shengguo Zhao, Yangdong Zhang and Jiaqi Wang. Effect of Whole or Ground

Flaxseed Supplementation on Fatty Acid Profile, Fermentation, and Bacterial

Composition in Rumen of Dairy Cows. Frontiers in Microbiology 2021, 12:760528.

二、研究成果

49

糖蜜對苜蓿青貯發(fā)酵品質、微生物及口感的影響

一、研究背景

苜蓿因其良好的適口性和較高的蛋白質含量被認為是一種有前景的反

芻動物優(yōu)質飼料，但在潮濕和多雨的氣候條件下，容易因需氧變質而造成

營養(yǎng)損失，需要有效的保存方法。青貯是降低苜蓿營養(yǎng)損失、提高采食

量、獲得長期保存的可行方法，在厭氧條件下通過自發(fā)乳酸(LA)發(fā)酵。隨

著乳酸菌(LAB)的快速增殖，原料中的碳水化合物轉化為以 LA 為主的有機

酸，導致 pH 迅速降低，抑制有害微生物的生長，最終獲得了飼料保存的

穩(wěn)定條件。在青貯過程中，足夠的可發(fā)酵碳水化合物作為前期可發(fā)酵的底

物對 LA 的生產(chǎn)至關重要，降低了 pH 值，提高了青貯品質。然而，由于苜

?？砂l(fā)酵碳水化合物含量不足，且其緩沖能力(BC)較大，單獨使用苜蓿難

以獲得具有競爭力的發(fā)酵品質飼料。

前期研究表明，用玉米、甜高粱等高糖飼料作為青貯苜?？娠@著提高

苜蓿青貯發(fā)酵品質。另一種策略是添加廉價的外源糖添加劑，如糖蜜，它

已被廣泛用于加速發(fā)酵和提高苜蓿青貯的質量。糖蜜添加不僅為 LA 的快

速積累和 pH 值的急劇降低提供了充足的底物，而且增加了微生物蛋白的

合成，提高了營養(yǎng)品質。前期研究表明，糖蜜添加改善了苜?；旌锨噘A發(fā)

酵品質，添加 2.5%糖蜜比添加 5.0%糖蜜更適合實際應用。相反，其他研

究發(fā)現(xiàn)糖蜜添加增加了苜蓿青貯的有氧穩(wěn)定性，但對發(fā)酵品質沒有影響。

因此，對糖蜜添加苜蓿青貯發(fā)酵品質的研究還不夠充分，存在爭議。

此外，青貯飼料的口感在青貯后會發(fā)生變化，往往會提高適口性，但

有關苜蓿青貯飼料口感的資料很少。電子舌感應系統(tǒng)(e-tongue)是一種客觀

的味覺評價方法，它能提供更接近人類感官評價的味覺結果。電子舌的工

作原理是，味覺物質與傳感器膜相互作用時，測量傳感器外膜邊界與參比

電極之間的電極電位，并通過模式識別方法將電位變化轉化為味覺信息，

對基本的味覺進行分類和識別，如酸味、咸味、苦味和鮮味。雖然電子舌

二、研究成果

50

已廣泛用于食品和飲料、制藥工業(yè)以及環(huán)境和發(fā)酵監(jiān)測，但尚未擴展到飼

料加工行業(yè)。

本研究的目的是研究添加糖蜜后苜蓿青貯的發(fā)酵品質，并為實際應用

實現(xiàn)長期保存，包括化學成分、發(fā)酵特性和微生物群落。電子舌首次用于

飼料加工，用于評價苜蓿青貯飼料的味道。

二、實驗方法

1、苜蓿的收獲和青貯的準備

在天津夢得奶牛場種植的苜蓿，于第五茬次(294.90 g kg -1 干物質

(DM))時收割。新鮮的苜蓿用鐮刀在離地約 8～10 厘米處手工切下，然后

用切紙機切成 2～3 厘米。從當?shù)厥袌霁@得糖蜜(錘度為 87%)，作為苜蓿青

貯的添加劑。將切碎的苜蓿混合，分成等量處理：新鮮苜蓿在未添加糖蜜

(對照)、添加 1%糖蜜(M1)、添加 2%糖蜜(M2)和添加 3%糖蜜(M3)條件下

青貯發(fā)酵 206 天。每個處理的飼料混合料 3.3 kg 裝入 4.9 L 聚乙烯發(fā)酵罐

中，用螺旋蓋和塑料帶密封，室溫(21～25℃)保存。每個處理包含 6 個發(fā)

酵罐。

2、發(fā)酵特性

首先，用 20 克的新鮮苜蓿青貯和 130 mL 超純水混合均勻放入 4°C 攪

拌機里搖 24 小時，然后用 4 層的無菌粗紗布過濾到燒杯里，再用定量濾紙

過濾到三角瓶中，留著測定發(fā)酵特性。

用玻璃電極 pH 計，采用伏安法立即測定濾液的 pH 值。LA 的測定采

用 Waters Acquity UPLC 系統(tǒng)，配備 Waters 2489 紫外/可見檢測器和 HSS

T3 色譜柱(2.1×100 mm，1.8 μm)。分析條件如下：烘箱溫度 35℃；流動相

A, 0.1%磷酸；流動相 B，甲醇；流速：0.2 mL/min；進樣量，5μL。乙酸

(AA)、丙酸(PA)和丁酸(BA)的測定采用美國 Agilent 7890A 氣相色譜系

統(tǒng)，F(xiàn)ID 檢測器，F(xiàn)FAP 色譜柱(15m×0.32mm×0.25μm)。分析條件如下：入

口溫度為 250°C；載氣壓力為 He 19.991 kPa；進樣量為 2μL。

二、研究成果

51

3、化學成分

用苯酚-次氯酸鈉法測定濾液中 NH3-N 含量。新鮮的苜蓿和青貯樣品

在 65°C 的烘箱中干燥 48h，計算干物質（DM）；然后，樣品通過粉碎機

粉碎后過 1mm 篩，用于化學成分分析。

粗蛋白(CP)測定采用凱氏定氮法，按 AOAC 標準程序進行；中性洗滌

纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)的測定采用纖維分析儀；水溶性碳水化合

物(WSC)含量采用蒽酮比色法測定。

4、DNA 提取

使用 HiPure Stool DNA 試劑盒從每個青貯樣品中提取微生物 DNA。取

10 g 樣品與 90 mL 無菌生理鹽水混合，用紗布過濾，離心。

5、PCR 擴增及 16S rRNA 測序

采用通用引物 799F (CCTAYGGGRBGCA)和 1193R

(ACGTCATCCCCACCTTCC)擴增 16S rRNA 的 V5-V7 區(qū)。用 KOD 聚合酶

在 94°C (2 min)下進行 PCR 擴增，然后在 98°C (10 s)、62°C (30 s)、68°C

(30 s)下進行 30 個循環(huán)，最后在 68°C 下延伸 5 min。

6、口感的測定

采用電子舌傳感系統(tǒng)(INSENT SA402B，日本)測定青貯濾液的味道。

首先，以 30 mM KCl 和 0.3 mM 酒石酸為參比溶液，通過傳感器 AAE、

CT0、CA0、C00 和 AE1 的輸出分別評價鮮味、咸味、酸味、苦味和澀

味。傳感器輸出通過工作站平臺上的程序轉換為“味道信息”，其中“1 單

位”定義為一個人能區(qū)分的最小差異。

7、統(tǒng)計分析

本研究采用完全隨機設計。所有化學成分和發(fā)酵參數(shù)的數(shù)據(jù)均采用單

因素方差分析(ANOVA)，使用 SPSS 統(tǒng)計 v. 26.0 (IBM, Armonk, NY, USA)

進行分析。P < 0.05 和 P < 0.01 分別表示差異顯著和差異極顯著。統(tǒng)計模

型如下:

二、研究成果

52

Yij = μ + Ti + Eij

其中，Yij 為觀測的因變量，μ 為總體均值，Ti 為處理效果，Eij 為誤

差。

三、結果與討論

1、苜蓿青貯的化學成分

由表 1 可知，糖蜜添加對苜蓿青貯飼料 DM、WSC、NDF 和 ADF 含

量有顯著影響(P < 0.05)，但對粗蛋白質含量無影響。隨著糖蜜添加量的增

加，苜蓿青貯 DM 含量略有增加，M2 組和 M3 組分別比對照組高 10%和

5.4%。與此同時，WSC 含量在青貯后下降，并穩(wěn)定在 30 g/kg DM 左右。

NDF 含量在青貯后下降，維持在 68.27～76.94%。青貯后 ADF 含量保持穩(wěn)

定，保持在 91.71～101.10%。CP 含量各處理間無顯著差異，與青貯前基

本一致。結果表明，苜蓿青貯的 WSC 大部分被消耗，部分 NDF 在青貯過

程中被分解，DM、CP、ADF 含量保持相對穩(wěn)定。各處理中，M3 組 DM

和 CP 含量最高，NDF 含量最低。

表 1 苜蓿青貯的化學組成(n = 6)

Items

Treatment p Value

Control M1 M2 M3

DM (g/kg

FM)

297.03±1.74c 295.94±0.49c 306.77±0.73b 312.88±0.75a 0.048

CP (g/kg DM) 245.75±0.58 247.05±0.32 242.04±0.72 250.90±0.69 0.149

WSC (g/kg

DM)

31.71±0.82b 28.52±0.63b 37.19±0.86a 32.19±0.73b <0.001

NDF (g/kg

DM)

281.99±0.99a 275.30±1.46a 290.21±2.27a 257.50±1.18b 0.013

二、研究成果

53

ADF (g/kg

DM)

210.06±0.52a 204.72±1.04a 207.28±0.75a 190.55±0.90b 0.004

2、苜蓿青貯發(fā)酵特性

由表 2 可知，糖蜜添加對紫花苜蓿青貯的 pH 值、LA、AA、PA、

NH3-N 含量和 LA/AA 含量有顯著影響(P < 0.05)，但對 BA 含量無顯著影

響。

鮮苜蓿的 pH 值為 5.91，青貯后降低，隨著糖蜜添加，pH 從 5.16 顯著

降低到 4.48。與對照組相比，M1、M2、M3 組 LA 含量分別顯著提高了

19.82%、21.40%、44.17%，AA 含量分別顯著降低了 2.97%、25.35%和

32.44%。LA/AA 相應從 3.30 增加到 6.84。隨著糖蜜添加量的增加，M1、

M2 和 M3 組的 PA 含量分別顯著降低了 24.78%、67.83%和 70.43%。BA 含

量較低，分別降低了 30.30%、51.52%和 87.88%，NH3-N 含量也顯著降低

了 24.91%、47.03%和 48.25%。

結果表明，青貯過程中 pH 值快速下降。在所有處理中，M3 組 pH 值

和 AA、PA、BA 和 NH3-N 含量最低，LA 含量和 LA/AA 最高。

表 2 苜蓿青貯發(fā)酵特性(n = 6)

Items

Treatment p Value

Control M1 M2 M3

pH 5.16±0.20a 4.84±0.09b 4.63±0.06c 4.48±0.02d <0.001

LA (g/kg

DM)

67.21±13.69c 80.53±10.87b 81.59±7.64b 96.90±8.78a <0.001

AA (g/kg

DM)

21.18±4.49a 20.55±4.23a 15.81±2.25b 14.31±1.42b 0.006

二、研究成果

54

PA (g/kg

DM)

2.30±0.73a 1.73±1.06a 0.74±0.35b 0.68±0.26b <0.001

BA (g/kg

DM)

0.66±0.60 0.46±0.47 0.32±0.23 0.08±0.09 0.132

LA/AA 3.30±0.88c 3.97±0.36bc 5.21±0.85b 6.84±1.05a <0.001

NH3-N (g/kg

TN)

100.86±27.90a 75.74±4.60b 53.43±4.69c 52.20±3.73c <0.001

3、苜蓿青貯的口感

如圖 1a 所示，雷達圖顯示的是味覺信息，一個單位對應人可以分辨的

最小味覺差異。所有苜蓿青貯樣品均具有較強的苦味、澀味和酸味，反映

了苜蓿青貯的味道。隨著糖蜜添加量的增加，酸味增加，鮮味減少，苦

味、澀味和咸味保持不變。同時，對不同口味進行主坐標分析。如圖 1b 所

示，M3 組與對照組的口味有明顯的區(qū)別。

圖 1 苜蓿青貯飼料的口感分析(n=6)。(a)雷達圖。(b)主坐標分析。

4、苜蓿青貯微生物群落研究

采用 PCR 擴增和 16S rRNA 測序技術，描述了苜蓿青貯微生物群落，

從圖 2 可以看出，青貯 206 天后的苜蓿青貯優(yōu)勢屬為腸球菌(Enterococcus)

二、研究成果

55

和乳酸菌(Lactobacillus)，同時存在少量的泛菌(Pantoea)、腸桿菌

(Enterobacter)和魏斯氏菌屬(Weissella)等。隨著糖蜜添加量的增加，優(yōu)勢

菌屬腸球菌和乳酸菌的百分比逐漸增加并趨于穩(wěn)定，對照組含量為

88.63%，M1 組含量為 81.33%，M2 組含量為 93.20%，M3 組含量為

93.86%。在較低的 pH 條件下，不良微生物受到抑制，因此丙酸(PA)、丁

酸(BA)和氨氮(NH3-N)含量降低。

圖 2 16S rRNA 序列測定苜蓿青貯 206 d 后的微生物群落(n=6)

四、結論

青貯后，苜蓿青貯的 DM 和 CP 含量基本沒有變化，說明大部分營養(yǎng)

成分得到了保留。發(fā)酵底物 WSC 降至 30 g/kg DM 左右，pH 值也降至

5.16。在較低的 pH 條件下，NDF 含量下降主要是由于植物細胞消化更

多，而 ADF 含量保持穩(wěn)定。隨著糖蜜添加量的增加，苜蓿青貯的 DM、CP

和 ADF 含量保持穩(wěn)定。pH 值從 5.16 顯著降低到 4.48，導致 NDF 降低，

LA 含量和 LA/AA 增加，說明苜蓿青貯發(fā)酵已向異型發(fā)酵轉變。青貯后的

優(yōu)勢菌屬為腸球菌(Enterococcus)和乳酸菌(Lactobacillus)，在較低的 pH 條

件下，不良微生物受到抑制，導致 BA、PA 和 NH3-N 產(chǎn)量降低。此外，強

烈的苦味、澀味和酸味可以反映苜蓿青貯的味道，而隨著糖蜜添加量的增

加，鮮味和酸味的變化可能會改善苜蓿青貯的味道，總體上，糖蜜的添加

二、研究成果

56

改善了發(fā)酵品質，改變了苜蓿青貯的味道。在所有處理中，M3 組獲得了

最理想的 pH 值(小于 4.5)和長期保存的最佳條件。

該研究成果已在《Animals》上發(fā)表。該研究得到中國農業(yè)科學院農業(yè)

科技創(chuàng)新工程重大產(chǎn)出科研選題(CAAS-ZDXT2019004)、中國農業(yè)科學院

科技創(chuàng)新工程(ASTIP-IAS12)、現(xiàn)代農業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系專項資金(CARS-36)

等項目支持。羅潤博為第一作者，王加啟研究員為通訊作者。

——Runbo Luo, Yangdong Zhang, Fengen Wang, Kaizhen Liu, Guoxin Huang,

Nan Zheng, Jiaqi Wang* . Effects of Sugar Cane Molasses Addition on the

Fermentation Quality, Microbial Community, and Tastes of Alfalfa Silage.

Animals . 2021. 11(2). 355

二、研究成果

57

2. 奶產(chǎn)品質量安全風險評估

β-內酰胺類抗生素對生乳菌群和耐藥基因影響

一、研究背景

牛乳房炎主要由乳房內細菌侵入乳房引起，是奶牛最常見的疾病之一。牛

乳房炎會降低牛奶產(chǎn)量和牛奶質量，增加獸醫(yī)費用，并降低動物福利。乳房炎

也是牛場抗生素使用比例較高的疾病。在法國，70%的奶牛治療抗生素都用于

治療牛乳房炎。如今，抗生素的濫用已成為公共衛(wèi)生的一大問題，在不同環(huán)境

樣本甚至食品中都發(fā)現(xiàn)了大量的抗生素耐藥菌?？股啬退幈徽J為是世界上公

眾面臨的最大風險之一。食品中抗生素耐藥細菌（Antibiotic Resistance Bacteria，

ARB）的流行導致人們擔心食物可能是抗生素耐藥基因（Antibiotic Resistance

gene，ARG）的儲存庫并能夠傳播抗生素耐藥性。近年來，已經(jīng)在從乳制品中分

離出的 ARB 中發(fā)現(xiàn)了 ARG。此外，微生物群落的耐藥水平將影響抗生素治療

后其他微生物群落的動態(tài)，導致抗生素耐藥性進一步增加。使用抗生素的動物

可能也會將 ARB 和 ARG 傳播到周圍環(huán)境中。

頭孢菌素用于治療人和動物的各種細菌感染。在歐洲獸用抗生素消費監(jiān)測

委員會(ESVAC)監(jiān)測的 26 個國家中，近年來第三代和第四代頭孢菌素的使用有

所增加。目前，很少有報道通過 16S rDNA 測序研究治療性使用 β-內酰胺類抗

生素對牛奶中微生物群和耐藥基因的影響。因此，本研究的目的是研究頭孢菌

素治療后牛奶微生物群和耐藥基因的變化。評價抗生素的影響對維持合理使用

抗生素具有重要意義。

二、研究成果

58

二、實驗方法

1. 樣品采集

在研究之前，奶牛沒有接觸過抗生素?？偣策x擇了 7 頭患乳房炎的奶牛。

確診后，將這些奶牛的牛奶從乳房收集到 400mL 無菌塑料瓶中，然后將頭孢噻

呋注射到肌肉中，濃度為 2mg/kg，頭孢喹肟按 0.75 ng/kg/天的水平持續(xù)乳注 3

天。然后在第 1、2、3、4、6、8、9、11、13 和 15 天對所有奶牛取樣。牛奶中

的體細胞計數(shù)在第 4 天恢復到正常值，奶牛停止接受抗生素治療。第 9 天檢測

牛奶中無抗生素殘留。第 0 天為用藥前；第 1 天至第 3 天為用藥期；第 4 天至

第 8 天為休藥期；第 9 天至第 15 天為休藥期后。

2. PCR 擴增

16S rDNA 的 V3-V4 區(qū)（94℃ 2 min，然后 98℃ 10 s，62℃ 30 s，68℃

30 s，30 個循環(huán)，最后在 68℃下延伸 5 分鐘）使用引物 341F：

CCTACGGGNGGCWGCAG 和 806R：GGACTACHVGGGTATTCTAAT。用 50

μL 混合物進行三次重復 PCR 反應，該混合物含有 5 μL 10 × KOD 緩沖液、5

μL 2 mM dNTP、3 μL 25 mM MgSO4、1.5 μL 上下游引物（10 μM）、1 μL

KOD 聚合酶和 100 ng 模板 DNA。

3. 耐藥基因的定量檢測

使用 qPCR 評估了 16 個抗生素耐藥基因的數(shù)量，包括 β-內酰胺類（cfxA、

blaROB、bla1 和 blaTEM）、氨基糖苷類（strA 和 strB）、大環(huán)內酯類[erm (A)

和 erm(B)]、磺胺類（sul1 和 sul2）、四環(huán)素類[tet(B)、tet(C)、tet(Q)和 tet(H)]

和萬古霉素類（vanC 和 vanG）。這些基因與 16S rRNA 基進行比例計算，也可

以通過 qPCR 進行量化。使用 357-F：5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3'和 518-

R：5'-ATTACCGCGGCTGCCTGG-3'引物擴增 16S rRNA 基因，這些引物也用

于生成 16s rRNA 基因庫。

二、研究成果

59

三、結果

α-多樣性通過豐富度（Chao 1）和多樣性指數(shù)（Shannon 和 Simpson）來

衡量。不同時期微生物群的 Shannon 多樣性指數(shù)和 Chao 1 指數(shù)的平均值相似，

表明微生物群的豐富度沒有顯著增加。然而，不同時期的 Simpson 指數(shù)平均值

存在顯著差異，表明抗生素處理可能對微生物群落多樣性產(chǎn)生影響（圖 A）。

對不同時期采集的牛奶樣品進行微生物種群的科級微生物種群分布分析。從科

水平看，假單胞菌科、伯克霍爾德菌科、瘤胃球菌科和毛螺菌科是數(shù)量最多的

四個科，屬于梭狀芽孢桿菌（圖 B）。對于一些經(jīng)常檢測到的乳房炎相關細

菌，抗生素的使用也影響了其組成。最值得注意的是，腸桿菌的相對豐度在藥

物治療時顯著降低（p < 0.05），并且從藥物治療到停藥期間持續(xù)降低（圖

C）。不同時期葡萄球菌和芽孢桿菌的相對豐度無顯著差異。

對來自四個不同采樣周期的牛奶樣品中的 16 個抗生素耐藥基因的比例進行

定量檢測，頭孢噻呋和頭孢喹肟在休藥期顯著增加了牛奶中 blaTEM 的比例

（圖 D）。與休藥期相比，休藥期后 blaTEM 的相對豐度顯著增加。其他耐藥

基因不受抗生素治療的影響（數(shù)據(jù)未顯示）。

二、研究成果

60

圖 A 不同時期的 α 多樣性。x0 用藥前，X 用藥期，Y 休藥期，Z 恢復期

圖 B 不同時期科水平上的微生物組成

圖 C 牛乳腺炎相關細菌屬的相對豐度。a）腸桿菌屬，b）葡萄球菌屬，

c）芽孢桿菌屬

二、研究成果

61

圖 D β-內酰胺類耐藥基因 blaTEM 與 16S rRNA 基因的比例

四、結論

這項研究提供了受頭孢菌素影響的牛奶微生物群和耐藥基因的概況。隨著

頭孢菌素的使用，腸桿菌屬的相對豐度顯著降低。然而，β-內酰胺基因 blaTEM

的相對豐度在休藥期有所提高。頭孢菌素治療對牛奶微生物群和耐藥基因的影

響值得進一步研究。

研究成果已在國際知名學術期刊《Journal of Dairy Science》2021 年第 104 期

7018–7025頁上發(fā)表。董蕾和孟璐博士為共同第一作者，王加啟研究員為通訊作

者。

——L. Dong, H. M. Liu, L. Meng, M. R. Xing, J. Q. Wang, C. Wang, H. Chen,

N. Zheng. Effect of therapeutic administration of β-lactam antibiotics on the bacterial

community and antibiotic resistance patterns in milk. Journal of Dairy Science 104：

7018-7025.

二、研究成果

62

生乳菌落總數(shù)及熱處理對乳制品內毒素含量的影響

原料奶營養(yǎng)豐富，是微生物的優(yōu)質培養(yǎng)基。奶牛的養(yǎng)殖環(huán)境、擠奶條件和

運輸條件均可能會造成微生物污染，導致生牛乳中微生物多樣性和數(shù)量發(fā)生重

大變化，甚至導致病原菌入侵。為了確保消費者的健康，乳品廠采用熱滅菌法

處理生牛乳，以消除生牛乳中微生物的潛在威脅。然而，微生物死亡后釋放的

內毒素不能通過牛乳熱滅菌過程完全滅活。內毒素也稱為脂多糖（LPS），是

革蘭氏陰性菌的主要成分，它為細菌提供了一種有效抵抗抗生素化合物的通透

性屏障，并防止補體介導的裂解。LPS 的一般結構由三個不同區(qū)域組成：（1）

由糖磷脂組成的脂質 A 在細胞膜內層具有免疫原性，（2）通過共價鍵與脂質

A 相連的核心低聚糖結構，以及（3）由重復的低聚糖單元組成的抗原性 O 鏈

多糖。在 250℃下加熱 30 分鐘或在 180℃下加熱 3 小時，可使內毒素完全失

活。牛乳經(jīng)不起如此長時間的高溫處理。當前的乳制品加工技術中，生牛乳的

內毒素污染不能通過熱處理工藝消除。然而，不同的生產(chǎn)工藝，特別是熱處理

強度對牛乳制品中內毒素的影響尚不清楚。

在對南非、荷蘭、西班牙、瑞士、美國、比利時、愛爾蘭、斯洛文尼亞和

英國七個國家生產(chǎn)的嬰兒配方奶粉（IFM）的調查中，發(fā)現(xiàn) IFM 中的最高內毒

素為每克 55000 個內毒素單位（EU）每毫升。在健康條件下，如果沒有因飲酒

和腸炎引起的腸道損傷，內毒素不會對人體產(chǎn)生免疫刺激。當成人腸道結構受

損時，腸道內的內毒素可能進入血液并觸發(fā)免疫反應。對于腸道結構尚未完全

發(fā)育的嬰兒，攝入內毒素可能對健康構成威脅。有研究顯示，嬰兒攝入內毒素

可能導致腸道、血液、肺、肝臟和其他器官的免疫反應甚至炎癥。因此，研究

不同乳制品中的內毒素水平以及加工過程對成品奶制品中內毒素的影響，對乳

制品原料奶質量的可追溯性評價具有重要意義。

表 1 總結了在 20℃下儲存的生牛乳成分隨儲存時間的變化。ALP、SFA、

MUFA 和 PUFA 無顯著變化（P>0.05）。LPO 活性在貯藏 24h 后下降，48h 后

顯著升高（P<0.05）。新鮮生牛乳中 TBC 的平均值為 2.13 log CFU/ml，并隨貯

二、研究成果

63

存時間顯著增加（P<0.001）。儲存 24 小時后，TBC 含量增加了 10000 倍，達

到 6.12 log CFU/ml。與儲存 24 小時的生牛乳相比，儲存 48 小時的生牛乳 TBC

含量增加 50 倍，達到 7.48 log CFU/ml。同時，生牛乳在 0、24 和 48 小時的內

毒素含量（LPS）為 1.29 log EU/ml（20 EU/ml），分別為 2.5 log EU/ml（353

EU/ml）和 3.81 log EU/ml（9649 EU/ml）。

表 1 貯存時間對原料乳 TBC 及成分的影響

表 2 對牛奶成分數(shù)據(jù)隨熱處理強度增加的變化進行統(tǒng)計分析。處理后的牛

奶中 ALP 和 LPO 顯著降低（P<0.001）。75℃處理 15s，可有效殺滅牛乳中

99.88%的細菌。此外，隨著處理強度的增加，牛乳中的內毒素含量顯著增加

（P<0.05，圖 1A）。雙向方差分析表明，生牛乳中的 TBC 含量對牛乳中的內

毒素含量有顯著影響（P<0.001，圖 1b）。熱處理強度不影響牛乳中脂肪酸的比

例。當根據(jù)原料奶的儲存天數(shù)將數(shù)據(jù)進行單向方差分析時，SFA 的比例隨著儲

存時間的變化而顯著增加（P<0.05），MUFA 的比例顯著降低（P<0.05）。

圖 1 通過中試驗證原料乳加熱溫度和 TBC 對滅菌乳內毒素含量的影響

Day1 Day2 Day3 P-value

Lg-TBC 2.13±0.12 c

6.12±0.17 b 7.48±0.43 a <0.001

Lg-LPS 1.29±0.08 c

2.5±0.15 b 3.81±0.32 a <0.001

Lg-ALP 5.25±0 5.25±0 5.24±0 0.564

Lg-LPO 4.07±0.08 ab 3.96±0.04 b 4.46±0.14 a <0.05

SFA (%) 70.93±0.04 70.91±0.12 71.22±0.29 0.466

MUFA (%) 25.2±0.02 25.19±0.13 24.83±0.38 0.484

PUFA (%) 3.87±0.04 3.9±0.02 3.95±0.1 0.663

a b

二、研究成果

64

表 2 熱處理強度對牛奶成分的影響

對所有牛奶進行 37 種脂肪酸檢測，在所有牛乳樣品中均未檢測到

c15:1n5、c20:3n3 和 c22:6n3（DHA）（圖 2）。四種 SFA（C14、C16、C18 和

C24）、一種多不飽和脂肪酸（c22:1n9）和兩種多不飽和脂肪酸（c22:2n6、

C18:2n6）在儲存 24 和 48 小時的生牛乳和滅菌牛乳中的比例增加。

圖 2 中試牛奶樣品脂肪酸含量差異分析。

Group Lg-ALP Lg-LPO Lg-TBC Lg-LPS SFA (%) MUFA (%) PUFA (%

1D-RM 5.25±0.00 4.07±0.08 2.13±0.12 1.29±0.08 70.93±0.04 25.20±0.02 3.87±0.04

1D-72℃ 3.13±0.03 3.05±0.32 0.28±0.28 1.37±0.07 70.95±0.01 25.20±0.04 3.85±0.04

1D-75℃ 3.27±0.02 2.53±0.21 0.00±0.00 1.43±0.05 70.90±0.08 25.23±0.06 3.87±0.04

1D-80℃ 3.15±0.11 1.56±0.45 0.00±0.00 1.49±0.09 71.00±0.14 25.17±0.13 3.83±0.05

1D-85℃ 3.13±0.11 1.37±0.36 0.00±0.00 1.60±0.10 70.87±0.10 25.24±0.06 3.89±0.04

1D-90℃ 3.06±0.11 1.07±0.06 0.00±0.00 1.66±0.11 70.89±0.05 25.24±0.03 3.87±0.02

1D-95℃ 3.07±0.17 0.95±0.00 0.00±0.00 1.77±0.19 70.95±0.05 25.2±0.03 3.85±0.04

1D-100℃ 3.03±0.14 0.93±0.06 0.00±0.00 1.80±0.20 70.95±0.04 25.18±0.03 3.87±0.04

1D-105℃ 3.02±0.12 0.87±0.07 0.00±0.00 1.83±0.22 70.96±0.08 25.17±0.04 3.86±0.04

1D-110℃ 3.06±0.14 0.87±0.07 0.00±0.00 2.01±0.18 70.96±0.06 25.21±0.03 3.83±0.04

1D-115℃ 3.17±0.22 0.77±0.04 0.00±0.00 1.98±0.15 70.97±0.11 25.16±0.08 3.87±0.04

1D-120℃ 2.77±0.07 0.84±0.04 0.00±0.00 2.27±0.23 70.81±0.11 25.36±0.12 3.82±0.03

Day1 P-value <0.001 <0.001 <0.001 <0.005 0.943 0.774 0.989

2D-RM 5.25±0.00 3.96±0.04 6.12±0.17 2.5±0.15 70.91±0.12 25.19±0.13 3.9±0.02

2D-75℃ 2.77±0.12 2.60±0.27 0.26±0.14 2.69±0.05 71.10±0.27 25.01±0.29 3.89±0.04

2D-90℃ 2.78±0.08 1.45±0.05 0.10±0.10 2.89±0.22 71.14±0.29 24.90±0.40 3.96±0.11

Day2 P-value <0.001 <0.001 <0.001 0.298 0.784 0.796 0.792

3D-RM 5.24±0.00 4.46±0.14 7.48±0.43 3.81±0.32 71.22±0.29 24.83±0.38 3.95±0.10

3D-75℃ 2.20±0.42 2.02±0.47 0.99±0.84 4.58±0.43 71.09±0.33 24.99±0.36 3.92±0.03

3D-90℃ 1.90±0.64 1.08±0.07 0.88±0.88 4.87±0.47 71.28±0.35 24.84±0.39 3.87±0.06

Day3 P-value <0.005 <0.001 <0.001 0.251 0.918 0.949 0.704

Total P-value0.562 <0.05 <0.001 <0.001 <0.05 <0.05 0.051

二、研究成果

65

通過 Spearman 分析所有牛乳樣品成分之間的相關性；P<0.05 的結果總結為

熱圖（圖 3）。牛乳中的內毒素（LPS）與 ALP、C4、C6、c20:5n3 呈負相關。

此外，牛乳中的內毒素（LPS）與 C14、C15、C18、C24、c22:1n9、c22:2n6 和

C24:1n9 呈正相關。TBC 與 ALP、LPO 呈正相關。SFA 與 MUFA 呈顯著負相

關。雖然生牛乳中的 TBC 含量與內毒素顯著相關（P<0.001，圖 1b），但牛乳

制品中的 TBC 含量與內毒素無關（P>0.05）。因此，單純檢測產(chǎn)品中的 TBC

指數(shù)不能完全保證牛乳產(chǎn)品的微生物安全。

圖 3 在中試加工驗證牛奶中脂肪酸、TBC、內毒素（LPS）、堿性磷酸酶

（ALP）和乳過氧化物酶（LPO）的相關性。

嬰兒配方奶粉樣品的內毒素含量結果。共分析了 75 份國產(chǎn)嬰兒配方奶粉樣

品。平均內毒素含量為 2.605 log EU/ml（14 EU/ml 至 4731 EU/ml）。同時，我

們分析了 74 種進口嬰兒配方奶粉，平均內毒素含量為 2.359 log EU/ml（6

EU/ml 至 9080 EU/ml）。t 檢驗結果顯示，進口和國產(chǎn) IFM 在各階段的內毒素

含量均無顯著性差異（P>0.05）。四段 IFM 的平均內毒素含量明顯低于其他階

段 IFM。這可能是因為對 3 歲以上的兒童使用了第 4 階段 IFM。第 4 階段 IFM

的成分不同于其他階段的 IFM，導致內毒素含量不同。

二、研究成果

66

表 4 總結了不同商業(yè)乳制品的內毒素含量。它包括巴氏殺菌牛乳（PM）、

超高溫瞬時滅菌乳（UHT）和重組嬰兒配方奶粉（IFM）。37 份巴氏滅菌乳樣

品的內毒素含量最低（1.347 log EU/ml，6 EU/ml 至 231 EU/ml），40 份 UHT

乳樣品（1.865 log EU/ml，31 EU/ml 至 1437 EU/ml）的內毒素含量介于 PM 和

IFM 之間，149 份重組 IFM 樣品的內毒素含量最高（2.483 log EU/ml，6 EU/ml

至 9080 EU/ml）。不同乳制品的內毒素含量有顯著性差異（P<0.001）。

表 4 市售乳制品中的內毒素

在這項研究中調查了市場上乳制品的內毒素含量。結果表明，不同 IFM 的

內毒素含量差異較大，熱處理強度較高的乳制品內毒素含量較高。中試加工驗

證試驗發(fā)現(xiàn)，生牛乳的 TBC 含量和熱處理強度會顯著影響滅菌牛乳的內毒素含

量。綜上所述，乳制品中存在內毒素，生牛乳中的細菌含量和熱處理溫度影響

乳制品中的內毒素含量。

該成果由中國博士后特別資助項目、國家重點研發(fā)計劃、中國農業(yè)科學院

重大任務和現(xiàn)代農業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系等項目資助，吳浩銘為文章第一作者，王加

啟為文章通訊作者。

——Wu H, Wang Y, Hao X, Meng L, Li H, Cheng M, Zheng N, Wang J. Effect

of TBC of raw milk and thermal treatment intensity on endotoxin contents of milk

products. Food Res Int (2021)110816. doi:10.1016/j.foodres.2021.110816

N Mean SD SE MIN MAX

PM 37 1.347 c 0.269 0.044 0.754 2.364

UHT 40 1.865 b 0.420 0.066 1.489 3.157

IFM 149 2.483 a 0.651 0.053 0.764 3.958

二、研究成果

67

建立牛奶中 AFM1 的核酸適配體檢測技術

一 、研究背景

霉菌毒素是由霉菌產(chǎn)生的次級代謝物，通過污染飼料和動物性食品（肉、

蛋、奶等），對動物生產(chǎn)性能以及人類的組織和器官產(chǎn)生極大的危害。目前有

400 多種已知的霉菌毒素對人類和動物具有潛在毒性，常見的霉菌毒素主要包

括 AFB1、AFM1、OTA、FB1。AFM1 是 AFB1 的羥基化代謝產(chǎn)物，受污染的

動物飼料中約有 2-6％的 AFB1 在牛奶中轉化為 AFM1。AFM1 已被國際癌癥研

究機構（International Agency for Research on Cancer，IARC）列為第 1 類致癌

物。一旦原料奶被 AFM1 污染，牛奶和乳制品的常規(guī)熱處理（巴氏殺菌或超高

溫）不易降解 AFM1。

盡管嚴格控制牛奶中 AFM1，但 AFM1 污染事件仍時常發(fā)生。因此，檢測

牛奶中 AFM1 的方法引起了更多的關注。目前已經(jīng)開發(fā)了許多檢測 AFM1 的方

法，包括高效液相色譜法（HPLC）、薄層色譜法（TLC）、氣相色譜法

（GC）和質譜法（MS）等儀器分析方法以及基于抗體的酶聯(lián)免疫反應

（ELISA）、免疫傳感器和表面等離子共振（SPR）等免疫分析方法。但這些檢

測方法仍存在一些問題，比如在儀器分析方法在樣品前處理過程中，步驟繁

雜、耗時長且不適合現(xiàn)場操作，同時需要大量的專業(yè)技術人員，而免疫分析方

法中使用的抗體價格昂貴且不穩(wěn)定，制備時間長，不容易長期存儲等。目前，

基于核酸適配體的生物傳感器因具有易合成、易標記、易修飾、靈敏度高、特

異性高、分子量小、檢測成本低等優(yōu)勢而受到廣泛的關注。

由于基于核酸適配體的熒光淬滅信號感應平臺具有較高的靈敏度和特異

性，它們被認為是用于檢測各種生物分子的比較有前途的方法，并且在團隊先

前的研究中，熒光淬滅方法已被用于檢測 AFB1。Sharma 等開發(fā)了一種用于檢

測 AFM1 的結構轉換適配體。但是，該適配體對 AFM1 的選擇性尚不清楚，因

為只選擇了不相關的 OTA 和 AFB1 作為研究交叉反應的干擾物，而其他毒素

二、研究成果

68

（尤其是結構類似物 AFB1、AFB2、AFG1 和 AFG2）之間的交叉活性測試實驗

沒有進行。 此外，食物中多種霉菌毒素的共存是一種常見而復雜的現(xiàn)象。因

此，應研究混合真菌毒素對適配體傳感器特異性的影響。

本文研究基于核酸適配體的熒光傳感器檢測牛奶中 AFM1，并研究了該適

配體最優(yōu)互補 DNA 和結構轉換信號，可通過熒光的變化定量檢測 AFM1 濃

度。

二、實驗方法

1. 基于適配體的 AFM1 熒光檢測方法

用 Tris-HCl 緩沖液溶解稀釋 AFM1 aptamer 和 cDNA，將 AFM1 aptamer 與

cDNA 按照一定比例混合混勻，再將混合物于 88 ℃下水浴加熱 5 min，之后室

溫下靜置至少 30 min，此時反應總體積為 1.0 mL。之后，向反應混合物添加

500 μL 不同濃度的 AFM1 標準溶液并渦旋混勻，最終反應體系體積為 1.5 mL，

用熒光分光光度計測量此時的熒光強度。類似地，將 500 μL Tris-HCl 緩沖液加

入到 AFM1 aptamer 和 cDNA 的混合物中，同時在不添加 AFM1 的情況下渦旋

混勻，然后用熒光分光光度計測量熒光淬滅時的熒光強度。為了避免黃曲霉毒

素背景熒光信號的影響，通過測量含有 AFM1 和 Tris-HCl 緩沖液但不含 AFM1

aptamer 或 cDNA 的作為試驗對照，對試驗進行熒光背景校正。

2. AFM1 適配體和 cDNA（1~7）優(yōu)化

對試驗中 AFM1 aptamer 與 cDNA 1~cDNA 7 進行優(yōu)化，該實驗中使 AFM1

aptamer 與 cDNA 的摩爾比為 1：2，反應中 AFM1 終濃度為 150 ng/mL。

3. 適配體和 cDNA 濃度比優(yōu)化

該試驗采用最優(yōu) cDNA，并設定 AFM1 aptamer：cDNA 的濃度摩爾比比例

為 1：1、1：2、1：3、1：4 和 1：5，反應中 AFM1 終濃度為 150 ng/mL。

4. AFM1 濃度分析

二、研究成果

69

該試驗采用最優(yōu) cDNA 鏈，以及最優(yōu) AFM1 aptamer：cDNA 的濃度摩爾

比，反應中 AFM1 的終濃度依次為 0、1、5、10、20、40、60、80、150、

200、300 和 400 ng/mL。

5. 特異性分析

為了評估該檢測方法對 AFM1 的特異性，選擇與 AFM1（AFB1、AFB2、

AFG1、AFG2、OTA、ZEN 和 FB1）結構相關的 7 種霉菌毒素用于測試。該特

異性試驗中，所有霉菌毒素均使用相同濃度（40 ng/mL）。試驗中所有檢測條

件均與檢測 AFM1 相同。

6. 牛奶樣品分析

該試驗用于定量檢測已知 AFM1 濃度的的液態(tài)奶樣品中的 AFM1。當牛奶

樣品中 AFM1 的濃度在 1~100 ng/mL 范圍內時，使用以下預處理方法。向牛奶

樣品中分別加入濃度為 5、10 和 20 ng/mL 的 AFM1 標準品。精確稱量 0.5 mL

液態(tài)奶樣品加入 10 mL 離心管中，然后加入 2.5 mL 70％ 甲醇水溶液從牛奶樣

品中提取 AFM1。將整個混合物在 Vortex-Genie 上渦旋 5 min，以 10,000 rpm

離心 10 min。收集上清液。將上清液通過 0.22 μm 過濾膜過濾，再使用 N1-自

動氮氣濃縮器將溶液濃縮至 0.5 mL。最后，將濃縮物重新溶解在 2 mL 甲醇水

溶液（5％，v/v）中并儲存在 4℃下。

當牛奶樣品中 AFM1 的濃度在 0~1.0 ng/mL 范圍內時，采用增加牛奶樣品

量的方式對樣品進行預處理。精確稱量 25 mL 樣品，加入濃度為 0.5 ng/mL 的

AFM1 標準品，加熱至約 35~37℃，然后以 4,000 rpm 離心 10 min。通過重力

的作用將 25 mL 的牛奶樣品通過 AFM1 免疫親和柱以促進 AFM1 結合。用 20

mL PBS 以每分鐘約 5 mL 的流速洗滌親和柱。用 1.25 mL 甲醇：乙腈（40 ：

60 v/v）以每秒一滴的流速從柱上洗脫 AFM1。洗脫后，將 1.25 mL 水通過親和

柱并收集在相同的離心管中，總體積為 2.5 mL。將離心管放置于 N1-自動氮氣

濃縮器中，將牛奶樣品濃縮至 1 mL。濃縮后，加入 1.5 mL Tris-HCl 緩沖液溶

解，之后用熒光分光光度計檢測熒光信號強弱。重復 5 次測量每個樣品，以評

估該檢測方法的準確性。

二、研究成果

70

三、結果與討論

1. 設計基于核酸適配體的篩選平臺

圖 1. A 是基于核酸適配體檢測 AFM1 的熒光傳感器設計示意圖。在該傳感

器系統(tǒng)中，AFM1 aptamer 用 FAM 修飾，7-mer cDNA 用 TAMRA 修飾。當溶

液中沒有 AFM1 時，TAMRA-cDNA 靠近 AFM1 aptamer 導致其熒光淬滅，進而

雜交形成 AFM1 aptamer-cDNA 復合物。在加入 AFM1 后，AFM1 誘導適配體

打開空間結構，形成 AFM1/aptamer 復合物。適配體結構的變化導致 cDNA 從

適配體中釋放，使適配體熒光的恢復。由此可見，溶液中 AFM1 的濃度與反應

后熒光變化的強度呈正相關，故可以通過測定熒光變化的強度進而量化 AFM1

的濃度。為了證實 AFM1 可以解離 aptamer-cDNA 復合物并使適配體恢復熒

光，在 Tris-HCl 緩沖液中加入 150 ng/mL AFM1 至 10 nM aptamer 和 20 nM

cDNA 混合液中。圖 1. B 顯示加入 AFM1 后熒光強度增加了至少 11 倍。

圖 1（A）用于基于適配體熒光傳感器用于檢測 AFM1 的示意圖。（B）基

于適配體的傳感系統(tǒng)中熒光發(fā)射光譜：（a）空白組（10mM Tris-HCl 緩沖液，

pH7.0）；（b）AFM1 aptaner 與 cDNA 結合；（c）150 ng/mL AFM1；（d）

AFM1 aptaner。

2. 優(yōu)化 cDNA 序列

在該試驗中，將 10 nM AFM1 aptamer 添加至 20 nM cDNA 1~7 中，用移液

槍輕輕混勻，放至水浴鍋中，88 ℃溫育 5 min，冷卻至室溫 30 min，添加

AFM1 標準液，使反應終濃度為 150 ng/mL。在圖 2. A 中，黑色柱表明當體系

中無 AFM1 時，AFM1 aptamer 與 cDNA 1~cDNA 7 結合后的熒光值，藍色柱表

二、研究成果

71

明加入 AFM1 后的熒光值。表明當體系中無 AFM1 時，cDNA 5~7 可以有效淬

滅 AFM1 aptamer 熒光并降低熒光信號。由于 cDNA 1~4 鏈的長度較短，與

AFM1 雜交后結構不穩(wěn)定，故而產(chǎn)生更高的熒光信號。當 cDNA 5 與 aptamer 雜

交時，加入 AFM1 后可觀察到熒光（F/F0）顯著增加，而較長的 cDNA 序列

（cDNA6 和 cDNA7）也可有效地淬滅熒光（圖 2. B）；這可能是因為 cDNA 5

與 cDNA 6~7 相比，與 aptamer 結合更加緊密，可以促進 aptamer-cDNA 雙鏈體

的形成，同時限制 AFM1 誘導 cDNA-aptamer 結構轉變。因此，本試驗認為

cDNA5 是該反應最優(yōu)的 cDNA 序列。

圖 2 cDNA 序列、濃度和反應穩(wěn)定性的優(yōu)化。（A）通過改變 cDNA 鏈的長

度來優(yōu)化 cDNA（cDNA 1~7）。黑色條帶表示加入 AFM1 前的熒光強度，藍色

條帶表示加入 150 ng/mL AFM1 后的熒光強度。（B）加入 150 ng/mL AFM1 后

熒光增強比（F/F0）。（C）優(yōu)化 aptamer：在 150 ng/mL AFM1 存在下的

cDNA5 濃度比。（D）加入 150 ng/mL AFM1 后反應中熒光強度的穩(wěn)定性。實

驗中數(shù)據(jù)為三個平行實驗的平均值和標準偏差。

二、研究成果

72

3. 優(yōu)化 cDNA5 濃度

為了更好優(yōu)化該傳感器的性能，對 cDNA5 濃度進行優(yōu)化。在該實驗中，將

10 nM AFM1 aptamer 與 cDNA5 分別以 1：1、1：2、1：3、1：4 和 1：5 的摩

爾比進行混合，用移液槍輕輕混勻，添加 AFM1 標準液，使反應終濃度為 150

ng/mL，同時監(jiān)測熒光信號的變化。如圖 2 C 所示，cDNA5 濃度為 20 nM 時達

到最大熒光增強（F/F0）。因此，即使在較高濃度的 cDNA5 中，

cDNA5/aptamer 雙鏈體的形成也產(chǎn)生低背景熒光。當 cDNA 5 濃度高于 20 nM

（AFM1 aptamer 濃度的兩倍）時，會影響 AFM1 與 aptamer 相互結合，進而限

制熒光強度的增加。然而，當 cDNA 5 濃度低于 20 nM 時，熒光背景值過高，

導致熒光強度恢復減慢。因此，優(yōu)化后的傳感器 cDNA 5 的最佳濃度為 20

nM。

4. 驗證反應穩(wěn)定性

為了產(chǎn)生所需的熒光強度，分析了 AFM1 與 aptamer 的反應時間。如圖 2

（D）所示，反應初期 aptamer 和 AFM1 快速結合。當反應時間為 1 min 時，該

傳感器即可檢測出溶液中 AFM1 溶度，并且檢測出的熒光強度可保持 30 min

內不變。因此，該熒光適配體傳感器具可信的穩(wěn)定性。本試驗選擇 15 min 時反

應時間為測定時的最佳時間。

5. 定性檢測 AFM1

基于上述優(yōu)化試驗，使用該傳感器定性檢測不同濃度的 AFM1。如圖 3 A

所示，反應中熒光強度隨 AFM1 濃度增加而增強，并且在 AFM1 濃度為 150

ng/mL 時熒光強度最高。當 AFM1 的濃度在 1~100 ng/mL 范圍內與反應的熒光

強度呈線性關系（圖 3 B），其線性回歸方程為 F = 1.665C + 7.652（R2 =

0.9963），其中 F 表示熒光強度，C 表示 AFM1 濃度。檢測限為 1.0 ng/mL，信

噪比為 3（S/N = 3）。

二、研究成果

73

圖 3（A）適配體傳感器的熒光發(fā)射光譜。（B）熒光強度與 AFM1 濃度之

間的線性關系。

6. 特異性實驗

為了評估該適配體傳感器的特異性，選擇了 7 種與 AFM1（AFB1、

AFB2、AFG1、AFG2、OTA、ZEN 和 FB1）結構相似的霉菌毒素作為對照。在

用于檢測 AFM1 的相同實驗條件下，以相同濃度（40 ng/mL）檢測這些霉菌毒

素。如圖 4 所示，相對于體系中沒有添加霉菌毒素的對照組相比，只有霉菌毒

素和 AFM1（MIX1）以外的所有化合物的混合物都沒有顯著改變熒光（P >

0.05）。包括 AFM1（MIX2）的所有毒素的混合物具有比只有 AFM1 稍弱的效

果，但差異不顯著。這些結果證實該熒光生物傳感器不與 AFM1 以外的霉菌毒

素反應，表明該方法對 AFM1 的檢測具有高度特異性。

7. 牛奶樣品分析

為了進一步驗證適用性和可行性，將試驗中的方法應用于兩種不同品牌的

加標牛奶樣品中 AFM1 的檢測。將四種不同濃度的 AFM1（0.5、5、10 和 20

ng/mL）添加到牛奶樣品中，每種濃度重復檢測 5 次。如表 1 所示，加標牛奶

樣品的回收率范圍在為 93.4~101.3％（n = 5），表明該適配體傳感器可用作真

實牛奶樣品中定量檢測 AFM1。

二、研究成果

74

表 1 加入牛奶樣品中的 AFM1 的測定(n = 5)

添加濃度

(ng/mL)

檢測濃度

(ng/mL)

相對標準偏差(%)

回收率

(%)

0.5 0.47 4.8 93.4

5 5.1 3.6 101.3

10 9.7 2.9 97.5

20 19.4 2.6 97

四、結論

本試驗研究了基于適配體的熒光淬滅檢測方法，可用于直接檢測 AFM1，

并將該方法成功應用于實際牛奶樣品中 AFM1 的檢測。在最佳條件下，AFM1

濃度在 1~100 ng/mL 范圍內，該適配體傳感器的熒光強度隨著 AFM1 濃度增

加呈線性增加，LOD 為 0.5 ng/mL。該試驗為檢測 AFM1 提供了一種新穎、簡

便、快速、特異、方便和經(jīng)濟的方法，并提供了定量測定乳制品中霉菌毒素的

新思路。

研究成果已在《Frontiers in Chemistry》上發(fā)表。喬勤勤、郭曉東和文芳博

士為共同第一作者，王加啟研究員為通訊作者。

——Qinqin Qiao, Xiaodong Guo, Fang Wen, Lu Chen, Qingbiao Xu, Nan Zheng,

Jianbo Cheng, Xiuheng Xue, Jiaqi Wang* . Aptamer-Based Fluorescence Quenching

Approach for Detection of Aflatoxin M1 in Milk. Front Chem. 2021. 9. 653869

二、研究成果

75

黃曲霉毒素 M1 和赭曲霉毒素 A 聯(lián)合誘導小鼠腎損傷機制

黃曲霉毒素 M1（AFM1）和赭曲霉毒素 A（OTA）是環(huán)境中廣泛存在的有

害霉菌毒素。AFM1 和 OTA 共存可能會導致加和或協(xié)同效應，為公眾健康帶來

更大的風險。然而，AFM1 + OTA 誘導的腎毒性及其機制仍有待進一步研究。

本研究采用 3.5 mg/kg b.w. AFM1、OTA 和 AFM1+OTA 處理 CD-1 小鼠 35 天，

采用 LC-MS 代謝組學方法構建小鼠腎臟代謝物圖譜，隨后進行人腎近端小管

（HK-2）細胞實驗，以找出差異代謝物和腎毒性之間的因果關系。

試驗中小鼠總共灌胃 35 天，每周測量一次體重，得到小鼠的體重變化圖

（圖 1A）。由圖可知，五個小組的小鼠平均初始體重沒有顯著差異（p >

0.05）；對小鼠的終體重進行差異顯著性分析，結果如 3.1B 所示。DMSO 處理

組小鼠的最終體重與對照組相比差異不顯著（p > 0.05），而其余三個毒素處理

組（AFM1 組、OTA 組、AFM1+OTA 組）的小鼠終體重與對照組相比差異達

極顯著（p < 0.01）；根據(jù)小鼠終體重，計算出小鼠的腎臟指數(shù)，見圖 1C，由

圖可知 DMSO 組、AFM1 組與對照組相比，小鼠腎臟系數(shù)無顯著差異（p>

0.05），而 OTA 組及 AFM1+OTA 組與對照組相比，小鼠腎臟系數(shù)呈極顯著下

降（p< 0.01）。如圖 1D-F，測定了三個常見的小鼠腎臟損傷血清生化指標：血

尿素氮（BUN）、血清肌酐（SCr）及血尿酸（UA）。與對照組相比，DMSO

組的三種指標均無顯著差異（p> 0.05），而毒素處理組 AFM1 組及

AFM1+OTA 組中 BUN 值，SCr 值及 UA 值均極顯著上調（p < 0.01），OTA 組

中 BUN 值及 SCr 值極顯著上調（p < 0.01），UA 值無顯著差異。這些表型結

果表明，OTA 對腎臟造成顯著的損害，而 AFM1 與 OTA 相比腎毒性作用相似

但有限。

二、研究成果

76

圖 1 單獨及聯(lián)合的 AFM1 和 OTA 對小鼠體重、腎指數(shù)和血清生化參數(shù)的

影響。

H&E 染色和 Masson 染色用于評估單獨和聯(lián)合的 AFM1 和 OTA 對腎臟形

態(tài)和纖維化程度的影響（圖 2）。對照組和 DMSO 組細胞形態(tài)、大小均勻，膠

原纖維增生不明顯，無出血、水腫或其他明顯異常。如黑色箭頭所示，毒素處

理組中某些腎小管上皮細胞輕度水腫變性，細胞腫脹，胞漿疏松深染。此外，

AFM1 組偶爾出現(xiàn)細胞變形、炎性細胞浸潤和輕度膠原纖維增生（藍色區(qū)

域）。OTA 組可見部分細胞變形，局部組織水腫（模糊區(qū)域），出血（紅色點

狀區(qū)域），膠原增生明顯，腎組織輕度纖維化。AFM1 + OTA 組膠原纖維增生

量多于 OTA 組水平，大量藍色區(qū)域彌漫，腎細胞結構紊亂，進入穩(wěn)定的纖維化

期。對小鼠腎組織膠原纖維面積的統(tǒng)計分析表明，與對照組相比，分析表明，

AFM1 +OTA 組的腎組織膠原纖維面積顯著增加（p < 0.05）。

二、研究成果

77

圖 2 單獨及聯(lián)合的 AFM1 和 OTA 對腎臟組織形態(tài)和纖維化程度的影響

首先通過二維主成分（PCA）分析來觀察代謝組學數(shù)據(jù)的樣本方差和組內及

組間的分布。PCA 評分圖顯示各組均無分離樣本，因此后續(xù)分析均未移除樣本

（圖 3A）。使用 OPLS-DA 分析進一步對樣本進行分組和分類。如圖 3B 所示，

與對照組相比，DMSO 處理未顯著改變小鼠腎臟主要代謝物的總體組成，而毒素

單獨或聯(lián)合處理改變了代謝物圖譜(如樣本與對照組和 DMSO 組的距離偏差所

示)。OTA 組和 AFM1 + OTA 組代謝組改變程度更明顯，說明 OTA 對小鼠腎組

織的毒性較 AFM1 強。

圖 3 PCA 分析與 OPLS-DA 分析

UPLC-MS 檢測和數(shù)據(jù)庫參考注釋共鑒定出 115 種代謝物。本研究采用

MetaMapp 軟件建立了包含所有 115 種已鑒定代謝物的完整代謝網(wǎng)絡。通過成

對比較，篩選出差異表達的代謝物（基于單變量分析：student t 檢驗 p < 0.05 且

FC 值>1.5）。圖 4A、B、C 和 G 顯示了毒素處理組和 DMSO 組之間比較的結

二、研究成果

78

果。與 DMSO 組相比，AFM1 處理引起 8 種代謝產(chǎn)物的上調和下調；OTA 處理

引起 26 種代謝產(chǎn)物的上調和 19 種代謝產(chǎn)物的下調；AFM1 + OTA 處理導致 36

種代謝產(chǎn)物上調，21 種代謝產(chǎn)物下調。另一方面，圖 4D、E、F 和 H 繪制了毒

素處理組之間的比較概況。與 AFM1 組相比，OTA 組共有 20 種代謝物發(fā)生顯

著變化，包括 6 種上調代謝物和 14 種下調代謝物；AFM1 + OTA 組中總共有

29 種代謝物發(fā)生顯著變化，包括 18 種上調代謝產(chǎn)物和 11 種下調代謝產(chǎn)物。然

而，與 OTA 組相比，AFM1 + OTA 組中只有 4 種代謝物有明顯變化，包括 2 種

上調代謝產(chǎn)物和 2 種下調代謝產(chǎn)物。這表明，當兩種毒素共存時 OTA 可能是產(chǎn)

生主要毒性作用的毒素。

圖 4 差異代謝網(wǎng)絡分析

如上所述，AFM1 和 OTA 對腎臟代謝組的調節(jié)存在一些顯著差異。因此，

我們應用熱圖分析，以便對樣本和組間的代謝組水平進行直觀比較（圖 5A）。

由于代謝物在熱圖中的表達水平是聚集的，因此很容易看出前兩組（DMSO

組，AFM1 組）的代謝模式明顯不同于其他兩組（OTA 組，AFM1 + OTA

組）。如圖 5A 所示，共篩選出 30 種代謝物，符合標準：t 檢驗 p< 0.05 和

VIP >1.0，溶血磷脂酰膽堿（LysoPCs）為顯著上調的主要類型，其中 LysoPC

（16:0）所占比例最高；LysoPC（18:1）、LysoPC（18:2）和 LysoPC（22:6）

為次要成分（圖 5B）。OTA 和 AFM1 + OTA 對 LysoPC 提高的影響比 AFM1

單獨處理更明顯；而 OTA 與 AFM1 + OTA 對 LysoPCs 的影響無統(tǒng)計學差異，

再次說明 OTA 與 AFM1 聯(lián)合處理時可能是優(yōu)勢毒素。

二、研究成果

79

圖 5 小鼠腎組織中差異表達的代謝物

HK-2 細胞 Western blotting 結果顯示，OTA 組和 AFM1 + OTA 組凋亡蛋白

Bax、caspase 3 和 PARP 的表達水平顯著提高，Bcl-2 蛋白表達顯著降低；而

AFM1 處理僅顯著提高 caspase 3 的表達水平（P<0.05）。LysoPC（16:0）而非

LysoPC（18:1）顯著提高了 HK-2 細胞中 caspase 3 和 PARP 的蛋白水平，并降

低了 Bcl-2 的水平（P<0.05）。

二、研究成果

80

結論： 本研究首次評估了 OTA 和 AFM1 聯(lián)合處理導致的腎毒性，我們猜

測，與 AFM1 相比，OTA 對腎臟的毒性更為明顯；LysoPC（16:0）是聯(lián)合毒素

處理引起腎損傷的關鍵代謝產(chǎn)物，可能是敏感而特異的腎毒性生物標志物。未

發(fā)現(xiàn) AFM1 和 OTA 在腎病的發(fā)生或發(fā)展中存在明顯的協(xié)同作用。

圖 7 AFM1 和 OTA 單獨和聯(lián)合處理致小鼠腎損傷的可能機制

二、研究成果

81

研究成果已于 2021 年 6 月發(fā)表在《Toxicology》雜志。該成果由國家自然

科學基金（31972190）、現(xiàn)代農業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系（CALS—36）、農業(yè)科技創(chuàng)新

計劃（ASTIPS IAS12）、中國農業(yè)科學院重大任務（CAAS-ZDXT201900）等

項目資助，王子微、高亞男、黃鑫為文章第一作者，鄭楠為文章通訊作者。

——Ziwei Wang, Yanan Gao, Xin Huang, Shengnan Huang, Xue Yang, Jiaqi

Wang, Nan Zheng. Metabolomics analysis underlay mechanisms in the renal

impairment of mice caused by combination of aflatoxin M1 and ochratoxin A.

Toxicology 2021, 458: 152835.

二、研究成果

82

赭曲霉毒素 A 通過 WNT/Ca2+信號通路誘導腸道緊密連接

蛋白損傷機制

赭曲霉毒素 A（ochratoxin A，OTA）是由某些曲霉菌和青霉屬的真菌菌株

（疣狀芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌、黑曲霉和赭曲霉）產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物。

OTA 是一種廣泛存在的環(huán)境污染物，對人類和動物的健康構成了極大的威脅，

仍然是全球關注的公共衛(wèi)生問題，引起了人們的重視。腸道屏障是抵御外來污

染物的第一道屏障。緊密連接（Tight junction，TJ）附著在腸道上皮細胞以維

持其結構和細胞極性，從而維持上皮細胞的生物學和屏障功能。TJ 蛋白能阻斷

細胞間隙，阻止細菌和毒素進入血液循環(huán)，在維持腸道屏障功能方面具有重要

意義。而霉菌毒素可以通過破壞腸道 TJ 蛋白發(fā)揮毒性作用。本研究的目的是揭

示 OTA 處理 Balb/c 小鼠后，腸道 TJ 蛋白中非編碼（non-coding，nc）RNA 和

mRNA 的表達模式的變化，并找到 OTA 發(fā)揮腸道毒性作用的關鍵靶標，進一

步為 OTA 的風險評估提供更全面的理論依據(jù)。

基于 mRNA 測序，全轉錄組構建了兩種類型的文庫（小 RNA 文庫和核糖

體特異性文庫），可以同時分析四種不同 RNA 的數(shù)據(jù)：長鏈非編碼（lnc）

RNA、環(huán)狀（circ）RNA、微（mi）RNA 和 mRNA。通過 miRNA 和三種 RNA

（lncRNA、circRNA 和 mRNA）的競爭性結合，可以建立競爭性內源 RNA

（competing endogenous RNA，ceRNA）網(wǎng)絡，從而更準確地找到影響生物過程

的關鍵 RNA。近年來，全轉錄組分析逐漸成為研究霉菌毒素毒性作用機制的趨

勢。但迄今為止，仍缺乏相關的體內研究數(shù)據(jù)，且大多集中在全轉錄組的生信

分析上，并未進行體外驗證試驗。本試驗通過體內動物模型和體外細胞模型，

結合全轉錄組學分析來研究 OTA 損傷腸道 TJ 蛋白的機制。Balb/c 小鼠經(jīng) 3

mg/kg b.w. OTA 灌胃 28 天后，取其空腸組織，一方面用于染色觀察、杯狀細胞

計數(shù)、緊密連接蛋白的表達水平的測定；另一方面用于全轉錄組學分析。血液

用于測定與腸道通透性相關蛋白的表達水平。體外經(jīng) 20 μM OTA 處理 48 h 的

二、研究成果

83

Caco-2 細胞用于全轉錄組學的體外驗證，其中未分化的細胞用于 Ca2+水平的測

定，分化的細胞用于測定 TJ 蛋白的表達水平（圖 1）。

圖 1. 解析 OTA 損傷 TJ 蛋白作用機制的實驗流程圖。

從灌胃第 1 天開始，每隔 2 天稱一次小鼠的體重并記錄，如圖 2a 所示，其

體重從灌胃第 7 天開始顯著下降，且小鼠的平均終體重排序為：

CTL>DMSO>OTA。為了更全面地評價 OTA 誘導的腸道屏障毒性，采用 ELISA

法檢測了 DAO、D-lactate 和 I-FABP 等關鍵血液生化指標，OTA 可顯著提高 D乳酸和 I-FABP 含量（p<0.05）（圖 2b）。OTA 組小鼠空腸絨毛高度顯著低于

對照組（p<0.05）（圖 2c, d），絨毛高度與隱窩深度的比值及空腸杯狀細胞數(shù)

顯著低于對照組（p<0.05）（圖 2e, f, g）。

二、研究成果

84

圖 2. OTA（3 mg/kg b.w.）對 Balb/c 小鼠空腸結構的影響。（a）OTA 處理

后 Balb/c 小鼠體重的變化。（b）OTA 處理后對血液生化水平的影響。（c）

OTA 對小鼠空腸組織絨毛形態(tài)的影響。（d-e）OTA 對小腸上皮絨毛高度和隱

窩深度的影響。（f-g）OTA 對小鼠空腸杯狀細胞數(shù)量的影響。不同的字母代表

顯著差異。

基于 FC>1.5 和 FDR<0.05，將篩選得到的差異表達（Differential

expression）mRNA 進行 KEGG 富集分析。如圖 3a 所示，OTA 誘導的

DEmRNAs 主要富集在肌動蛋白細胞骨架的調節(jié)、PI3K-AKT 信號通路、MAPK

信號通路以及 Tight Junction 信號通路。此外，根據(jù) KEGG 富集的結果，選擇了

一些關鍵通路中的關鍵基因進行蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）分析。如圖 3b

所示，PPI 分析篩選出 G1/S-特異性周期蛋白-D1（CCND1）、Wnt 家庭成員 5a

（WNT5a）、卷曲類受體 4（FZD4）、Axin2（AXIN2）、肌動蛋白 γ1

（ACTG1）和小窩蛋白 1（Cav1）等關鍵基因，大部分屬于 Wnt 信號通路。

二、研究成果

85

圖 3. OTA 誘導的 DEmRNA 的分析。（a）DEmRNA 的 KEGG 富集分析。

（b）43 個關鍵基因的 PPI 網(wǎng)絡分析。

根據(jù)關鍵基因的功能預測和靶向性分析，miR-1258-x（靶向 FZD4、

Cav1、CCND1、Rasgrp3、Foxp1）、mmu-miR-1258-3p（靶向 Plau、E2f5、

Hspb1）、mmu-miR-122-5p（靶向 Wnt5a）、miR-205-z（靶向 Cav1、

Ccm2）、mmu-miR-1981-5p（靶向 Wnt5a）、mmu-miR-1943-5p（靶向 Igf2、

Axin2、Pkd1）和 mmu-miR-146b-5p（靶向 Ccl8，Lgr6）可能是與腸屏障功能

相關尤其是 TJ 蛋白的關鍵分子（圖 4a）。

在對 DElncRNA 的靶向 DEmRNAs 進行功能預測后，如圖 4b 所示，

DElncRNAs Zeb1、Stk36、Phkb、Prss23、Inpp5e 和 Gm28588 與腸道 TJ 蛋白緊

密相關。

二、研究成果

86

圖 4. 關鍵差異表達 RNA 兩兩互作分析。（a）DEmiRNA-DEmRNA 互作

網(wǎng)絡，（b）DEncRNA-DEmRNA 互作網(wǎng)絡。

基于關鍵 miRNA-mRNA 和 lncRNA-mRNA 靶向關系對，ceRNA 分析進一

步解析 ncRNAs 和 mRNAs 在腸道 TJ 蛋白中的作用。圖 5a 揭示了與 TJ 蛋白相

關的 DEmRNA 和 DEncRNA 之間的關系。對關鍵 DEmRNAs 的分析表明，

WNT/Ca2+信號級聯(lián)在 OTA 誘導的 TJ 蛋白損傷中起關鍵作用，且 KEGG 分析表

明 FZD4、WNT5a 和 Cav1 參與調節(jié) Ca2+水平。通過 ceRNA 分析，發(fā)現(xiàn)了參與

鈣信號調節(jié)的上游靶標 DEmiRNAs 和 DElncRNAs。結果顯示 lncRNA Zeb1 通

過靶向 miR-1258-x 調節(jié) FZD4 與 WNT5a 結合的表達，從而激活 Ca2+信號級

聯(lián)。此外，Cav1 和幾種 lncRNAs 與 miR-205-z 競爭性結合以調節(jié) Ca2+的釋放。

為了確定 Ca2+對 TJ 蛋白表達的影響，我們采用體外 Caco-2 細胞模型進行

進一步驗證。結果表明，OTA 顯著增加了 Ca2+的水平（圖 5b），并且降低了

TJ 蛋白的表達水平。當加入 Ca2+抑制劑 BAPTA-AM 時，TJ 蛋白的表達水平顯

著高于單獨使用 OTA 的表達水平（圖 5c,d）。以上結果表明 Ca2+水平的增加降

低了 TJ 蛋白的表達水平。

二、研究成果

87

圖 5. OTA 損傷腸道 TJ 靶標的篩選。（a）OTA 損傷 Balb/c 小鼠 TJ 蛋白的

lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA 網(wǎng)絡。橢圓代表 mRNA，V 形代表 miRNA，菱

形代表 lncRNA。（b）OTA 處理后 Ca2+水平的變化。（c，d）OTA 和 BAPTAAM 對 claudin-4/ocludin 表達的影響。不同字母表示顯著差異。BA 代表

BAPTA-AM。

結論：基于體內全轉錄組分析結合體外細胞驗證表明，OTA 通過

WNT/Ca2+信號通路損傷緊密連接蛋白，存在的上游機制為：（i）lncRNA-Zeb1

通過靶向 miR-1258-x 調節(jié) FZD4 與 WNT5a 結合釋放 Ca2+；（ii）miRNA-1258-

x 調節(jié) Cav1 的表達，控制細胞外 Ca2+進入。該研究成果為解析 OTA 的腸道毒

性機制，挖掘毒性作用靶標提供了重要指導。

摘要圖 OTA 損傷 TJ 蛋白的作用機制

二、研究成果

88

研究成果已于 2021 年 9 月發(fā)表在《Ecotoxicology and Environmental

Safety》雜志。該研究得到國家自然科學基金、中國現(xiàn)代農業(yè)產(chǎn)業(yè)技術研究體

系、農業(yè)科技創(chuàng)新重大成果科研項目和農業(yè)科技創(chuàng)新計劃項目資助。楊雪、高

亞男為文章第一作者，通訊作者為鄭楠。

——Xue Yang, Yanan Gao, Shengnan Huang, Chuanyou Su, Jiaqi Wang, Nan

Zheng. Whole transcriptome-based ceRNA network analysis revealed ochratoxin Ainduced compromised intestinal tight junction proteins through WNT/Ca2+ signaling

pathway. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2021, 224: 112637.

二、研究成果

89

黃曲霉毒素 B1 和 M1 通過內吞作用誘導腸道完整性損傷的

機制

一 、研究背景

霉菌毒素黃曲霉毒素 B1（AFB1）廣泛存在于農作物中，是由包括黃曲霉

和寄生曲霉等霉菌產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物，黃曲霉毒素 M1（AFM1）是牛奶

中唯一具有最大限量的霉菌毒素。在黃曲霉毒素的幾種亞型中，AFB1 的毒性

最強，因此 AFB1 被世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構（IARC）認定為 1 級致癌

物。同時，IARC 在 2002 年，將 AFM1 對人類致癌物等級從 2 級升為 1 級。

結構完整的腸上皮具有許多關鍵功能，保證動物和人類的福利和健康。腸

上皮不僅可促進從腸腔吸收營養(yǎng)物質，而且可作為抵御外部污染物的第一道屏

障，防止各種有毒化合物進入人體。腸道屏障的破壞可能會導致炎癥反應的激

活，從而威脅人類健康。相鄰細胞間的緊密連接 (TJ) 蛋白是腸道屏障的主要功

能成分。已經(jīng)有研究報道證明，TJ 蛋白可以通過內吞作用被內化，隨后在體內

被降解。

本研究的目的是利用體內和體外模型，評估 AFB1 和 AFM1 對腸屏障影響

的聯(lián)合毒性及其機制。體內 ICR 小鼠的血清生化指標和腸道組織檢測的結果表

明，AFB1 和 AFM1 可影響與腸道屏障完整性相關的血清生化指標、損傷腸道

組織形態(tài)和 TJ 蛋白的分布。分化 Caco-2 細胞的體外實驗分析了 AFB1 和

AFM1 對腸道屏障功能表型和機制的影響。本研究中的體內和體外結果首次表

明 AFB1 和 AFM1 聯(lián)合作用可導致腸道屏障受損，并且受損機制與網(wǎng)格蛋白介

導的內吞作用相關。此外，我們的結果表明， AFB1 和 AFM1 損傷腸屏障功能

主要為協(xié)同作用。

二、實驗方法

1. 試驗動物

二、研究成果

90

本實驗所用 40 只 ICR 小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司

（Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.），雄性，健康且精

神狀態(tài)良好，清潔級別為 SPF 級別，均為 4 周齡左右，體重均在 20±2g 范圍

內。7 天適應期后，40 只小鼠隨機分為 4 組，即對照組（1% DMSO）、AFB1

單獨處理組（0.3 mg/kg b.w.）、AFM1 單獨處理組（3.0 mg/kg b.w.）和混合毒

素 AFB1+ AFM1 處理組（0.3 mg/kg b.w.+ 3.0 mg/kg b.w.）。處理組的小鼠每天

灌胃一次（0.2ml/只小鼠），持續(xù)四周，并一周 2 次稱重。第 29 天，用二氧化

碳對小鼠實施安樂死。

采集到的小鼠腸道組織固定在 10%福爾馬林緩沖液中，用于隨后的組織學

評估和免疫組織染色。并從小鼠眼眶取血。所有動物程序均按照中國動物實驗

指南進行，符合國際公認的實驗動物使用原則。動物實驗得到了中國農業(yè)科學

院北京畜牧獸醫(yī)研究所倫理委員會的批準（Beijing, China, IAS 2019-3）。

2. 細胞培養(yǎng)與處理

20-35 代 Caco-2 細胞應用在本研究中，Caco-2 細胞生長在 5%CO2，95%濕

度，37℃的培養(yǎng)環(huán)境下。培養(yǎng)基為 DMEM，其中包含 10%胎牛血清、4.5g/l L谷氨酰胺，雙抗（100 units/ml 青霉素和 100 μg/ml 鏈霉素）以及 1%的非必需氨

基酸。培養(yǎng) 3 天后，細胞匯合度達到 80%，將細胞用胰酶消化下來，并且以

40,000 細胞/cm2 的密度種到 Transwell 培養(yǎng)板中。連續(xù)培養(yǎng) 21 天，每兩天換液

一次，期間用 Millicell-ERS 電阻儀測定細胞間的跨膜電阻(TEER)值，當 TEER

值達到 300 ?.cm2 時，即可證明 Caco-2 細胞分化完成。AFB1 和 AFM1 被添加

到 Transwell 板的上室中孵育 48 h。

3. 血液生化指標檢測

采集的血樣在 37℃下凝固 1-2 h（不含抗凝劑），然后在 4℃下，以 4000

轉/分的速度放置在離心機離心 10 分鐘，以獲得上清液（血清）。通過

HITACHI 7080 全自動生化分析儀和酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）測定與腸屏障

功能相關的血清生化參數(shù)，包括 Cit、DAO、I-FABP 和 D-乳酸。

4. 小鼠回腸的組織形態(tài)學評估

二、研究成果

91

迅速利用預冷的 PBS 沖洗解剖得到的回腸內容物，放入 10%福爾馬林溶液

中固定 24 h 以上，沖洗后包埋，利用切片機切蠟帶，制作腸道組織石蠟切片。

將石蠟切片置于二甲苯中 10 min，脫蠟完成后，將切片依次置于不同濃度酒精

中，最后放入蒸餾水中。隨后置于蘇木精中 10 min，移入水中洗去殘液，置于

1%鹽酸酒精中分化 3-30 秒，再移入水中洗滌 30 min。再置于伊紅染液中 2-5

min，入水洗去染液。置于 80%酒精中脫水 5 min，再入 90%酒精中脫水 5

min，移入二甲苯中透明后，最后用中性樹膠固片，晾干后即可。每組取 6 只小

鼠的回腸組織，每個區(qū)段取 3 個不同位置制作切片，在顯微鏡下觀察 HE 染色

后的小腸絨毛形態(tài)，并在每張切片上選取 5 根絨毛，測定絨毛長度和隱窩深

度，計算兩者的比值。

5. 細胞毒性的測定

CCK-8 實驗用來測定在不同組合霉菌毒素的處理下細胞存活率。在處理之

前，以 6×104 細胞/ml 的密度接種在 96 孔培養(yǎng)板中貼壁培養(yǎng) 24 h。接著，加入

不同濃度及組合的霉菌毒素處理細胞，AFB1 和 AFM1 (0.5, 1, 2, 4 和 8 μg/ml)。

48 h 后，移除包含著霉菌毒素的培養(yǎng)基，再加入 100 μl CCK-8 試劑，在培養(yǎng)箱

中孵育 2 h。最后，將 96 孔培養(yǎng)板放入酶標儀中，在 450nm 處測定吸光度。

6. TEER 值測定

TEER 值是測定細胞間完整性最方便的方法。在培養(yǎng)分化 Caco-2 細胞的

Transwell 板的上室和小室中分別加入單獨和混合的 AFB1 和 AFM1 (0.5, 1, 2, 4

和 8 μg/ml)，處理 48 h 后，測定 TEER 值。

7. 免疫熒光染色

利用激光共聚焦顯微鏡觀察緊密連接蛋白的定位。單獨及混合 AFB1 和

AFM1 處理分化 Caco-2 細胞 48 h。處理后，細胞用 4%多聚甲醛固定 10 min，

隨后用 0.1%Triton X-100 做透化處理 5 min。細胞用封閉液封閉 1.5 h，然后孵

育 claudin-3、claudin-4、ZO-1、occludin 一抗 1.5 h，隨后細胞用熒光二抗避光

室溫孵育 45 min。細胞利用 LSM780 激光共聚焦顯微鏡進行觀察。

8. 緊密連接蛋白水平的測定

二、研究成果

92

PCR 和 Western blot 試驗分別用來測定緊密連接蛋白的 mRNA 和蛋白水

平。分化 Caco-2 細胞被裂解后，用上樣緩沖液混合均勻，電泳。PVDF 膜利用

5%脫脂牛奶室溫下封閉 1.5 h。接下來，claudin-3、claudin-4、ZO-1、

occludin、β-actin 一抗室溫孵育 3 h。相對應的二抗室溫孵育 1 h。灰度值利用

ImageJ 軟件分析。

三、結果與討論

圖 1 展示的是小鼠暴露于單獨及混合的 AFB1 和 AFM1 對腸道屏障相關的

血液指標的影響。如圖所示，AFM1 單獨灌胃組及 AFB1 單獨灌胃組小鼠血液

中瓜氨酸（Cit）含量與對照組相比差異不顯著（p > 0.05）；AFB1 與 AFM1

聯(lián)合灌胃組小鼠血液中瓜氨酸（Cit）含量顯著低于對照組及單獨灌胃組（p <

0.05）。AFM1 單獨灌胃組小鼠血液中 DAO 活性顯著高于對照組（p <

0.05），AFB1 單獨灌胃及其與 AFM1 聯(lián)合灌胃組小鼠血液中瓜氨酸含量顯著

高 AFM1 單獨灌胃組（p < 0.05）。AFM1 單獨灌胃組及 AFB1 與 AFM1 聯(lián)合

灌胃組小鼠血液中腸型脂肪酸結合蛋白（I-FABP）含量顯著高于對照組（p <

0.05），且 AFB1 與 AFM1 聯(lián)合灌胃組顯著高于 AFM1 單獨灌胃組（p <

0.05）；各處理組小鼠血液中 D-乳酸(D-lactate)含量均顯著高于對照組（p <

0.05），AFB1 與 AFM1 聯(lián)合灌胃組小鼠血液中 D-乳酸含量顯著高于單獨灌胃

組（p <0.05）。

二、研究成果

93

圖 1. AFB1 和 AFM1 誘導小鼠腸道屏障相關血液指標的變化

如圖 2 所示，灌胃結束時，三個處理組小鼠回腸絨毛長度值均顯著低于對

照組（p < 0.05），且 AFB1 與 AFM1 聯(lián)合灌胃組顯著低于兩個毒素單獨灌胃組

（p < 0.05）；各處理組小鼠回腸絨毛隱窩深度值均顯著高于對照組（p <

0.05），但三個處理組間差異不顯著（p > 0.05）；三個處理組小鼠回腸絨毛長

度與隱窩深度的比值均顯著低于對照組（p < 0.05），且 AFB1 與 AFM1 聯(lián)合

灌胃組顯著低于兩毒素單獨灌胃組（p < 0.05），兩毒素單獨灌胃組間差異不顯

著（p > 0.05）。

圖2. AFB1和AFM1誘導小鼠回腸形態(tài)結構的變化

二、研究成果

94

如圖 3 所示，與對照組相比，低濃度（0.5 μg/mL）的 AFB1 和 AFM1 即使

以混合方式處理，也不會顯著降低 TJ 蛋白轉錄水平（p＞0.05）。與單獨毒素

處理相比，混合 AFB1 和 AFM1 在 0.5 μg/mL 濃度下導致 TJ 蛋白 mRNA 表達更

嚴重的下調。4 μg/mL AFB1 導致 TJs mRNA 表達顯著降低（p<0.05），而 4

μg/mL AFM1 中未發(fā)現(xiàn)這種影響。然而，盡管 AFB1 和 AFB1+AFM1 聯(lián)合處理

組之間沒有顯著差異（p＞0.05），但 4 μg/mL AFM1 有加劇 AFB1 誘導的 TJ 蛋

白破壞的趨勢。

如圖 4 所示，4 μg/mL AFB1 及混合毒素可導致乳酸脫氫酶含量顯著升高

（圖 4A），對細胞造成損傷。但加入網(wǎng)格蛋白抑制劑（氯丙嗪，CP），AFB1

和 AFM1 誘導的細胞跨膜電阻（TEER）值的增加得到抑制（圖 4B），同時緊

密連接蛋白的內化作用得到緩解（圖 4C）。結果表明，AFB1 和 AFM1 可通過

網(wǎng)格蛋白介導的內吞作用誘導腸道完整性受損。

二、研究成果

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圖3. AFB1與AFM1對分化Caco-2細胞緊密連接蛋白表達與定位的影響

圖4. AFB1與AFM1誘導分化Caco-2細胞緊密連接蛋白內化