二、研究成果

46

Propionate 19.70±1.7b 20.38±1.32ab 21.88±2.13a 0.028

Isobutyrate 1.81±0.23c 3.05±0.30b 3.71±0.26a <0.001

Butyrate 13.82±1.33c 17.30±1.13b 20.53±1.04a <0.001

Isovalerate 2.88±0.30c 3.64±0.42b 4.73±0.44a <0.001

Valerate 1.54±0.17c 2.10±0.14b 2.38±0.11a <0.001

Acetate: propionate ratio 3.08±0.31a 2.39±0.19b 2.40±0.32b <0.001

3.3、對(duì)瘤胃微生物組成的影響

日糧中提高完整和粉碎亞麻籽能夠影響瘤胃菌群的組成，瘤胃菌群組成如

圖 1 所示。在門水平上，如圖 1A 所示，與 CK 組相比，WF 與 GF 組中

Bacteroidetes 的豐度顯著下降，其中 GF 組豐度最低（CK：64.77%, WF：

56.53%, GF：42.84%）。而與 CK 組相比，WF 與 GF 組中 Firmicutes 的豐度顯

著升高，其中 GF 組豐度最高（CK：26.69%; WF：37.28%; GF：47.31%）。日

糧中添加粉碎亞麻籽能夠改變瘤胃中主導(dǎo)的菌，由 Bacteroidetes 轉(zhuǎn)化為

Firmicutes。在屬水平上，如圖 1B 所示，日糧添加亞麻籽能夠降低

Succiniclasticum （P = 0.005）、Prevotellaceae_UCG-001（P < 0.001）、

Treponema_2（P < 0.001）和 Fibrobacter（P < 0.001）的豐度，變化趨勢(shì)呈 CK

＞W(wǎng)F＞GF；然而能夠提高 Ruminococcaceae_NK4A214_group（P < 0.001）、

Christensenellaceae_R-7_group（P = 0.001）、

Eubacterium_coprostanoligenes_group（P = 0.005）、 Candidatus_saccharimonas

（P = 0.002）的豐度，變化趨勢(shì)呈 CK＜WF＜GF。

Ruminococcaceae_NK4A214_group 是已知的具有生物氫化的菌，本試驗(yàn)也有同

樣發(fā)現(xiàn)，除了 Ruminococcaceae_NK4A214_group，Christensenellaceae_R7_group 和 Eubacterium_coprostanoligenes 也可能是潛在的生物氫化菌。同時(shí)也

有可能是由各具有生物氫化功能的菌的互相協(xié)作發(fā)揮生物氫化功能。

二、研究成果

47

圖 1（A）門水平上細(xì)菌群落的相對(duì)豐度（僅列出前 10 個(gè)豐度門）。（B）

屬級(jí)細(xì)菌群落的相對(duì)豐度（僅列出前 10 個(gè)豐度屬）。

使用 PCoA 對(duì)三組的 OTU 進(jìn)行分析，結(jié)果如圖 2A 所示，PCo1=29.98%

PCo2=15.28%，其中 CK 與 GF 組能夠很好的區(qū)分，CK 組樣本全部位于 PCo1

負(fù)值一側(cè)，而 GF 組樣本主要位于 PCo1 正值一側(cè)。而 WF 組與 CK 組和 GF 組

均不能區(qū)分。使用 ANOSIM 檢驗(yàn)同樣也發(fā)現(xiàn)三組差異極顯著（R = 0.598; P =

0.001），CK 與 GF 組在 PCoA 圖上確實(shí)能夠很好的區(qū)分。

圖 2（A） 瘤胃細(xì)菌樣品的主成分分析；（B） 三組細(xì)菌屬的相似性。

二、研究成果

48

4、結(jié)論：

不同形式亞麻籽中 ALA 的釋放是不同的，完整亞麻籽中 ALA 釋放時(shí)間比

粉碎亞麻籽時(shí)間長(zhǎng)，這樣會(huì)導(dǎo)致瘤胃中 ALA、EPA 與 n-3 UPFA 的含量保持在

較高的水平，但是瘤胃中 VFA 主要與瘤胃中 ALA 的釋放量有關(guān)。每天奶牛攝

入 1500g 粉碎亞麻籽能夠在門水平上改變瘤胃主導(dǎo)菌群。在屬水平上，

Ruminococcaceae_NK4A214_group 是已知的具有生物氫化的菌，本試驗(yàn)也有同

樣發(fā)現(xiàn)，除了 Ruminococcaceae_NK4A214_group、Christensenellaceae_R7_group、Eubacterium_coprostanoligenes 也可能是潛在的生物氫化菌。

研究成果已于 2021 年 11 月發(fā)表在《Frontiers in Microbiology》雜志。該成

果由國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程重大產(chǎn)出科研選

題、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金資助，第

一作者為黃國(guó)欣，通訊作者為王加啟，張養(yǎng)東。

——Guoxin Huang, Liya Guo, Xiaofeng Chang, Kaizhen Liu, Wenhao Tang, Nan

Zheng, Shengguo Zhao, Yangdong Zhang and Jiaqi Wang. Effect of Whole or Ground

Flaxseed Supplementation on Fatty Acid Profile, Fermentation, and Bacterial

Composition in Rumen of Dairy Cows. Frontiers in Microbiology 2021, 12:760528.

二、研究成果

49

糖蜜對(duì)苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)、微生物及口感的影響

一、研究背景

苜蓿因其良好的適口性和較高的蛋白質(zhì)含量被認(rèn)為是一種有前景的反

芻動(dòng)物優(yōu)質(zhì)飼料，但在潮濕和多雨的氣候條件下，容易因需氧變質(zhì)而造成

營(yíng)養(yǎng)損失，需要有效的保存方法。青貯是降低苜蓿營(yíng)養(yǎng)損失、提高采食

量、獲得長(zhǎng)期保存的可行方法，在厭氧條件下通過(guò)自發(fā)乳酸(LA)發(fā)酵。隨

著乳酸菌(LAB)的快速增殖，原料中的碳水化合物轉(zhuǎn)化為以 LA 為主的有機(jī)

酸，導(dǎo)致 pH 迅速降低，抑制有害微生物的生長(zhǎng)，最終獲得了飼料保存的

穩(wěn)定條件。在青貯過(guò)程中，足夠的可發(fā)酵碳水化合物作為前期可發(fā)酵的底

物對(duì) LA 的生產(chǎn)至關(guān)重要，降低了 pH 值，提高了青貯品質(zhì)。然而，由于苜

蓿可發(fā)酵碳水化合物含量不足，且其緩沖能力(BC)較大，單獨(dú)使用苜蓿難

以獲得具有競(jìng)爭(zhēng)力的發(fā)酵品質(zhì)飼料。

前期研究表明，用玉米、甜高粱等高糖飼料作為青貯苜蓿可顯著提高

苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)。另一種策略是添加廉價(jià)的外源糖添加劑，如糖蜜，它

已被廣泛用于加速發(fā)酵和提高苜蓿青貯的質(zhì)量。糖蜜添加不僅為 LA 的快

速積累和 pH 值的急劇降低提供了充足的底物，而且增加了微生物蛋白的

合成，提高了營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。前期研究表明，糖蜜添加改善了苜?；旌锨噘A發(fā)

酵品質(zhì)，添加 2.5%糖蜜比添加 5.0%糖蜜更適合實(shí)際應(yīng)用。相反，其他研

究發(fā)現(xiàn)糖蜜添加增加了苜蓿青貯的有氧穩(wěn)定性，但對(duì)發(fā)酵品質(zhì)沒(méi)有影響。

因此，對(duì)糖蜜添加苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)的研究還不夠充分，存在爭(zhēng)議。

此外，青貯飼料的口感在青貯后會(huì)發(fā)生變化，往往會(huì)提高適口性，但

有關(guān)苜蓿青貯飼料口感的資料很少。電子舌感應(yīng)系統(tǒng)(e-tongue)是一種客觀

的味覺(jué)評(píng)價(jià)方法，它能提供更接近人類感官評(píng)價(jià)的味覺(jué)結(jié)果。電子舌的工

作原理是，味覺(jué)物質(zhì)與傳感器膜相互作用時(shí)，測(cè)量傳感器外膜邊界與參比

電極之間的電極電位，并通過(guò)模式識(shí)別方法將電位變化轉(zhuǎn)化為味覺(jué)信息，

對(duì)基本的味覺(jué)進(jìn)行分類和識(shí)別，如酸味、咸味、苦味和鮮味。雖然電子舌

二、研究成果

50

已廣泛用于食品和飲料、制藥工業(yè)以及環(huán)境和發(fā)酵監(jiān)測(cè)，但尚未擴(kuò)展到飼

料加工行業(yè)。

本研究的目的是研究添加糖蜜后苜蓿青貯的發(fā)酵品質(zhì)，并為實(shí)際應(yīng)用

實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期保存，包括化學(xué)成分、發(fā)酵特性和微生物群落。電子舌首次用于

飼料加工，用于評(píng)價(jià)苜蓿青貯飼料的味道。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1、苜蓿的收獲和青貯的準(zhǔn)備

在天津夢(mèng)得奶牛場(chǎng)種植的苜蓿，于第五茬次(294.90 g kg -1 干物質(zhì)

(DM))時(shí)收割。新鮮的苜蓿用鐮刀在離地約 8～10 厘米處手工切下，然后

用切紙機(jī)切成 2～3 厘米。從當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)獲得糖蜜(錘度為 87%)，作為苜蓿青

貯的添加劑。將切碎的苜蓿混合，分成等量處理：新鮮苜蓿在未添加糖蜜

(對(duì)照)、添加 1%糖蜜(M1)、添加 2%糖蜜(M2)和添加 3%糖蜜(M3)條件下

青貯發(fā)酵 206 天。每個(gè)處理的飼料混合料 3.3 kg 裝入 4.9 L 聚乙烯發(fā)酵罐

中，用螺旋蓋和塑料帶密封，室溫(21～25℃)保存。每個(gè)處理包含 6 個(gè)發(fā)

酵罐。

2、發(fā)酵特性

首先，用 20 克的新鮮苜蓿青貯和 130 mL 超純水混合均勻放入 4°C 攪

拌機(jī)里搖 24 小時(shí)，然后用 4 層的無(wú)菌粗紗布過(guò)濾到燒杯里，再用定量濾紙

過(guò)濾到三角瓶中，留著測(cè)定發(fā)酵特性。

用玻璃電極 pH 計(jì)，采用伏安法立即測(cè)定濾液的 pH 值。LA 的測(cè)定采

用 Waters Acquity UPLC 系統(tǒng)，配備 Waters 2489 紫外/可見(jiàn)檢測(cè)器和 HSS

T3 色譜柱(2.1×100 mm，1.8 μm)。分析條件如下：烘箱溫度 35℃；流動(dòng)相

A, 0.1%磷酸；流動(dòng)相 B，甲醇；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量，5μL。乙酸

(AA)、丙酸(PA)和丁酸(BA)的測(cè)定采用美國(guó) Agilent 7890A 氣相色譜系

統(tǒng)，F(xiàn)ID 檢測(cè)器，F(xiàn)FAP 色譜柱(15m×0.32mm×0.25μm)。分析條件如下：入

口溫度為 250°C；載氣壓力為 He 19.991 kPa；進(jìn)樣量為 2μL。

二、研究成果

51

3、化學(xué)成分

用苯酚-次氯酸鈉法測(cè)定濾液中 NH3-N 含量。新鮮的苜蓿和青貯樣品

在 65°C 的烘箱中干燥 48h，計(jì)算干物質(zhì)（DM）；然后，樣品通過(guò)粉碎機(jī)

粉碎后過(guò) 1mm 篩，用于化學(xué)成分分析。

粗蛋白(CP)測(cè)定采用凱氏定氮法，按 AOAC 標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行；中性洗滌

纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)的測(cè)定采用纖維分析儀；水溶性碳水化合

物(WSC)含量采用蒽酮比色法測(cè)定。

4、DNA 提取

使用 HiPure Stool DNA 試劑盒從每個(gè)青貯樣品中提取微生物 DNA。取

10 g 樣品與 90 mL 無(wú)菌生理鹽水混合，用紗布過(guò)濾，離心。

5、PCR 擴(kuò)增及 16S rRNA 測(cè)序

采用通用引物 799F (CCTAYGGGRBGCA)和 1193R

(ACGTCATCCCCACCTTCC)擴(kuò)增 16S rRNA 的 V5-V7 區(qū)。用 KOD 聚合酶

在 94°C (2 min)下進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，然后在 98°C (10 s)、62°C (30 s)、68°C

(30 s)下進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)，最后在 68°C 下延伸 5 min。

6、口感的測(cè)定

采用電子舌傳感系統(tǒng)(INSENT SA402B，日本)測(cè)定青貯濾液的味道。

首先，以 30 mM KCl 和 0.3 mM 酒石酸為參比溶液，通過(guò)傳感器 AAE、

CT0、CA0、C00 和 AE1 的輸出分別評(píng)價(jià)鮮味、咸味、酸味、苦味和澀

味。傳感器輸出通過(guò)工作站平臺(tái)上的程序轉(zhuǎn)換為“味道信息”，其中“1 單

位”定義為一個(gè)人能區(qū)分的最小差異。

7、統(tǒng)計(jì)分析

本研究采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)。所有化學(xué)成分和發(fā)酵參數(shù)的數(shù)據(jù)均采用單

因素方差分析(ANOVA)，使用 SPSS 統(tǒng)計(jì) v. 26.0 (IBM, Armonk, NY, USA)

進(jìn)行分析。P < 0.05 和 P < 0.01 分別表示差異顯著和差異極顯著。統(tǒng)計(jì)模

型如下:

二、研究成果

52

Yij = μ + Ti + Eij

其中，Yij 為觀測(cè)的因變量，μ 為總體均值，Ti 為處理效果，Eij 為誤

差。

三、結(jié)果與討論

1、苜蓿青貯的化學(xué)成分

由表 1 可知，糖蜜添加對(duì)苜蓿青貯飼料 DM、WSC、NDF 和 ADF 含

量有顯著影響(P < 0.05)，但對(duì)粗蛋白質(zhì)含量無(wú)影響。隨著糖蜜添加量的增

加，苜蓿青貯 DM 含量略有增加，M2 組和 M3 組分別比對(duì)照組高 10%和

5.4%。與此同時(shí)，WSC 含量在青貯后下降，并穩(wěn)定在 30 g/kg DM 左右。

NDF 含量在青貯后下降，維持在 68.27～76.94%。青貯后 ADF 含量保持穩(wěn)

定，保持在 91.71～101.10%。CP 含量各處理間無(wú)顯著差異，與青貯前基

本一致。結(jié)果表明，苜蓿青貯的 WSC 大部分被消耗，部分 NDF 在青貯過(guò)

程中被分解，DM、CP、ADF 含量保持相對(duì)穩(wěn)定。各處理中，M3 組 DM

和 CP 含量最高，NDF 含量最低。

表 1 苜蓿青貯的化學(xué)組成(n = 6)

Items

Treatment p Value

Control M1 M2 M3

DM (g/kg

FM)

297.03±1.74c 295.94±0.49c 306.77±0.73b 312.88±0.75a 0.048

CP (g/kg DM) 245.75±0.58 247.05±0.32 242.04±0.72 250.90±0.69 0.149

WSC (g/kg

DM)

31.71±0.82b 28.52±0.63b 37.19±0.86a 32.19±0.73b <0.001

NDF (g/kg

DM)

281.99±0.99a 275.30±1.46a 290.21±2.27a 257.50±1.18b 0.013

二、研究成果

53

ADF (g/kg

DM)

210.06±0.52a 204.72±1.04a 207.28±0.75a 190.55±0.90b 0.004

2、苜蓿青貯發(fā)酵特性

由表 2 可知，糖蜜添加對(duì)紫花苜蓿青貯的 pH 值、LA、AA、PA、

NH3-N 含量和 LA/AA 含量有顯著影響(P < 0.05)，但對(duì) BA 含量無(wú)顯著影

響。

鮮苜蓿的 pH 值為 5.91，青貯后降低，隨著糖蜜添加，pH 從 5.16 顯著

降低到 4.48。與對(duì)照組相比，M1、M2、M3 組 LA 含量分別顯著提高了

19.82%、21.40%、44.17%，AA 含量分別顯著降低了 2.97%、25.35%和

32.44%。LA/AA 相應(yīng)從 3.30 增加到 6.84。隨著糖蜜添加量的增加，M1、

M2 和 M3 組的 PA 含量分別顯著降低了 24.78%、67.83%和 70.43%。BA 含

量較低，分別降低了 30.30%、51.52%和 87.88%，NH3-N 含量也顯著降低

了 24.91%、47.03%和 48.25%。

結(jié)果表明，青貯過(guò)程中 pH 值快速下降。在所有處理中，M3 組 pH 值

和 AA、PA、BA 和 NH3-N 含量最低，LA 含量和 LA/AA 最高。

表 2 苜蓿青貯發(fā)酵特性(n = 6)

Items

Treatment p Value

Control M1 M2 M3

pH 5.16±0.20a 4.84±0.09b 4.63±0.06c 4.48±0.02d <0.001

LA (g/kg

DM)

67.21±13.69c 80.53±10.87b 81.59±7.64b 96.90±8.78a <0.001

AA (g/kg

DM)

21.18±4.49a 20.55±4.23a 15.81±2.25b 14.31±1.42b 0.006

二、研究成果

54

PA (g/kg

DM)

2.30±0.73a 1.73±1.06a 0.74±0.35b 0.68±0.26b <0.001

BA (g/kg

DM)

0.66±0.60 0.46±0.47 0.32±0.23 0.08±0.09 0.132

LA/AA 3.30±0.88c 3.97±0.36bc 5.21±0.85b 6.84±1.05a <0.001

NH3-N (g/kg

TN)

100.86±27.90a 75.74±4.60b 53.43±4.69c 52.20±3.73c <0.001

3、苜蓿青貯的口感

如圖 1a 所示，雷達(dá)圖顯示的是味覺(jué)信息，一個(gè)單位對(duì)應(yīng)人可以分辨的

最小味覺(jué)差異。所有苜蓿青貯樣品均具有較強(qiáng)的苦味、澀味和酸味，反映

了苜蓿青貯的味道。隨著糖蜜添加量的增加，酸味增加，鮮味減少，苦

味、澀味和咸味保持不變。同時(shí)，對(duì)不同口味進(jìn)行主坐標(biāo)分析。如圖 1b 所

示，M3 組與對(duì)照組的口味有明顯的區(qū)別。

圖 1 苜蓿青貯飼料的口感分析(n=6)。(a)雷達(dá)圖。(b)主坐標(biāo)分析。

4、苜蓿青貯微生物群落研究

采用 PCR 擴(kuò)增和 16S rRNA 測(cè)序技術(shù)，描述了苜蓿青貯微生物群落，

從圖 2 可以看出，青貯 206 天后的苜蓿青貯優(yōu)勢(shì)屬為腸球菌(Enterococcus)

二、研究成果

55

和乳酸菌(Lactobacillus)，同時(shí)存在少量的泛菌(Pantoea)、腸桿菌

(Enterobacter)和魏斯氏菌屬(Weissella)等。隨著糖蜜添加量的增加，優(yōu)勢(shì)

菌屬腸球菌和乳酸菌的百分比逐漸增加并趨于穩(wěn)定，對(duì)照組含量為

88.63%，M1 組含量為 81.33%，M2 組含量為 93.20%，M3 組含量為

93.86%。在較低的 pH 條件下，不良微生物受到抑制，因此丙酸(PA)、丁

酸(BA)和氨氮(NH3-N)含量降低。

圖 2 16S rRNA 序列測(cè)定苜蓿青貯 206 d 后的微生物群落(n=6)

四、結(jié)論

青貯后，苜蓿青貯的 DM 和 CP 含量基本沒(méi)有變化，說(shuō)明大部分營(yíng)養(yǎng)

成分得到了保留。發(fā)酵底物 WSC 降至 30 g/kg DM 左右，pH 值也降至

5.16。在較低的 pH 條件下，NDF 含量下降主要是由于植物細(xì)胞消化更

多，而 ADF 含量保持穩(wěn)定。隨著糖蜜添加量的增加，苜蓿青貯的 DM、CP

和 ADF 含量保持穩(wěn)定。pH 值從 5.16 顯著降低到 4.48，導(dǎo)致 NDF 降低，

LA 含量和 LA/AA 增加，說(shuō)明苜蓿青貯發(fā)酵已向異型發(fā)酵轉(zhuǎn)變。青貯后的

優(yōu)勢(shì)菌屬為腸球菌(Enterococcus)和乳酸菌(Lactobacillus)，在較低的 pH 條

件下，不良微生物受到抑制，導(dǎo)致 BA、PA 和 NH3-N 產(chǎn)量降低。此外，強(qiáng)

烈的苦味、澀味和酸味可以反映苜蓿青貯的味道，而隨著糖蜜添加量的增

加，鮮味和酸味的變化可能會(huì)改善苜蓿青貯的味道，總體上，糖蜜的添加

二、研究成果

56

改善了發(fā)酵品質(zhì)，改變了苜蓿青貯的味道。在所有處理中，M3 組獲得了

最理想的 pH 值(小于 4.5)和長(zhǎng)期保存的最佳條件。

該研究成果已在《Animals》上發(fā)表。該研究得到中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)

科技創(chuàng)新工程重大產(chǎn)出科研選題(CAAS-ZDXT2019004)、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院

科技創(chuàng)新工程(ASTIP-IAS12)、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金(CARS-36)

等項(xiàng)目支持。羅潤(rùn)博為第一作者，王加啟研究員為通訊作者。

——Runbo Luo, Yangdong Zhang, Fengen Wang, Kaizhen Liu, Guoxin Huang,

Nan Zheng, Jiaqi Wang* . Effects of Sugar Cane Molasses Addition on the

Fermentation Quality, Microbial Community, and Tastes of Alfalfa Silage.

Animals . 2021. 11(2). 355

二、研究成果

57

2. 奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

β-內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)生乳菌群和耐藥基因影響

一、研究背景

牛乳房炎主要由乳房?jī)?nèi)細(xì)菌侵入乳房引起，是奶牛最常見(jiàn)的疾病之一。牛

乳房炎會(huì)降低牛奶產(chǎn)量和牛奶質(zhì)量，增加獸醫(yī)費(fèi)用，并降低動(dòng)物福利。乳房炎

也是牛場(chǎng)抗生素使用比例較高的疾病。在法國(guó)，70%的奶牛治療抗生素都用于

治療牛乳房炎。如今，抗生素的濫用已成為公共衛(wèi)生的一大問(wèn)題，在不同環(huán)境

樣本甚至食品中都發(fā)現(xiàn)了大量的抗生素耐藥菌。抗生素耐藥被認(rèn)為是世界上公

眾面臨的最大風(fēng)險(xiǎn)之一。食品中抗生素耐藥細(xì)菌（Antibiotic Resistance Bacteria，

ARB）的流行導(dǎo)致人們擔(dān)心食物可能是抗生素耐藥基因（Antibiotic Resistance

gene，ARG）的儲(chǔ)存庫(kù)并能夠傳播抗生素耐藥性。近年來(lái)，已經(jīng)在從乳制品中分

離出的 ARB 中發(fā)現(xiàn)了 ARG。此外，微生物群落的耐藥水平將影響抗生素治療

后其他微生物群落的動(dòng)態(tài)，導(dǎo)致抗生素耐藥性進(jìn)一步增加。使用抗生素的動(dòng)物

可能也會(huì)將 ARB 和 ARG 傳播到周圍環(huán)境中。

頭孢菌素用于治療人和動(dòng)物的各種細(xì)菌感染。在歐洲獸用抗生素消費(fèi)監(jiān)測(cè)

委員會(huì)(ESVAC)監(jiān)測(cè)的 26 個(gè)國(guó)家中，近年來(lái)第三代和第四代頭孢菌素的使用有

所增加。目前，很少有報(bào)道通過(guò) 16S rDNA 測(cè)序研究治療性使用 β-內(nèi)酰胺類抗

生素對(duì)牛奶中微生物群和耐藥基因的影響。因此，本研究的目的是研究頭孢菌

素治療后牛奶微生物群和耐藥基因的變化。評(píng)價(jià)抗生素的影響對(duì)維持合理使用

抗生素具有重要意義。

二、研究成果

58

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 樣品采集

在研究之前，奶牛沒(méi)有接觸過(guò)抗生素。總共選擇了 7 頭患乳房炎的奶牛。

確診后，將這些奶牛的牛奶從乳房收集到 400mL 無(wú)菌塑料瓶中，然后將頭孢噻

呋注射到肌肉中，濃度為 2mg/kg，頭孢喹肟按 0.75 ng/kg/天的水平持續(xù)乳注 3

天。然后在第 1、2、3、4、6、8、9、11、13 和 15 天對(duì)所有奶牛取樣。牛奶中

的體細(xì)胞計(jì)數(shù)在第 4 天恢復(fù)到正常值，奶牛停止接受抗生素治療。第 9 天檢測(cè)

牛奶中無(wú)抗生素殘留。第 0 天為用藥前；第 1 天至第 3 天為用藥期；第 4 天至

第 8 天為休藥期；第 9 天至第 15 天為休藥期后。

2. PCR 擴(kuò)增

16S rDNA 的 V3-V4 區(qū)（94℃ 2 min，然后 98℃ 10 s，62℃ 30 s，68℃

30 s，30 個(gè)循環(huán)，最后在 68℃下延伸 5 分鐘）使用引物 341F：

CCTACGGGNGGCWGCAG 和 806R：GGACTACHVGGGTATTCTAAT。用 50

μL 混合物進(jìn)行三次重復(fù) PCR 反應(yīng)，該混合物含有 5 μL 10 × KOD 緩沖液、5

μL 2 mM dNTP、3 μL 25 mM MgSO4、1.5 μL 上下游引物（10 μM）、1 μL

KOD 聚合酶和 100 ng 模板 DNA。

3. 耐藥基因的定量檢測(cè)

使用 qPCR 評(píng)估了 16 個(gè)抗生素耐藥基因的數(shù)量，包括 β-內(nèi)酰胺類（cfxA、

blaROB、bla1 和 blaTEM）、氨基糖苷類（strA 和 strB）、大環(huán)內(nèi)酯類[erm (A)

和 erm(B)]、磺胺類（sul1 和 sul2）、四環(huán)素類[tet(B)、tet(C)、tet(Q)和 tet(H)]

和萬(wàn)古霉素類（vanC 和 vanG）。這些基因與 16S rRNA 基進(jìn)行比例計(jì)算，也可

以通過(guò) qPCR 進(jìn)行量化。使用 357-F：5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3'和 518-

R：5'-ATTACCGCGGCTGCCTGG-3'引物擴(kuò)增 16S rRNA 基因，這些引物也用

于生成 16s rRNA 基因庫(kù)。

二、研究成果

59

三、結(jié)果

α-多樣性通過(guò)豐富度（Chao 1）和多樣性指數(shù)（Shannon 和 Simpson）來(lái)

衡量。不同時(shí)期微生物群的 Shannon 多樣性指數(shù)和 Chao 1 指數(shù)的平均值相似，

表明微生物群的豐富度沒(méi)有顯著增加。然而，不同時(shí)期的 Simpson 指數(shù)平均值

存在顯著差異，表明抗生素處理可能對(duì)微生物群落多樣性產(chǎn)生影響（圖 A）。

對(duì)不同時(shí)期采集的牛奶樣品進(jìn)行微生物種群的科級(jí)微生物種群分布分析。從科

水平看，假單胞菌科、伯克霍爾德菌科、瘤胃球菌科和毛螺菌科是數(shù)量最多的

四個(gè)科，屬于梭狀芽孢桿菌（圖 B）。對(duì)于一些經(jīng)常檢測(cè)到的乳房炎相關(guān)細(xì)

菌，抗生素的使用也影響了其組成。最值得注意的是，腸桿菌的相對(duì)豐度在藥

物治療時(shí)顯著降低（p < 0.05），并且從藥物治療到停藥期間持續(xù)降低（圖

C）。不同時(shí)期葡萄球菌和芽孢桿菌的相對(duì)豐度無(wú)顯著差異。

對(duì)來(lái)自四個(gè)不同采樣周期的牛奶樣品中的 16 個(gè)抗生素耐藥基因的比例進(jìn)行

定量檢測(cè)，頭孢噻呋和頭孢喹肟在休藥期顯著增加了牛奶中 blaTEM 的比例

（圖 D）。與休藥期相比，休藥期后 blaTEM 的相對(duì)豐度顯著增加。其他耐藥

基因不受抗生素治療的影響（數(shù)據(jù)未顯示）。

二、研究成果

60

圖 A 不同時(shí)期的 α 多樣性。x0 用藥前，X 用藥期，Y 休藥期，Z 恢復(fù)期

圖 B 不同時(shí)期科水平上的微生物組成

圖 C 牛乳腺炎相關(guān)細(xì)菌屬的相對(duì)豐度。a）腸桿菌屬，b）葡萄球菌屬，

c）芽孢桿菌屬

二、研究成果

61

圖 D β-內(nèi)酰胺類耐藥基因 blaTEM 與 16S rRNA 基因的比例

四、結(jié)論

這項(xiàng)研究提供了受頭孢菌素影響的牛奶微生物群和耐藥基因的概況。隨著

頭孢菌素的使用，腸桿菌屬的相對(duì)豐度顯著降低。然而，β-內(nèi)酰胺基因 blaTEM

的相對(duì)豐度在休藥期有所提高。頭孢菌素治療對(duì)牛奶微生物群和耐藥基因的影

響值得進(jìn)一步研究。

研究成果已在國(guó)際知名學(xué)術(shù)期刊《Journal of Dairy Science》2021 年第 104 期

7018–7025頁(yè)上發(fā)表。董蕾和孟璐博士為共同第一作者，王加啟研究員為通訊作

者。

——L. Dong, H. M. Liu, L. Meng, M. R. Xing, J. Q. Wang, C. Wang, H. Chen,

N. Zheng. Effect of therapeutic administration of β-lactam antibiotics on the bacterial

community and antibiotic resistance patterns in milk. Journal of Dairy Science 104：

7018-7025.

二、研究成果

62

生乳菌落總數(shù)及熱處理對(duì)乳制品內(nèi)毒素含量的影響

原料奶營(yíng)養(yǎng)豐富，是微生物的優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)基。奶牛的養(yǎng)殖環(huán)境、擠奶條件和

運(yùn)輸條件均可能會(huì)造成微生物污染，導(dǎo)致生牛乳中微生物多樣性和數(shù)量發(fā)生重

大變化，甚至導(dǎo)致病原菌入侵。為了確保消費(fèi)者的健康，乳品廠采用熱滅菌法

處理生牛乳，以消除生牛乳中微生物的潛在威脅。然而，微生物死亡后釋放的

內(nèi)毒素不能通過(guò)牛乳熱滅菌過(guò)程完全滅活。內(nèi)毒素也稱為脂多糖（LPS），是

革蘭氏陰性菌的主要成分，它為細(xì)菌提供了一種有效抵抗抗生素化合物的通透

性屏障，并防止補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解。LPS 的一般結(jié)構(gòu)由三個(gè)不同區(qū)域組成：（1）

由糖磷脂組成的脂質(zhì) A 在細(xì)胞膜內(nèi)層具有免疫原性，（2）通過(guò)共價(jià)鍵與脂質(zhì)

A 相連的核心低聚糖結(jié)構(gòu)，以及（3）由重復(fù)的低聚糖單元組成的抗原性 O 鏈

多糖。在 250℃下加熱 30 分鐘或在 180℃下加熱 3 小時(shí)，可使內(nèi)毒素完全失

活。牛乳經(jīng)不起如此長(zhǎng)時(shí)間的高溫處理。當(dāng)前的乳制品加工技術(shù)中，生牛乳的

內(nèi)毒素污染不能通過(guò)熱處理工藝消除。然而，不同的生產(chǎn)工藝，特別是熱處理

強(qiáng)度對(duì)牛乳制品中內(nèi)毒素的影響尚不清楚。

在對(duì)南非、荷蘭、西班牙、瑞士、美國(guó)、比利時(shí)、愛(ài)爾蘭、斯洛文尼亞和

英國(guó)七個(gè)國(guó)家生產(chǎn)的嬰兒配方奶粉（IFM）的調(diào)查中，發(fā)現(xiàn) IFM 中的最高內(nèi)毒

素為每克 55000 個(gè)內(nèi)毒素單位（EU）每毫升。在健康條件下，如果沒(méi)有因飲酒

和腸炎引起的腸道損傷，內(nèi)毒素不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生免疫刺激。當(dāng)成人腸道結(jié)構(gòu)受

損時(shí)，腸道內(nèi)的內(nèi)毒素可能進(jìn)入血液并觸發(fā)免疫反應(yīng)。對(duì)于腸道結(jié)構(gòu)尚未完全

發(fā)育的嬰兒，攝入內(nèi)毒素可能對(duì)健康構(gòu)成威脅。有研究顯示，嬰兒攝入內(nèi)毒素

可能導(dǎo)致腸道、血液、肺、肝臟和其他器官的免疫反應(yīng)甚至炎癥。因此，研究

不同乳制品中的內(nèi)毒素水平以及加工過(guò)程對(duì)成品奶制品中內(nèi)毒素的影響，對(duì)乳

制品原料奶質(zhì)量的可追溯性評(píng)價(jià)具有重要意義。

表 1 總結(jié)了在 20℃下儲(chǔ)存的生牛乳成分隨儲(chǔ)存時(shí)間的變化。ALP、SFA、

MUFA 和 PUFA 無(wú)顯著變化（P>0.05）。LPO 活性在貯藏 24h 后下降，48h 后

顯著升高（P<0.05）。新鮮生牛乳中 TBC 的平均值為 2.13 log CFU/ml，并隨貯

二、研究成果

63

存時(shí)間顯著增加（P<0.001）。儲(chǔ)存 24 小時(shí)后，TBC 含量增加了 10000 倍，達(dá)

到 6.12 log CFU/ml。與儲(chǔ)存 24 小時(shí)的生牛乳相比，儲(chǔ)存 48 小時(shí)的生牛乳 TBC

含量增加 50 倍，達(dá)到 7.48 log CFU/ml。同時(shí)，生牛乳在 0、24 和 48 小時(shí)的內(nèi)

毒素含量（LPS）為 1.29 log EU/ml（20 EU/ml），分別為 2.5 log EU/ml（353

EU/ml）和 3.81 log EU/ml（9649 EU/ml）。

表 1 貯存時(shí)間對(duì)原料乳 TBC 及成分的影響

表 2 對(duì)牛奶成分?jǐn)?shù)據(jù)隨熱處理強(qiáng)度增加的變化進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。處理后的牛

奶中 ALP 和 LPO 顯著降低（P<0.001）。75℃處理 15s，可有效殺滅牛乳中

99.88%的細(xì)菌。此外，隨著處理強(qiáng)度的增加，牛乳中的內(nèi)毒素含量顯著增加

（P<0.05，圖 1A）。雙向方差分析表明，生牛乳中的 TBC 含量對(duì)牛乳中的內(nèi)

毒素含量有顯著影響（P<0.001，圖 1b）。熱處理強(qiáng)度不影響牛乳中脂肪酸的比

例。當(dāng)根據(jù)原料奶的儲(chǔ)存天數(shù)將數(shù)據(jù)進(jìn)行單向方差分析時(shí)，SFA 的比例隨著儲(chǔ)

存時(shí)間的變化而顯著增加（P<0.05），MUFA 的比例顯著降低（P<0.05）。

圖 1 通過(guò)中試驗(yàn)證原料乳加熱溫度和 TBC 對(duì)滅菌乳內(nèi)毒素含量的影響

Day1 Day2 Day3 P-value

Lg-TBC 2.13±0.12 c

6.12±0.17 b 7.48±0.43 a <0.001

Lg-LPS 1.29±0.08 c

2.5±0.15 b 3.81±0.32 a <0.001

Lg-ALP 5.25±0 5.25±0 5.24±0 0.564

Lg-LPO 4.07±0.08 ab 3.96±0.04 b 4.46±0.14 a <0.05

SFA (%) 70.93±0.04 70.91±0.12 71.22±0.29 0.466

MUFA (%) 25.2±0.02 25.19±0.13 24.83±0.38 0.484

PUFA (%) 3.87±0.04 3.9±0.02 3.95±0.1 0.663

a b

二、研究成果

64

表 2 熱處理強(qiáng)度對(duì)牛奶成分的影響

對(duì)所有牛奶進(jìn)行 37 種脂肪酸檢測(cè)，在所有牛乳樣品中均未檢測(cè)到

c15:1n5、c20:3n3 和 c22:6n3（DHA）（圖 2）。四種 SFA（C14、C16、C18 和

C24）、一種多不飽和脂肪酸（c22:1n9）和兩種多不飽和脂肪酸（c22:2n6、

C18:2n6）在儲(chǔ)存 24 和 48 小時(shí)的生牛乳和滅菌牛乳中的比例增加。

圖 2 中試牛奶樣品脂肪酸含量差異分析。

Group Lg-ALP Lg-LPO Lg-TBC Lg-LPS SFA (%) MUFA (%) PUFA (%

1D-RM 5.25±0.00 4.07±0.08 2.13±0.12 1.29±0.08 70.93±0.04 25.20±0.02 3.87±0.04

1D-72℃ 3.13±0.03 3.05±0.32 0.28±0.28 1.37±0.07 70.95±0.01 25.20±0.04 3.85±0.04

1D-75℃ 3.27±0.02 2.53±0.21 0.00±0.00 1.43±0.05 70.90±0.08 25.23±0.06 3.87±0.04

1D-80℃ 3.15±0.11 1.56±0.45 0.00±0.00 1.49±0.09 71.00±0.14 25.17±0.13 3.83±0.05

1D-85℃ 3.13±0.11 1.37±0.36 0.00±0.00 1.60±0.10 70.87±0.10 25.24±0.06 3.89±0.04

1D-90℃ 3.06±0.11 1.07±0.06 0.00±0.00 1.66±0.11 70.89±0.05 25.24±0.03 3.87±0.02

1D-95℃ 3.07±0.17 0.95±0.00 0.00±0.00 1.77±0.19 70.95±0.05 25.2±0.03 3.85±0.04

1D-100℃ 3.03±0.14 0.93±0.06 0.00±0.00 1.80±0.20 70.95±0.04 25.18±0.03 3.87±0.04

1D-105℃ 3.02±0.12 0.87±0.07 0.00±0.00 1.83±0.22 70.96±0.08 25.17±0.04 3.86±0.04

1D-110℃ 3.06±0.14 0.87±0.07 0.00±0.00 2.01±0.18 70.96±0.06 25.21±0.03 3.83±0.04

1D-115℃ 3.17±0.22 0.77±0.04 0.00±0.00 1.98±0.15 70.97±0.11 25.16±0.08 3.87±0.04

1D-120℃ 2.77±0.07 0.84±0.04 0.00±0.00 2.27±0.23 70.81±0.11 25.36±0.12 3.82±0.03

Day1 P-value <0.001 <0.001 <0.001 <0.005 0.943 0.774 0.989

2D-RM 5.25±0.00 3.96±0.04 6.12±0.17 2.5±0.15 70.91±0.12 25.19±0.13 3.9±0.02

2D-75℃ 2.77±0.12 2.60±0.27 0.26±0.14 2.69±0.05 71.10±0.27 25.01±0.29 3.89±0.04

2D-90℃ 2.78±0.08 1.45±0.05 0.10±0.10 2.89±0.22 71.14±0.29 24.90±0.40 3.96±0.11

Day2 P-value <0.001 <0.001 <0.001 0.298 0.784 0.796 0.792

3D-RM 5.24±0.00 4.46±0.14 7.48±0.43 3.81±0.32 71.22±0.29 24.83±0.38 3.95±0.10

3D-75℃ 2.20±0.42 2.02±0.47 0.99±0.84 4.58±0.43 71.09±0.33 24.99±0.36 3.92±0.03

3D-90℃ 1.90±0.64 1.08±0.07 0.88±0.88 4.87±0.47 71.28±0.35 24.84±0.39 3.87±0.06

Day3 P-value <0.005 <0.001 <0.001 0.251 0.918 0.949 0.704

Total P-value0.562 <0.05 <0.001 <0.001 <0.05 <0.05 0.051

二、研究成果

65

通過(guò) Spearman 分析所有牛乳樣品成分之間的相關(guān)性；P<0.05 的結(jié)果總結(jié)為

熱圖（圖 3）。牛乳中的內(nèi)毒素（LPS）與 ALP、C4、C6、c20:5n3 呈負(fù)相關(guān)。

此外，牛乳中的內(nèi)毒素（LPS）與 C14、C15、C18、C24、c22:1n9、c22:2n6 和

C24:1n9 呈正相關(guān)。TBC 與 ALP、LPO 呈正相關(guān)。SFA 與 MUFA 呈顯著負(fù)相

關(guān)。雖然生牛乳中的 TBC 含量與內(nèi)毒素顯著相關(guān)（P<0.001，圖 1b），但牛乳

制品中的 TBC 含量與內(nèi)毒素?zé)o關(guān)（P>0.05）。因此，單純檢測(cè)產(chǎn)品中的 TBC

指數(shù)不能完全保證牛乳產(chǎn)品的微生物安全。

圖 3 在中試加工驗(yàn)證牛奶中脂肪酸、TBC、內(nèi)毒素（LPS）、堿性磷酸酶

（ALP）和乳過(guò)氧化物酶（LPO）的相關(guān)性。

嬰兒配方奶粉樣品的內(nèi)毒素含量結(jié)果。共分析了 75 份國(guó)產(chǎn)嬰兒配方奶粉樣

品。平均內(nèi)毒素含量為 2.605 log EU/ml（14 EU/ml 至 4731 EU/ml）。同時(shí)，我

們分析了 74 種進(jìn)口嬰兒配方奶粉，平均內(nèi)毒素含量為 2.359 log EU/ml（6

EU/ml 至 9080 EU/ml）。t 檢驗(yàn)結(jié)果顯示，進(jìn)口和國(guó)產(chǎn) IFM 在各階段的內(nèi)毒素

含量均無(wú)顯著性差異（P>0.05）。四段 IFM 的平均內(nèi)毒素含量明顯低于其他階

段 IFM。這可能是因?yàn)閷?duì) 3 歲以上的兒童使用了第 4 階段 IFM。第 4 階段 IFM

的成分不同于其他階段的 IFM，導(dǎo)致內(nèi)毒素含量不同。

二、研究成果

66

表 4 總結(jié)了不同商業(yè)乳制品的內(nèi)毒素含量。它包括巴氏殺菌牛乳（PM）、

超高溫瞬時(shí)滅菌乳（UHT）和重組嬰兒配方奶粉（IFM）。37 份巴氏滅菌乳樣

品的內(nèi)毒素含量最低（1.347 log EU/ml，6 EU/ml 至 231 EU/ml），40 份 UHT

乳樣品（1.865 log EU/ml，31 EU/ml 至 1437 EU/ml）的內(nèi)毒素含量介于 PM 和

IFM 之間，149 份重組 IFM 樣品的內(nèi)毒素含量最高（2.483 log EU/ml，6 EU/ml

至 9080 EU/ml）。不同乳制品的內(nèi)毒素含量有顯著性差異（P<0.001）。

表 4 市售乳制品中的內(nèi)毒素

在這項(xiàng)研究中調(diào)查了市場(chǎng)上乳制品的內(nèi)毒素含量。結(jié)果表明，不同 IFM 的

內(nèi)毒素含量差異較大，熱處理強(qiáng)度較高的乳制品內(nèi)毒素含量較高。中試加工驗(yàn)

證試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，生牛乳的 TBC 含量和熱處理強(qiáng)度會(huì)顯著影響滅菌牛乳的內(nèi)毒素含

量。綜上所述，乳制品中存在內(nèi)毒素，生牛乳中的細(xì)菌含量和熱處理溫度影響

乳制品中的內(nèi)毒素含量。

該成果由中國(guó)博士后特別資助項(xiàng)目、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院

重大任務(wù)和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系等項(xiàng)目資助，吳浩銘為文章第一作者，王加

啟為文章通訊作者。

——Wu H, Wang Y, Hao X, Meng L, Li H, Cheng M, Zheng N, Wang J. Effect

of TBC of raw milk and thermal treatment intensity on endotoxin contents of milk

products. Food Res Int (2021)110816. doi:10.1016/j.foodres.2021.110816

N Mean SD SE MIN MAX

PM 37 1.347 c 0.269 0.044 0.754 2.364

UHT 40 1.865 b 0.420 0.066 1.489 3.157

IFM 149 2.483 a 0.651 0.053 0.764 3.958

二、研究成果

67

建立牛奶中 AFM1 的核酸適配體檢測(cè)技術(shù)

一 、研究背景

霉菌毒素是由霉菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝物，通過(guò)污染飼料和動(dòng)物性食品（肉、

蛋、奶等），對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)性能以及人類的組織和器官產(chǎn)生極大的危害。目前有

400 多種已知的霉菌毒素對(duì)人類和動(dòng)物具有潛在毒性，常見(jiàn)的霉菌毒素主要包

括 AFB1、AFM1、OTA、FB1。AFM1 是 AFB1 的羥基化代謝產(chǎn)物，受污染的

動(dòng)物飼料中約有 2-6％的 AFB1 在牛奶中轉(zhuǎn)化為 AFM1。AFM1 已被國(guó)際癌癥研

究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）列為第 1 類致癌

物。一旦原料奶被 AFM1 污染，牛奶和乳制品的常規(guī)熱處理（巴氏殺菌或超高

溫）不易降解 AFM1。

盡管嚴(yán)格控制牛奶中 AFM1，但 AFM1 污染事件仍時(shí)常發(fā)生。因此，檢測(cè)

牛奶中 AFM1 的方法引起了更多的關(guān)注。目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)了許多檢測(cè) AFM1 的方

法，包括高效液相色譜法（HPLC）、薄層色譜法（TLC）、氣相色譜法

（GC）和質(zhì)譜法（MS）等儀器分析方法以及基于抗體的酶聯(lián)免疫反應(yīng)

（ELISA）、免疫傳感器和表面等離子共振（SPR）等免疫分析方法。但這些檢

測(cè)方法仍存在一些問(wèn)題，比如在儀器分析方法在樣品前處理過(guò)程中，步驟繁

雜、耗時(shí)長(zhǎng)且不適合現(xiàn)場(chǎng)操作，同時(shí)需要大量的專業(yè)技術(shù)人員，而免疫分析方

法中使用的抗體價(jià)格昂貴且不穩(wěn)定，制備時(shí)間長(zhǎng)，不容易長(zhǎng)期存儲(chǔ)等。目前，

基于核酸適配體的生物傳感器因具有易合成、易標(biāo)記、易修飾、靈敏度高、特

異性高、分子量小、檢測(cè)成本低等優(yōu)勢(shì)而受到廣泛的關(guān)注。

由于基于核酸適配體的熒光淬滅信號(hào)感應(yīng)平臺(tái)具有較高的靈敏度和特異

性，它們被認(rèn)為是用于檢測(cè)各種生物分子的比較有前途的方法，并且在團(tuán)隊(duì)先

前的研究中，熒光淬滅方法已被用于檢測(cè) AFB1。Sharma 等開(kāi)發(fā)了一種用于檢

測(cè) AFM1 的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換適配體。但是，該適配體對(duì) AFM1 的選擇性尚不清楚，因

為只選擇了不相關(guān)的 OTA 和 AFB1 作為研究交叉反應(yīng)的干擾物，而其他毒素

二、研究成果

68

（尤其是結(jié)構(gòu)類似物 AFB1、AFB2、AFG1 和 AFG2）之間的交叉活性測(cè)試實(shí)驗(yàn)

沒(méi)有進(jìn)行。 此外，食物中多種霉菌毒素的共存是一種常見(jiàn)而復(fù)雜的現(xiàn)象。因

此，應(yīng)研究混合真菌毒素對(duì)適配體傳感器特異性的影響。

本文研究基于核酸適配體的熒光傳感器檢測(cè)牛奶中 AFM1，并研究了該適

配體最優(yōu)互補(bǔ) DNA 和結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換信號(hào)，可通過(guò)熒光的變化定量檢測(cè) AFM1 濃

度。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 基于適配體的 AFM1 熒光檢測(cè)方法

用 Tris-HCl 緩沖液溶解稀釋 AFM1 aptamer 和 cDNA，將 AFM1 aptamer 與

cDNA 按照一定比例混合混勻，再將混合物于 88 ℃下水浴加熱 5 min，之后室

溫下靜置至少 30 min，此時(shí)反應(yīng)總體積為 1.0 mL。之后，向反應(yīng)混合物添加

500 μL 不同濃度的 AFM1 標(biāo)準(zhǔn)溶液并渦旋混勻，最終反應(yīng)體系體積為 1.5 mL，

用熒光分光光度計(jì)測(cè)量此時(shí)的熒光強(qiáng)度。類似地，將 500 μL Tris-HCl 緩沖液加

入到 AFM1 aptamer 和 cDNA 的混合物中，同時(shí)在不添加 AFM1 的情況下渦旋

混勻，然后用熒光分光光度計(jì)測(cè)量熒光淬滅時(shí)的熒光強(qiáng)度。為了避免黃曲霉毒

素背景熒光信號(hào)的影響，通過(guò)測(cè)量含有 AFM1 和 Tris-HCl 緩沖液但不含 AFM1

aptamer 或 cDNA 的作為試驗(yàn)對(duì)照，對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行熒光背景校正。

2. AFM1 適配體和 cDNA（1~7）優(yōu)化

對(duì)試驗(yàn)中 AFM1 aptamer 與 cDNA 1~cDNA 7 進(jìn)行優(yōu)化，該實(shí)驗(yàn)中使 AFM1

aptamer 與 cDNA 的摩爾比為 1：2，反應(yīng)中 AFM1 終濃度為 150 ng/mL。

3. 適配體和 cDNA 濃度比優(yōu)化

該試驗(yàn)采用最優(yōu) cDNA，并設(shè)定 AFM1 aptamer：cDNA 的濃度摩爾比比例

為 1：1、1：2、1：3、1：4 和 1：5，反應(yīng)中 AFM1 終濃度為 150 ng/mL。

4. AFM1 濃度分析

二、研究成果

69

該試驗(yàn)采用最優(yōu) cDNA 鏈，以及最優(yōu) AFM1 aptamer：cDNA 的濃度摩爾

比，反應(yīng)中 AFM1 的終濃度依次為 0、1、5、10、20、40、60、80、150、

200、300 和 400 ng/mL。

5. 特異性分析

為了評(píng)估該檢測(cè)方法對(duì) AFM1 的特異性，選擇與 AFM1（AFB1、AFB2、

AFG1、AFG2、OTA、ZEN 和 FB1）結(jié)構(gòu)相關(guān)的 7 種霉菌毒素用于測(cè)試。該特

異性試驗(yàn)中，所有霉菌毒素均使用相同濃度（40 ng/mL）。試驗(yàn)中所有檢測(cè)條

件均與檢測(cè) AFM1 相同。

6. 牛奶樣品分析

該試驗(yàn)用于定量檢測(cè)已知 AFM1 濃度的的液態(tài)奶樣品中的 AFM1。當(dāng)牛奶

樣品中 AFM1 的濃度在 1~100 ng/mL 范圍內(nèi)時(shí)，使用以下預(yù)處理方法。向牛奶

樣品中分別加入濃度為 5、10 和 20 ng/mL 的 AFM1 標(biāo)準(zhǔn)品。精確稱量 0.5 mL

液態(tài)奶樣品加入 10 mL 離心管中，然后加入 2.5 mL 70％ 甲醇水溶液從牛奶樣

品中提取 AFM1。將整個(gè)混合物在 Vortex-Genie 上渦旋 5 min，以 10,000 rpm

離心 10 min。收集上清液。將上清液通過(guò) 0.22 μm 過(guò)濾膜過(guò)濾，再使用 N1-自

動(dòng)氮?dú)鉂饪s器將溶液濃縮至 0.5 mL。最后，將濃縮物重新溶解在 2 mL 甲醇水

溶液（5％，v/v）中并儲(chǔ)存在 4℃下。

當(dāng)牛奶樣品中 AFM1 的濃度在 0~1.0 ng/mL 范圍內(nèi)時(shí)，采用增加牛奶樣品

量的方式對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理。精確稱量 25 mL 樣品，加入濃度為 0.5 ng/mL 的

AFM1 標(biāo)準(zhǔn)品，加熱至約 35~37℃，然后以 4,000 rpm 離心 10 min。通過(guò)重力

的作用將 25 mL 的牛奶樣品通過(guò) AFM1 免疫親和柱以促進(jìn) AFM1 結(jié)合。用 20

mL PBS 以每分鐘約 5 mL 的流速洗滌親和柱。用 1.25 mL 甲醇：乙腈（40 ：

60 v/v）以每秒一滴的流速?gòu)闹舷疵?AFM1。洗脫后，將 1.25 mL 水通過(guò)親和

柱并收集在相同的離心管中，總體積為 2.5 mL。將離心管放置于 N1-自動(dòng)氮?dú)?/p>

濃縮器中，將牛奶樣品濃縮至 1 mL。濃縮后，加入 1.5 mL Tris-HCl 緩沖液溶

解，之后用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)弱。重復(fù) 5 次測(cè)量每個(gè)樣品，以評(píng)

估該檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性。

二、研究成果

70

三、結(jié)果與討論

1. 設(shè)計(jì)基于核酸適配體的篩選平臺(tái)

圖 1. A 是基于核酸適配體檢測(cè) AFM1 的熒光傳感器設(shè)計(jì)示意圖。在該傳感

器系統(tǒng)中，AFM1 aptamer 用 FAM 修飾，7-mer cDNA 用 TAMRA 修飾。當(dāng)溶

液中沒(méi)有 AFM1 時(shí)，TAMRA-cDNA 靠近 AFM1 aptamer 導(dǎo)致其熒光淬滅，進(jìn)而

雜交形成 AFM1 aptamer-cDNA 復(fù)合物。在加入 AFM1 后，AFM1 誘導(dǎo)適配體

打開(kāi)空間結(jié)構(gòu)，形成 AFM1/aptamer 復(fù)合物。適配體結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致 cDNA 從

適配體中釋放，使適配體熒光的恢復(fù)。由此可見(jiàn)，溶液中 AFM1 的濃度與反應(yīng)

后熒光變化的強(qiáng)度呈正相關(guān)，故可以通過(guò)測(cè)定熒光變化的強(qiáng)度進(jìn)而量化 AFM1

的濃度。為了證實(shí) AFM1 可以解離 aptamer-cDNA 復(fù)合物并使適配體恢復(fù)熒

光，在 Tris-HCl 緩沖液中加入 150 ng/mL AFM1 至 10 nM aptamer 和 20 nM

cDNA 混合液中。圖 1. B 顯示加入 AFM1 后熒光強(qiáng)度增加了至少 11 倍。

圖 1（A）用于基于適配體熒光傳感器用于檢測(cè) AFM1 的示意圖。（B）基

于適配體的傳感系統(tǒng)中熒光發(fā)射光譜：（a）空白組（10mM Tris-HCl 緩沖液，

pH7.0）；（b）AFM1 aptaner 與 cDNA 結(jié)合；（c）150 ng/mL AFM1；（d）

AFM1 aptaner。

2. 優(yōu)化 cDNA 序列

在該試驗(yàn)中，將 10 nM AFM1 aptamer 添加至 20 nM cDNA 1~7 中，用移液

槍輕輕混勻，放至水浴鍋中，88 ℃溫育 5 min，冷卻至室溫 30 min，添加

AFM1 標(biāo)準(zhǔn)液，使反應(yīng)終濃度為 150 ng/mL。在圖 2. A 中，黑色柱表明當(dāng)體系

中無(wú) AFM1 時(shí)，AFM1 aptamer 與 cDNA 1~cDNA 7 結(jié)合后的熒光值，藍(lán)色柱表

二、研究成果

71

明加入 AFM1 后的熒光值。表明當(dāng)體系中無(wú) AFM1 時(shí)，cDNA 5~7 可以有效淬

滅 AFM1 aptamer 熒光并降低熒光信號(hào)。由于 cDNA 1~4 鏈的長(zhǎng)度較短，與

AFM1 雜交后結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，故而產(chǎn)生更高的熒光信號(hào)。當(dāng) cDNA 5 與 aptamer 雜

交時(shí)，加入 AFM1 后可觀察到熒光（F/F0）顯著增加，而較長(zhǎng)的 cDNA 序列

（cDNA6 和 cDNA7）也可有效地淬滅熒光（圖 2. B）；這可能是因?yàn)?cDNA 5

與 cDNA 6~7 相比，與 aptamer 結(jié)合更加緊密，可以促進(jìn) aptamer-cDNA 雙鏈體

的形成，同時(shí)限制 AFM1 誘導(dǎo) cDNA-aptamer 結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。因此，本試驗(yàn)認(rèn)為

cDNA5 是該反應(yīng)最優(yōu)的 cDNA 序列。

圖 2 cDNA 序列、濃度和反應(yīng)穩(wěn)定性的優(yōu)化。（A）通過(guò)改變 cDNA 鏈的長(zhǎng)

度來(lái)優(yōu)化 cDNA（cDNA 1~7）。黑色條帶表示加入 AFM1 前的熒光強(qiáng)度，藍(lán)色

條帶表示加入 150 ng/mL AFM1 后的熒光強(qiáng)度。（B）加入 150 ng/mL AFM1 后

熒光增強(qiáng)比（F/F0）。（C）優(yōu)化 aptamer：在 150 ng/mL AFM1 存在下的

cDNA5 濃度比。（D）加入 150 ng/mL AFM1 后反應(yīng)中熒光強(qiáng)度的穩(wěn)定性。實(shí)

驗(yàn)中數(shù)據(jù)為三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

二、研究成果

72

3. 優(yōu)化 cDNA5 濃度

為了更好優(yōu)化該傳感器的性能，對(duì) cDNA5 濃度進(jìn)行優(yōu)化。在該實(shí)驗(yàn)中，將

10 nM AFM1 aptamer 與 cDNA5 分別以 1：1、1：2、1：3、1：4 和 1：5 的摩

爾比進(jìn)行混合，用移液槍輕輕混勻，添加 AFM1 標(biāo)準(zhǔn)液，使反應(yīng)終濃度為 150

ng/mL，同時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化。如圖 2 C 所示，cDNA5 濃度為 20 nM 時(shí)達(dá)

到最大熒光增強(qiáng)（F/F0）。因此，即使在較高濃度的 cDNA5 中，

cDNA5/aptamer 雙鏈體的形成也產(chǎn)生低背景熒光。當(dāng) cDNA 5 濃度高于 20 nM

（AFM1 aptamer 濃度的兩倍）時(shí)，會(huì)影響 AFM1 與 aptamer 相互結(jié)合，進(jìn)而限

制熒光強(qiáng)度的增加。然而，當(dāng) cDNA 5 濃度低于 20 nM 時(shí)，熒光背景值過(guò)高，

導(dǎo)致熒光強(qiáng)度恢復(fù)減慢。因此，優(yōu)化后的傳感器 cDNA 5 的最佳濃度為 20

nM。

4. 驗(yàn)證反應(yīng)穩(wěn)定性

為了產(chǎn)生所需的熒光強(qiáng)度，分析了 AFM1 與 aptamer 的反應(yīng)時(shí)間。如圖 2

（D）所示，反應(yīng)初期 aptamer 和 AFM1 快速結(jié)合。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為 1 min 時(shí)，該

傳感器即可檢測(cè)出溶液中 AFM1 溶度，并且檢測(cè)出的熒光強(qiáng)度可保持 30 min

內(nèi)不變。因此，該熒光適配體傳感器具可信的穩(wěn)定性。本試驗(yàn)選擇 15 min 時(shí)反

應(yīng)時(shí)間為測(cè)定時(shí)的最佳時(shí)間。

5. 定性檢測(cè) AFM1

基于上述優(yōu)化試驗(yàn)，使用該傳感器定性檢測(cè)不同濃度的 AFM1。如圖 3 A

所示，反應(yīng)中熒光強(qiáng)度隨 AFM1 濃度增加而增強(qiáng)，并且在 AFM1 濃度為 150

ng/mL 時(shí)熒光強(qiáng)度最高。當(dāng) AFM1 的濃度在 1~100 ng/mL 范圍內(nèi)與反應(yīng)的熒光

強(qiáng)度呈線性關(guān)系（圖 3 B），其線性回歸方程為 F = 1.665C + 7.652（R2 =

0.9963），其中 F 表示熒光強(qiáng)度，C 表示 AFM1 濃度。檢測(cè)限為 1.0 ng/mL，信

噪比為 3（S/N = 3）。

二、研究成果

73

圖 3（A）適配體傳感器的熒光發(fā)射光譜。（B）熒光強(qiáng)度與 AFM1 濃度之

間的線性關(guān)系。

6. 特異性實(shí)驗(yàn)

為了評(píng)估該適配體傳感器的特異性，選擇了 7 種與 AFM1（AFB1、

AFB2、AFG1、AFG2、OTA、ZEN 和 FB1）結(jié)構(gòu)相似的霉菌毒素作為對(duì)照。在

用于檢測(cè) AFM1 的相同實(shí)驗(yàn)條件下，以相同濃度（40 ng/mL）檢測(cè)這些霉菌毒

素。如圖 4 所示，相對(duì)于體系中沒(méi)有添加霉菌毒素的對(duì)照組相比，只有霉菌毒

素和 AFM1（MIX1）以外的所有化合物的混合物都沒(méi)有顯著改變熒光（P >

0.05）。包括 AFM1（MIX2）的所有毒素的混合物具有比只有 AFM1 稍弱的效

果，但差異不顯著。這些結(jié)果證實(shí)該熒光生物傳感器不與 AFM1 以外的霉菌毒

素反應(yīng)，表明該方法對(duì) AFM1 的檢測(cè)具有高度特異性。

7. 牛奶樣品分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證適用性和可行性，將試驗(yàn)中的方法應(yīng)用于兩種不同品牌的

加標(biāo)牛奶樣品中 AFM1 的檢測(cè)。將四種不同濃度的 AFM1（0.5、5、10 和 20

ng/mL）添加到牛奶樣品中，每種濃度重復(fù)檢測(cè) 5 次。如表 1 所示，加標(biāo)牛奶

樣品的回收率范圍在為 93.4~101.3％（n = 5），表明該適配體傳感器可用作真

實(shí)牛奶樣品中定量檢測(cè) AFM1。

二、研究成果

74

表 1 加入牛奶樣品中的 AFM1 的測(cè)定(n = 5)

添加濃度

(ng/mL)

檢測(cè)濃度

(ng/mL)

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(%)

回收率

(%)

0.5 0.47 4.8 93.4

5 5.1 3.6 101.3

10 9.7 2.9 97.5

20 19.4 2.6 97

四、結(jié)論

本試驗(yàn)研究了基于適配體的熒光淬滅檢測(cè)方法，可用于直接檢測(cè) AFM1，

并將該方法成功應(yīng)用于實(shí)際牛奶樣品中 AFM1 的檢測(cè)。在最佳條件下，AFM1

濃度在 1~100 ng/mL 范圍內(nèi)，該適配體傳感器的熒光強(qiáng)度隨著 AFM1 濃度增

加呈線性增加，LOD 為 0.5 ng/mL。該試驗(yàn)為檢測(cè) AFM1 提供了一種新穎、簡(jiǎn)

便、快速、特異、方便和經(jīng)濟(jì)的方法，并提供了定量測(cè)定乳制品中霉菌毒素的

新思路。

研究成果已在《Frontiers in Chemistry》上發(fā)表。喬勤勤、郭曉東和文芳博

士為共同第一作者，王加啟研究員為通訊作者。

——Qinqin Qiao, Xiaodong Guo, Fang Wen, Lu Chen, Qingbiao Xu, Nan Zheng,

Jianbo Cheng, Xiuheng Xue, Jiaqi Wang* . Aptamer-Based Fluorescence Quenching

Approach for Detection of Aflatoxin M1 in Milk. Front Chem. 2021. 9. 653869

二、研究成果

75

黃曲霉毒素 M1 和赭曲霉毒素 A 聯(lián)合誘導(dǎo)小鼠腎損傷機(jī)制

黃曲霉毒素 M1（AFM1）和赭曲霉毒素 A（OTA）是環(huán)境中廣泛存在的有

害霉菌毒素。AFM1 和 OTA 共存可能會(huì)導(dǎo)致加和或協(xié)同效應(yīng)，為公眾健康帶來(lái)

更大的風(fēng)險(xiǎn)。然而，AFM1 + OTA 誘導(dǎo)的腎毒性及其機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

本研究采用 3.5 mg/kg b.w. AFM1、OTA 和 AFM1+OTA 處理 CD-1 小鼠 35 天，

采用 LC-MS 代謝組學(xué)方法構(gòu)建小鼠腎臟代謝物圖譜，隨后進(jìn)行人腎近端小管

（HK-2）細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，以找出差異代謝物和腎毒性之間的因果關(guān)系。

試驗(yàn)中小鼠總共灌胃 35 天，每周測(cè)量一次體重，得到小鼠的體重變化圖

（圖 1A）。由圖可知，五個(gè)小組的小鼠平均初始體重沒(méi)有顯著差異（p >

0.05）；對(duì)小鼠的終體重進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果如 3.1B 所示。DMSO 處理

組小鼠的最終體重與對(duì)照組相比差異不顯著（p > 0.05），而其余三個(gè)毒素處理

組（AFM1 組、OTA 組、AFM1+OTA 組）的小鼠終體重與對(duì)照組相比差異達(dá)

極顯著（p < 0.01）；根據(jù)小鼠終體重，計(jì)算出小鼠的腎臟指數(shù)，見(jiàn)圖 1C，由

圖可知 DMSO 組、AFM1 組與對(duì)照組相比，小鼠腎臟系數(shù)無(wú)顯著差異（p>

0.05），而 OTA 組及 AFM1+OTA 組與對(duì)照組相比，小鼠腎臟系數(shù)呈極顯著下

降（p< 0.01）。如圖 1D-F，測(cè)定了三個(gè)常見(jiàn)的小鼠腎臟損傷血清生化指標(biāo)：血

尿素氮（BUN）、血清肌酐（SCr）及血尿酸（UA）。與對(duì)照組相比，DMSO

組的三種指標(biāo)均無(wú)顯著差異（p> 0.05），而毒素處理組 AFM1 組及

AFM1+OTA 組中 BUN 值，SCr 值及 UA 值均極顯著上調(diào)（p < 0.01），OTA 組

中 BUN 值及 SCr 值極顯著上調(diào)（p < 0.01），UA 值無(wú)顯著差異。這些表型結(jié)

果表明，OTA 對(duì)腎臟造成顯著的損害，而 AFM1 與 OTA 相比腎毒性作用相似

但有限。

二、研究成果

76

圖 1 單獨(dú)及聯(lián)合的 AFM1 和 OTA 對(duì)小鼠體重、腎指數(shù)和血清生化參數(shù)的

影響。

H&E 染色和 Masson 染色用于評(píng)估單獨(dú)和聯(lián)合的 AFM1 和 OTA 對(duì)腎臟形

態(tài)和纖維化程度的影響（圖 2）。對(duì)照組和 DMSO 組細(xì)胞形態(tài)、大小均勻，膠

原纖維增生不明顯，無(wú)出血、水腫或其他明顯異常。如黑色箭頭所示，毒素處

理組中某些腎小管上皮細(xì)胞輕度水腫變性，細(xì)胞腫脹，胞漿疏松深染。此外，

AFM1 組偶爾出現(xiàn)細(xì)胞變形、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和輕度膠原纖維增生（藍(lán)色區(qū)

域）。OTA 組可見(jiàn)部分細(xì)胞變形，局部組織水腫（模糊區(qū)域），出血（紅色點(diǎn)

狀區(qū)域），膠原增生明顯，腎組織輕度纖維化。AFM1 + OTA 組膠原纖維增生

量多于 OTA 組水平，大量藍(lán)色區(qū)域彌漫，腎細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，進(jìn)入穩(wěn)定的纖維化

期。對(duì)小鼠腎組織膠原纖維面積的統(tǒng)計(jì)分析表明，與對(duì)照組相比，分析表明，

AFM1 +OTA 組的腎組織膠原纖維面積顯著增加（p < 0.05）。

二、研究成果

77

圖 2 單獨(dú)及聯(lián)合的 AFM1 和 OTA 對(duì)腎臟組織形態(tài)和纖維化程度的影響

首先通過(guò)二維主成分（PCA）分析來(lái)觀察代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的樣本方差和組內(nèi)及

組間的分布。PCA 評(píng)分圖顯示各組均無(wú)分離樣本，因此后續(xù)分析均未移除樣本

（圖 3A）。使用 OPLS-DA 分析進(jìn)一步對(duì)樣本進(jìn)行分組和分類。如圖 3B 所示，

與對(duì)照組相比，DMSO 處理未顯著改變小鼠腎臟主要代謝物的總體組成，而毒素

單獨(dú)或聯(lián)合處理改變了代謝物圖譜(如樣本與對(duì)照組和 DMSO 組的距離偏差所

示)。OTA 組和 AFM1 + OTA 組代謝組改變程度更明顯，說(shuō)明 OTA 對(duì)小鼠腎組

織的毒性較 AFM1 強(qiáng)。

圖 3 PCA 分析與 OPLS-DA 分析

UPLC-MS 檢測(cè)和數(shù)據(jù)庫(kù)參考注釋共鑒定出 115 種代謝物。本研究采用

MetaMapp 軟件建立了包含所有 115 種已鑒定代謝物的完整代謝網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)成

對(duì)比較，篩選出差異表達(dá)的代謝物（基于單變量分析：student t 檢驗(yàn) p < 0.05 且

FC 值>1.5）。圖 4A、B、C 和 G 顯示了毒素處理組和 DMSO 組之間比較的結(jié)

二、研究成果

78

果。與 DMSO 組相比，AFM1 處理引起 8 種代謝產(chǎn)物的上調(diào)和下調(diào)；OTA 處理

引起 26 種代謝產(chǎn)物的上調(diào)和 19 種代謝產(chǎn)物的下調(diào)；AFM1 + OTA 處理導(dǎo)致 36

種代謝產(chǎn)物上調(diào)，21 種代謝產(chǎn)物下調(diào)。另一方面，圖 4D、E、F 和 H 繪制了毒

素處理組之間的比較概況。與 AFM1 組相比，OTA 組共有 20 種代謝物發(fā)生顯

著變化，包括 6 種上調(diào)代謝物和 14 種下調(diào)代謝物；AFM1 + OTA 組中總共有

29 種代謝物發(fā)生顯著變化，包括 18 種上調(diào)代謝產(chǎn)物和 11 種下調(diào)代謝產(chǎn)物。然

而，與 OTA 組相比，AFM1 + OTA 組中只有 4 種代謝物有明顯變化，包括 2 種

上調(diào)代謝產(chǎn)物和 2 種下調(diào)代謝產(chǎn)物。這表明，當(dāng)兩種毒素共存時(shí) OTA 可能是產(chǎn)

生主要毒性作用的毒素。

圖 4 差異代謝網(wǎng)絡(luò)分析

如上所述，AFM1 和 OTA 對(duì)腎臟代謝組的調(diào)節(jié)存在一些顯著差異。因此，

我們應(yīng)用熱圖分析，以便對(duì)樣本和組間的代謝組水平進(jìn)行直觀比較（圖 5A）。

由于代謝物在熱圖中的表達(dá)水平是聚集的，因此很容易看出前兩組（DMSO

組，AFM1 組）的代謝模式明顯不同于其他兩組（OTA 組，AFM1 + OTA

組）。如圖 5A 所示，共篩選出 30 種代謝物，符合標(biāo)準(zhǔn)：t 檢驗(yàn) p< 0.05 和

VIP >1.0，溶血磷脂酰膽堿（LysoPCs）為顯著上調(diào)的主要類型，其中 LysoPC

（16:0）所占比例最高；LysoPC（18:1）、LysoPC（18:2）和 LysoPC（22:6）

為次要成分（圖 5B）。OTA 和 AFM1 + OTA 對(duì) LysoPC 提高的影響比 AFM1

單獨(dú)處理更明顯；而 OTA 與 AFM1 + OTA 對(duì) LysoPCs 的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，

再次說(shuō)明 OTA 與 AFM1 聯(lián)合處理時(shí)可能是優(yōu)勢(shì)毒素。

二、研究成果

79

圖 5 小鼠腎組織中差異表達(dá)的代謝物

HK-2 細(xì)胞 Western blotting 結(jié)果顯示，OTA 組和 AFM1 + OTA 組凋亡蛋白

Bax、caspase 3 和 PARP 的表達(dá)水平顯著提高，Bcl-2 蛋白表達(dá)顯著降低；而

AFM1 處理僅顯著提高 caspase 3 的表達(dá)水平（P<0.05）。LysoPC（16:0）而非

LysoPC（18:1）顯著提高了 HK-2 細(xì)胞中 caspase 3 和 PARP 的蛋白水平，并降

低了 Bcl-2 的水平（P<0.05）。

二、研究成果

80

結(jié)論： 本研究首次評(píng)估了 OTA 和 AFM1 聯(lián)合處理導(dǎo)致的腎毒性，我們猜

測(cè)，與 AFM1 相比，OTA 對(duì)腎臟的毒性更為明顯；LysoPC（16:0）是聯(lián)合毒素

處理引起腎損傷的關(guān)鍵代謝產(chǎn)物，可能是敏感而特異的腎毒性生物標(biāo)志物。未

發(fā)現(xiàn) AFM1 和 OTA 在腎病的發(fā)生或發(fā)展中存在明顯的協(xié)同作用。

圖 7 AFM1 和 OTA 單獨(dú)和聯(lián)合處理致小鼠腎損傷的可能機(jī)制

二、研究成果

81

研究成果已于 2021 年 6 月發(fā)表在《Toxicology》雜志。該成果由國(guó)家自然

科學(xué)基金（31972190）、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CALS—36）、農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新

計(jì)劃（ASTIPS IAS12）、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院重大任務(wù)（CAAS-ZDXT201900）等

項(xiàng)目資助，王子微、高亞男、黃鑫為文章第一作者，鄭楠為文章通訊作者。

——Ziwei Wang, Yanan Gao, Xin Huang, Shengnan Huang, Xue Yang, Jiaqi

Wang, Nan Zheng. Metabolomics analysis underlay mechanisms in the renal

impairment of mice caused by combination of aflatoxin M1 and ochratoxin A.

Toxicology 2021, 458: 152835.

二、研究成果

82

赭曲霉毒素 A 通過(guò) WNT/Ca2+信號(hào)通路誘導(dǎo)腸道緊密連接

蛋白損傷機(jī)制

赭曲霉毒素 A（ochratoxin A，OTA）是由某些曲霉菌和青霉屬的真菌菌株

（疣狀芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌、黑曲霉和赭曲霉）產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物。

OTA 是一種廣泛存在的環(huán)境污染物，對(duì)人類和動(dòng)物的健康構(gòu)成了極大的威脅，

仍然是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題，引起了人們的重視。腸道屏障是抵御外來(lái)污

染物的第一道屏障。緊密連接（Tight junction，TJ）附著在腸道上皮細(xì)胞以維

持其結(jié)構(gòu)和細(xì)胞極性，從而維持上皮細(xì)胞的生物學(xué)和屏障功能。TJ 蛋白能阻斷

細(xì)胞間隙，阻止細(xì)菌和毒素進(jìn)入血液循環(huán)，在維持腸道屏障功能方面具有重要

意義。而霉菌毒素可以通過(guò)破壞腸道 TJ 蛋白發(fā)揮毒性作用。本研究的目的是揭

示 OTA 處理 Balb/c 小鼠后，腸道 TJ 蛋白中非編碼（non-coding，nc）RNA 和

mRNA 的表達(dá)模式的變化，并找到 OTA 發(fā)揮腸道毒性作用的關(guān)鍵靶標(biāo)，進(jìn)一

步為 OTA 的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供更全面的理論依據(jù)。

基于 mRNA 測(cè)序，全轉(zhuǎn)錄組構(gòu)建了兩種類型的文庫(kù)（小 RNA 文庫(kù)和核糖

體特異性文庫(kù)），可以同時(shí)分析四種不同 RNA 的數(shù)據(jù)：長(zhǎng)鏈非編碼（lnc）

RNA、環(huán)狀（circ）RNA、微（mi）RNA 和 mRNA。通過(guò) miRNA 和三種 RNA

（lncRNA、circRNA 和 mRNA）的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，可以建立競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源 RNA

（competing endogenous RNA，ceRNA）網(wǎng)絡(luò)，從而更準(zhǔn)確地找到影響生物過(guò)程

的關(guān)鍵 RNA。近年來(lái)，全轉(zhuǎn)錄組分析逐漸成為研究霉菌毒素毒性作用機(jī)制的趨

勢(shì)。但迄今為止，仍缺乏相關(guān)的體內(nèi)研究數(shù)據(jù)，且大多集中在全轉(zhuǎn)錄組的生信

分析上，并未進(jìn)行體外驗(yàn)證試驗(yàn)。本試驗(yàn)通過(guò)體內(nèi)動(dòng)物模型和體外細(xì)胞模型，

結(jié)合全轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析來(lái)研究 OTA 損傷腸道 TJ 蛋白的機(jī)制。Balb/c 小鼠經(jīng) 3

mg/kg b.w. OTA 灌胃 28 天后，取其空腸組織，一方面用于染色觀察、杯狀細(xì)胞

計(jì)數(shù)、緊密連接蛋白的表達(dá)水平的測(cè)定；另一方面用于全轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。血液

用于測(cè)定與腸道通透性相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。體外經(jīng) 20 μM OTA 處理 48 h 的

二、研究成果

83

Caco-2 細(xì)胞用于全轉(zhuǎn)錄組學(xué)的體外驗(yàn)證，其中未分化的細(xì)胞用于 Ca2+水平的測(cè)

定，分化的細(xì)胞用于測(cè)定 TJ 蛋白的表達(dá)水平（圖 1）。

圖 1. 解析 OTA 損傷 TJ 蛋白作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)流程圖。

從灌胃第 1 天開(kāi)始，每隔 2 天稱一次小鼠的體重并記錄，如圖 2a 所示，其

體重從灌胃第 7 天開(kāi)始顯著下降，且小鼠的平均終體重排序?yàn)椋?/p>

CTL>DMSO>OTA。為了更全面地評(píng)價(jià) OTA 誘導(dǎo)的腸道屏障毒性，采用 ELISA

法檢測(cè)了 DAO、D-lactate 和 I-FABP 等關(guān)鍵血液生化指標(biāo)，OTA 可顯著提高 D乳酸和 I-FABP 含量（p<0.05）（圖 2b）。OTA 組小鼠空腸絨毛高度顯著低于

對(duì)照組（p<0.05）（圖 2c, d），絨毛高度與隱窩深度的比值及空腸杯狀細(xì)胞數(shù)

顯著低于對(duì)照組（p<0.05）（圖 2e, f, g）。

二、研究成果

84

圖 2. OTA（3 mg/kg b.w.）對(duì) Balb/c 小鼠空腸結(jié)構(gòu)的影響。（a）OTA 處理

后 Balb/c 小鼠體重的變化。（b）OTA 處理后對(duì)血液生化水平的影響。（c）

OTA 對(duì)小鼠空腸組織絨毛形態(tài)的影響。（d-e）OTA 對(duì)小腸上皮絨毛高度和隱

窩深度的影響。（f-g）OTA 對(duì)小鼠空腸杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響。不同的字母代表

顯著差異。

基于 FC>1.5 和 FDR<0.05，將篩選得到的差異表達(dá)（Differential

expression）mRNA 進(jìn)行 KEGG 富集分析。如圖 3a 所示，OTA 誘導(dǎo)的

DEmRNAs 主要富集在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、PI3K-AKT 信號(hào)通路、MAPK

信號(hào)通路以及 Tight Junction 信號(hào)通路。此外，根據(jù) KEGG 富集的結(jié)果，選擇了

一些關(guān)鍵通路中的關(guān)鍵基因進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）分析。如圖 3b

所示，PPI 分析篩選出 G1/S-特異性周期蛋白-D1（CCND1）、Wnt 家庭成員 5a

（WNT5a）、卷曲類受體 4（FZD4）、Axin2（AXIN2）、肌動(dòng)蛋白 γ1

（ACTG1）和小窩蛋白 1（Cav1）等關(guān)鍵基因，大部分屬于 Wnt 信號(hào)通路。

二、研究成果

85

圖 3. OTA 誘導(dǎo)的 DEmRNA 的分析。（a）DEmRNA 的 KEGG 富集分析。

（b）43 個(gè)關(guān)鍵基因的 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析。

根據(jù)關(guān)鍵基因的功能預(yù)測(cè)和靶向性分析，miR-1258-x（靶向 FZD4、

Cav1、CCND1、Rasgrp3、Foxp1）、mmu-miR-1258-3p（靶向 Plau、E2f5、

Hspb1）、mmu-miR-122-5p（靶向 Wnt5a）、miR-205-z（靶向 Cav1、

Ccm2）、mmu-miR-1981-5p（靶向 Wnt5a）、mmu-miR-1943-5p（靶向 Igf2、

Axin2、Pkd1）和 mmu-miR-146b-5p（靶向 Ccl8，Lgr6）可能是與腸屏障功能

相關(guān)尤其是 TJ 蛋白的關(guān)鍵分子（圖 4a）。

在對(duì) DElncRNA 的靶向 DEmRNAs 進(jìn)行功能預(yù)測(cè)后，如圖 4b 所示，

DElncRNAs Zeb1、Stk36、Phkb、Prss23、Inpp5e 和 Gm28588 與腸道 TJ 蛋白緊

密相關(guān)。

二、研究成果

86

圖 4. 關(guān)鍵差異表達(dá) RNA 兩兩互作分析。（a）DEmiRNA-DEmRNA 互作

網(wǎng)絡(luò)，（b）DEncRNA-DEmRNA 互作網(wǎng)絡(luò)。

基于關(guān)鍵 miRNA-mRNA 和 lncRNA-mRNA 靶向關(guān)系對(duì)，ceRNA 分析進(jìn)一

步解析 ncRNAs 和 mRNAs 在腸道 TJ 蛋白中的作用。圖 5a 揭示了與 TJ 蛋白相

關(guān)的 DEmRNA 和 DEncRNA 之間的關(guān)系。對(duì)關(guān)鍵 DEmRNAs 的分析表明，

WNT/Ca2+信號(hào)級(jí)聯(lián)在 OTA 誘導(dǎo)的 TJ 蛋白損傷中起關(guān)鍵作用，且 KEGG 分析表

明 FZD4、WNT5a 和 Cav1 參與調(diào)節(jié) Ca2+水平。通過(guò) ceRNA 分析，發(fā)現(xiàn)了參與

鈣信號(hào)調(diào)節(jié)的上游靶標(biāo) DEmiRNAs 和 DElncRNAs。結(jié)果顯示 lncRNA Zeb1 通

過(guò)靶向 miR-1258-x 調(diào)節(jié) FZD4 與 WNT5a 結(jié)合的表達(dá)，從而激活 Ca2+信號(hào)級(jí)

聯(lián)。此外，Cav1 和幾種 lncRNAs 與 miR-205-z 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合以調(diào)節(jié) Ca2+的釋放。

為了確定 Ca2+對(duì) TJ 蛋白表達(dá)的影響，我們采用體外 Caco-2 細(xì)胞模型進(jìn)行

進(jìn)一步驗(yàn)證。結(jié)果表明，OTA 顯著增加了 Ca2+的水平（圖 5b），并且降低了

TJ 蛋白的表達(dá)水平。當(dāng)加入 Ca2+抑制劑 BAPTA-AM 時(shí)，TJ 蛋白的表達(dá)水平顯

著高于單獨(dú)使用 OTA 的表達(dá)水平（圖 5c,d）。以上結(jié)果表明 Ca2+水平的增加降

低了 TJ 蛋白的表達(dá)水平。

二、研究成果

87

圖 5. OTA 損傷腸道 TJ 靶標(biāo)的篩選。（a）OTA 損傷 Balb/c 小鼠 TJ 蛋白的

lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA 網(wǎng)絡(luò)。橢圓代表 mRNA，V 形代表 miRNA，菱

形代表 lncRNA。（b）OTA 處理后 Ca2+水平的變化。（c，d）OTA 和 BAPTAAM 對(duì) claudin-4/ocludin 表達(dá)的影響。不同字母表示顯著差異。BA 代表

BAPTA-AM。

結(jié)論：基于體內(nèi)全轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)合體外細(xì)胞驗(yàn)證表明，OTA 通過(guò)

WNT/Ca2+信號(hào)通路損傷緊密連接蛋白，存在的上游機(jī)制為：（i）lncRNA-Zeb1

通過(guò)靶向 miR-1258-x 調(diào)節(jié) FZD4 與 WNT5a 結(jié)合釋放 Ca2+；（ii）miRNA-1258-

x 調(diào)節(jié) Cav1 的表達(dá)，控制細(xì)胞外 Ca2+進(jìn)入。該研究成果為解析 OTA 的腸道毒

性機(jī)制，挖掘毒性作用靶標(biāo)提供了重要指導(dǎo)。

摘要圖 OTA 損傷 TJ 蛋白的作用機(jī)制

二、研究成果

88

研究成果已于 2021 年 9 月發(fā)表在《Ecotoxicology and Environmental

Safety》雜志。該研究得到國(guó)家自然科學(xué)基金、中國(guó)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究體

系、農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新重大成果科研項(xiàng)目和農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目資助。楊雪、高

亞男為文章第一作者，通訊作者為鄭楠。

——Xue Yang, Yanan Gao, Shengnan Huang, Chuanyou Su, Jiaqi Wang, Nan

Zheng. Whole transcriptome-based ceRNA network analysis revealed ochratoxin Ainduced compromised intestinal tight junction proteins through WNT/Ca2+ signaling

pathway. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2021, 224: 112637.

二、研究成果

89

黃曲霉毒素 B1 和 M1 通過(guò)內(nèi)吞作用誘導(dǎo)腸道完整性損傷的

機(jī)制

一 、研究背景

霉菌毒素黃曲霉毒素 B1（AFB1）廣泛存在于農(nóng)作物中，是由包括黃曲霉

和寄生曲霉等霉菌產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物，黃曲霉毒素 M1（AFM1）是牛奶

中唯一具有最大限量的霉菌毒素。在黃曲霉毒素的幾種亞型中，AFB1 的毒性

最強(qiáng)，因此 AFB1 被世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）認(rèn)定為 1 級(jí)致癌

物。同時(shí)，IARC 在 2002 年，將 AFM1 對(duì)人類致癌物等級(jí)從 2 級(jí)升為 1 級(jí)。

結(jié)構(gòu)完整的腸上皮具有許多關(guān)鍵功能，保證動(dòng)物和人類的福利和健康。腸

上皮不僅可促進(jìn)從腸腔吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且可作為抵御外部污染物的第一道屏

障，防止各種有毒化合物進(jìn)入人體。腸道屏障的破壞可能會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的激

活，從而威脅人類健康。相鄰細(xì)胞間的緊密連接 (TJ) 蛋白是腸道屏障的主要功

能成分。已經(jīng)有研究報(bào)道證明，TJ 蛋白可以通過(guò)內(nèi)吞作用被內(nèi)化，隨后在體內(nèi)

被降解。

本研究的目的是利用體內(nèi)和體外模型，評(píng)估 AFB1 和 AFM1 對(duì)腸屏障影響

的聯(lián)合毒性及其機(jī)制。體內(nèi) ICR 小鼠的血清生化指標(biāo)和腸道組織檢測(cè)的結(jié)果表

明，AFB1 和 AFM1 可影響與腸道屏障完整性相關(guān)的血清生化指標(biāo)、損傷腸道

組織形態(tài)和 TJ 蛋白的分布。分化 Caco-2 細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)分析了 AFB1 和

AFM1 對(duì)腸道屏障功能表型和機(jī)制的影響。本研究中的體內(nèi)和體外結(jié)果首次表

明 AFB1 和 AFM1 聯(lián)合作用可導(dǎo)致腸道屏障受損，并且受損機(jī)制與網(wǎng)格蛋白介

導(dǎo)的內(nèi)吞作用相關(guān)。此外，我們的結(jié)果表明， AFB1 和 AFM1 損傷腸屏障功能

主要為協(xié)同作用。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 試驗(yàn)動(dòng)物

二、研究成果

90

本實(shí)驗(yàn)所用 40 只 ICR 小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司

（Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.），雄性，健康且精

神狀態(tài)良好，清潔級(jí)別為 SPF 級(jí)別，均為 4 周齡左右，體重均在 20±2g 范圍

內(nèi)。7 天適應(yīng)期后，40 只小鼠隨機(jī)分為 4 組，即對(duì)照組（1% DMSO）、AFB1

單獨(dú)處理組（0.3 mg/kg b.w.）、AFM1 單獨(dú)處理組（3.0 mg/kg b.w.）和混合毒

素 AFB1+ AFM1 處理組（0.3 mg/kg b.w.+ 3.0 mg/kg b.w.）。處理組的小鼠每天

灌胃一次（0.2ml/只小鼠），持續(xù)四周，并一周 2 次稱重。第 29 天，用二氧化

碳對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)死。

采集到的小鼠腸道組織固定在 10%福爾馬林緩沖液中，用于隨后的組織學(xué)

評(píng)估和免疫組織染色。并從小鼠眼眶取血。所有動(dòng)物程序均按照中國(guó)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

指南進(jìn)行，符合國(guó)際公認(rèn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用原則。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到了中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)

院北京畜牧獸醫(yī)研究所倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（Beijing, China, IAS 2019-3）。

2. 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

20-35 代 Caco-2 細(xì)胞應(yīng)用在本研究中，Caco-2 細(xì)胞生長(zhǎng)在 5%CO2，95%濕

度，37℃的培養(yǎng)環(huán)境下。培養(yǎng)基為 DMEM，其中包含 10%胎牛血清、4.5g/l L谷氨酰胺，雙抗（100 units/ml 青霉素和 100 μg/ml 鏈霉素）以及 1%的非必需氨

基酸。培養(yǎng) 3 天后，細(xì)胞匯合度達(dá)到 80%，將細(xì)胞用胰酶消化下來(lái)，并且以

40,000 細(xì)胞/cm2 的密度種到 Transwell 培養(yǎng)板中。連續(xù)培養(yǎng) 21 天，每?jī)商鞊Q液

一次，期間用 Millicell-ERS 電阻儀測(cè)定細(xì)胞間的跨膜電阻(TEER)值，當(dāng) TEER

值達(dá)到 300 ?.cm2 時(shí)，即可證明 Caco-2 細(xì)胞分化完成。AFB1 和 AFM1 被添加

到 Transwell 板的上室中孵育 48 h。

3. 血液生化指標(biāo)檢測(cè)

采集的血樣在 37℃下凝固 1-2 h（不含抗凝劑），然后在 4℃下，以 4000

轉(zhuǎn)/分的速度放置在離心機(jī)離心 10 分鐘，以獲得上清液（血清）。通過(guò)

HITACHI 7080 全自動(dòng)生化分析儀和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測(cè)定與腸屏障

功能相關(guān)的血清生化參數(shù)，包括 Cit、DAO、I-FABP 和 D-乳酸。

4. 小鼠回腸的組織形態(tài)學(xué)評(píng)估

二、研究成果

91

迅速利用預(yù)冷的 PBS 沖洗解剖得到的回腸內(nèi)容物，放入 10%福爾馬林溶液

中固定 24 h 以上，沖洗后包埋，利用切片機(jī)切蠟帶，制作腸道組織石蠟切片。

將石蠟切片置于二甲苯中 10 min，脫蠟完成后，將切片依次置于不同濃度酒精

中，最后放入蒸餾水中。隨后置于蘇木精中 10 min，移入水中洗去殘液，置于

1%鹽酸酒精中分化 3-30 秒，再移入水中洗滌 30 min。再置于伊紅染液中 2-5

min，入水洗去染液。置于 80%酒精中脫水 5 min，再入 90%酒精中脫水 5

min，移入二甲苯中透明后，最后用中性樹(shù)膠固片，晾干后即可。每組取 6 只小

鼠的回腸組織，每個(gè)區(qū)段取 3 個(gè)不同位置制作切片，在顯微鏡下觀察 HE 染色

后的小腸絨毛形態(tài)，并在每張切片上選取 5 根絨毛，測(cè)定絨毛長(zhǎng)度和隱窩深

度，計(jì)算兩者的比值。

5. 細(xì)胞毒性的測(cè)定

CCK-8 實(shí)驗(yàn)用來(lái)測(cè)定在不同組合霉菌毒素的處理下細(xì)胞存活率。在處理之

前，以 6×104 細(xì)胞/ml 的密度接種在 96 孔培養(yǎng)板中貼壁培養(yǎng) 24 h。接著，加入

不同濃度及組合的霉菌毒素處理細(xì)胞，AFB1 和 AFM1 (0.5, 1, 2, 4 和 8 μg/ml)。

48 h 后，移除包含著霉菌毒素的培養(yǎng)基，再加入 100 μl CCK-8 試劑，在培養(yǎng)箱

中孵育 2 h。最后，將 96 孔培養(yǎng)板放入酶標(biāo)儀中，在 450nm 處測(cè)定吸光度。

6. TEER 值測(cè)定

TEER 值是測(cè)定細(xì)胞間完整性最方便的方法。在培養(yǎng)分化 Caco-2 細(xì)胞的

Transwell 板的上室和小室中分別加入單獨(dú)和混合的 AFB1 和 AFM1 (0.5, 1, 2, 4

和 8 μg/ml)，處理 48 h 后，測(cè)定 TEER 值。

7. 免疫熒光染色

利用激光共聚焦顯微鏡觀察緊密連接蛋白的定位。單獨(dú)及混合 AFB1 和

AFM1 處理分化 Caco-2 細(xì)胞 48 h。處理后，細(xì)胞用 4%多聚甲醛固定 10 min，

隨后用 0.1%Triton X-100 做透化處理 5 min。細(xì)胞用封閉液封閉 1.5 h，然后孵

育 claudin-3、claudin-4、ZO-1、occludin 一抗 1.5 h，隨后細(xì)胞用熒光二抗避光

室溫孵育 45 min。細(xì)胞利用 LSM780 激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。

8. 緊密連接蛋白水平的測(cè)定

二、研究成果

92

PCR 和 Western blot 試驗(yàn)分別用來(lái)測(cè)定緊密連接蛋白的 mRNA 和蛋白水

平。分化 Caco-2 細(xì)胞被裂解后，用上樣緩沖液混合均勻，電泳。PVDF 膜利用

5%脫脂牛奶室溫下封閉 1.5 h。接下來(lái)，claudin-3、claudin-4、ZO-1、

occludin、β-actin 一抗室溫孵育 3 h。相對(duì)應(yīng)的二抗室溫孵育 1 h?；叶戎道?/p>

ImageJ 軟件分析。

三、結(jié)果與討論

圖 1 展示的是小鼠暴露于單獨(dú)及混合的 AFB1 和 AFM1 對(duì)腸道屏障相關(guān)的

血液指標(biāo)的影響。如圖所示，AFM1 單獨(dú)灌胃組及 AFB1 單獨(dú)灌胃組小鼠血液

中瓜氨酸（Cit）含量與對(duì)照組相比差異不顯著（p > 0.05）；AFB1 與 AFM1

聯(lián)合灌胃組小鼠血液中瓜氨酸（Cit）含量顯著低于對(duì)照組及單獨(dú)灌胃組（p <

0.05）。AFM1 單獨(dú)灌胃組小鼠血液中 DAO 活性顯著高于對(duì)照組（p <

0.05），AFB1 單獨(dú)灌胃及其與 AFM1 聯(lián)合灌胃組小鼠血液中瓜氨酸含量顯著

高 AFM1 單獨(dú)灌胃組（p < 0.05）。AFM1 單獨(dú)灌胃組及 AFB1 與 AFM1 聯(lián)合

灌胃組小鼠血液中腸型脂肪酸結(jié)合蛋白（I-FABP）含量顯著高于對(duì)照組（p <

0.05），且 AFB1 與 AFM1 聯(lián)合灌胃組顯著高于 AFM1 單獨(dú)灌胃組（p <

0.05）；各處理組小鼠血液中 D-乳酸(D-lactate)含量均顯著高于對(duì)照組（p <

0.05），AFB1 與 AFM1 聯(lián)合灌胃組小鼠血液中 D-乳酸含量顯著高于單獨(dú)灌胃

組（p <0.05）。

二、研究成果

93

圖 1. AFB1 和 AFM1 誘導(dǎo)小鼠腸道屏障相關(guān)血液指標(biāo)的變化

如圖 2 所示，灌胃結(jié)束時(shí)，三個(gè)處理組小鼠回腸絨毛長(zhǎng)度值均顯著低于對(duì)

照組（p < 0.05），且 AFB1 與 AFM1 聯(lián)合灌胃組顯著低于兩個(gè)毒素單獨(dú)灌胃組

（p < 0.05）；各處理組小鼠回腸絨毛隱窩深度值均顯著高于對(duì)照組（p <

0.05），但三個(gè)處理組間差異不顯著（p > 0.05）；三個(gè)處理組小鼠回腸絨毛長(zhǎng)

度與隱窩深度的比值均顯著低于對(duì)照組（p < 0.05），且 AFB1 與 AFM1 聯(lián)合

灌胃組顯著低于兩毒素單獨(dú)灌胃組（p < 0.05），兩毒素單獨(dú)灌胃組間差異不顯

著（p > 0.05）。

圖2. AFB1和AFM1誘導(dǎo)小鼠回腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化

二、研究成果

94

如圖 3 所示，與對(duì)照組相比，低濃度（0.5 μg/mL）的 AFB1 和 AFM1 即使

以混合方式處理，也不會(huì)顯著降低 TJ 蛋白轉(zhuǎn)錄水平（p＞0.05）。與單獨(dú)毒素

處理相比，混合 AFB1 和 AFM1 在 0.5 μg/mL 濃度下導(dǎo)致 TJ 蛋白 mRNA 表達(dá)更

嚴(yán)重的下調(diào)。4 μg/mL AFB1 導(dǎo)致 TJs mRNA 表達(dá)顯著降低（p<0.05），而 4

μg/mL AFM1 中未發(fā)現(xiàn)這種影響。然而，盡管 AFB1 和 AFB1+AFM1 聯(lián)合處理

組之間沒(méi)有顯著差異（p＞0.05），但 4 μg/mL AFM1 有加劇 AFB1 誘導(dǎo)的 TJ 蛋

白破壞的趨勢(shì)。

如圖 4 所示，4 μg/mL AFB1 及混合毒素可導(dǎo)致乳酸脫氫酶含量顯著升高

（圖 4A），對(duì)細(xì)胞造成損傷。但加入網(wǎng)格蛋白抑制劑（氯丙嗪，CP），AFB1

和 AFM1 誘導(dǎo)的細(xì)胞跨膜電阻（TEER）值的增加得到抑制（圖 4B），同時(shí)緊

密連接蛋白的內(nèi)化作用得到緩解（圖 4C）。結(jié)果表明，AFB1 和 AFM1 可通過(guò)

網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用誘導(dǎo)腸道完整性受損。

二、研究成果

95

圖3. AFB1與AFM1對(duì)分化Caco-2細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)與定位的影響

圖4. AFB1與AFM1誘導(dǎo)分化Caco-2細(xì)胞緊密連接蛋白內(nèi)化