袁濱 等 毛木耳發(fā)酵料堆細菌群落多樣性分析
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全長 16S rRNA 序列,在不考慮測序平臺、測序
質量等條件下,模擬對比 6 個常用連續(xù)擴增區(qū)域
發(fā)現(xiàn),V3-V4 區(qū)和 V4-V5 區(qū)在各分類層級鑒定的
準確性最高。在微生物多樣性的分析時,可優(yōu)先
選擇 V3-V4 區(qū)。因此,本研究擬采用 16S rDNA
的 V3-V4 區(qū)進行發(fā)酵料微生物多樣性分析。
PCR 擴增條件如下:94℃ 2 min,然后 98℃
10 s,62℃ 30 s (16S V4 區(qū)時,為 55℃ 30 s),
68℃ 30 s 進行 30 個循環(huán),最后 68℃ 5 min。使
用擴增引物 341F: CCTACGGGNGGCW GCAG;
806 R: GGACTACHVGGGTATCTAAT,產物片段
長度約為 466 bp。PCR 反應進行一式 3 份。擴增
體系:50 μL 混合物,包含 5 μL 10×KOD 緩沖液,
5 μL 2 mmol/L dNTPs,3 μL 25 mmol/L MgSO4,
1.5 μL 下游引物(10 μmol/L),1 μL KOD 聚合
酶,100 ng 模板 DNA。從 2%瓊脂糖凝膠中搜集
擴增子,使用 AxyPrep DNA 凝膠提取試劑盒
(Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)
按照制造商的說明進行純化,并使用 ABI StepOnePlus 實時 PCR 系統(tǒng)(Life Technologies,F(xiàn)oster
City,USA)進行定量。純化后的擴增子根據
Illumina 平臺進行 PE250 模式上機測序。該項工
作委托廣州基迪奧生物科技有限公司完成。
(3)OTU 聚類與 PCA 分析 使用 Uparse
(Edgar, 2013)軟件將測序獲得的 Clean tags 進行聚
類,設置相似度≥97%聚類為同一個操作分類單
元(Operational taxonomic units, OTU)。采用
UCHIME 算法對 Clean tags 存在的嵌合體進行檢
查和過濾,獲得的 Effective tags 進行 OTU 豐度統(tǒng)
計和其他后續(xù)分析。選取豐度最高的 Tag 作為每
個 OTU 的代表序列,計算每個 OTU 在各個樣品
中的 tags 豐度信息?;?OTU 列表的物種豐度
信息,進行主成分分析(PCA,Principal Component
Analysis);基于歐式距離(Euclidean distances)
進行方差分解,對多維數(shù)據進行降維,從而提取
出數(shù)據中最主要的元素和結構,研究樣本間的組
成距離關系。分析結果中,樣品微生物組成越相
似,反映在 PCA 圖中的距離越近。
(4)稀釋曲線及α多樣性分析 稀釋曲線
(Rarefaction curve)用于評價測序量是否足以覆
蓋所有類群。不同階段的發(fā)酵料 ACE 指數(shù)的稀釋
曲線,反映物種豐富度的變化趨勢,ACE 指數(shù)越
大,表明物種豐富度越高。采用α多樣性指數(shù)
Shannon、Simpson 和 Pielou 分析樣品中微生物群
落多樣性與復雜度,指數(shù)越高表明群落多樣性越
高。采用 UPGMA 2.2.1(非加權組平均法)展現(xiàn)
各個樣品的關系和樣品分組。
(5)物種組成分析 利用注釋軟件 RDP 2.2
(Edgar, 2013)將 OTU 代表序列比對到 SILVA 數(shù)據
庫,進行物種分離注釋,設置閾值為 0.8~1.0。根
據不同樣品的微生物物種組成分布,采用 R 語言
ggplot 2 包繪制物種豐度堆疊圖。
(6)指示物種分析 采用 R 語言 labdsv 包計
算比較組各個樣品中豐度值>0 且總占比>0.1%的
物種在每個分組的 indicator value,找出各個組的
指示物種。使用 cross-validation 進行統(tǒng)計檢驗,
獲得 P 值。
2 結果與分析
2.1 培養(yǎng)料發(fā)酵效果與營養(yǎng)成分變化情況
培養(yǎng)料剛堆積發(fā)酵時升溫較慢,36 h 后料堆
50 cm 深處料溫達到 52℃,之后逐漸上升,至第
3 天后料溫達到 65~73℃,保持約 3 d,之后料溫
逐漸下降,料溫降至約 60℃前開始翻堆,翻堆后
當天料溫即可達 50℃以上,并快速上升,2 d 后
料溫達到 65~70℃。毛木耳培養(yǎng)料發(fā)酵后期,料
堆高溫保持的時間逐漸減少,料溫下降速度增加,
若沒有及時翻堆,料堆表面溫度過低,可能會出
現(xiàn)墨汁鬼傘,浪費培養(yǎng)料營養(yǎng),而且料堆底部會
因缺氧而局部厭氧發(fā)酵,因此后期翻堆間隔時間
逐漸縮短。發(fā)酵成功的培養(yǎng)料,顏色由本色逐漸
變?yōu)榛液稚琾H 約 7.5,有大量白色放線菌等有
益菌的生長,料堆沒有刺鼻的氨味,而是有一股
清香味。
發(fā)酵前后,培養(yǎng)料營養(yǎng)成分發(fā)生較大的變化。
從表 1 可以看出,培養(yǎng)料全氮含量從發(fā)酵前的
0.43%提高至發(fā)酵后的 0.83%,C/N 從 88.0 降低至
43.92;粗纖維含量從 45.88%減少至 39.56%,可
溶性糖含量減少更加顯著,從 1.95%減少至
0.52%。發(fā)酵前后,全氮含量增加了 93.02%,粗
纖維和可溶性糖含量分別減少了 13.78% 、
73.33%。真菌是喜糖生物,在形成菌落初期主要
利用葡萄糖、果糖等可溶性糖類,發(fā)酵料不容易
感染鏈孢霉可能與可溶性糖等物質的減少有關。