熱帶作物學報 2023, 44(11): 2179?2187

Chinese Journal of Tropical Crops

收稿日期 2023-02-02；修回日期 2023-02-17

基金項目 國家自然科學基金項目（No. 32260419）；研究生創(chuàng)新課題（No. 2022ZKY463）。

作者簡介 臧 睿（1998—），女，碩士研究生，研究方向：分子植物育種。*通信作者（Corresponding author）：和鳳美（HE Fengmei），

E-mail：hefengmei918@126.com。

mRNAs/microRNAs 調控網絡探索石斛花型差異分子機理研究

臧 睿，陳 宇，趙 美，郝玉恒，敖 疊，李凱莉，方詩迪，趙奇明，

和鳳美*

云南農業(yè)大學園林園藝學院，云南昆明 650201

摘 要：目前蘭科植物花型多樣性形成分子機理仍不清楚，本研究對鐵皮石斛、美花石斛花器官進行轉錄組和 microRNA

測序，通過 cytoscape 構建 miRNA-mRNA 網絡和靶基因蛋白互作網絡并進行差異比較，以期在分子水平上探究 2 種石斛

花型差異分子機理。轉錄組研究結果表明，與花發(fā)育相關的 mRNAs 有 MADS-box AP3 基因、激素類基因等。miRNA-mRNA

網絡分析表明，差異表達的 miRNAs、mRNAs 參與了花型差異形成，miR5179 與靶基因 AP3、miR160 與靶基因 ARFs、

miR164 與靶基因 NAC021、miR159 與靶基因 GAM1、bdi-miR159 與靶基因 CKX9、miR167b-3p 與靶基因 ANT 可能參與

花型形成，以上 miRNA 均在鐵皮石斛中上調表達。蛋白互作通路表明，2 種石斛有 AP3 這一關鍵基因，美花石斛缺少

CUL1、TIR1、TIR1A、RBS 四個基因；2 種石斛的生長素反應互作通路中存在 2 個差異表達的 ARFs 基因，美花石斛缺失

1 個 ARFI 基因；美花石斛特異性地擁有由 NAC021 基因構成的生長素信號轉導靶基因蛋白互作通路。鐵皮石斛和美花石

斛花型差異表達 miRNAs/mRNAs 以及靶基因蛋白互作差異可能是導致 2 種石斛花型差異的主要機理。

關鍵詞：鐵皮石斛；美花石斛；花型；轉錄組；small RNA；調控網絡

中圖分類號：S682.31 文獻標識碼：A

Differential Molecular Mechanism of Dendrobium Flower Pattern

Using mRNAs/microRNAs Regulatory Network

ZANG Rui, CHEN Yu, ZHAO Mei, HAO Yuheng, AO Die, LI Kaili, FANG Shidi, ZHAO Qiming,

HE Fengmei*

College of Horticulture and Landscape, Yunnan Agricultural University, Kunming, Yunnan 650201, China

Abstract: The molecular mechanism of the formation of flower diversity is still unclear. In this study, the transcriptome

and microRNA sequencing of Dendrobium officinale and D. loddigesii flower organs were performed, and the

miRNA-mRNA network and target protein interaction network were constructed by cytoscape and compared at the molecular level. The results of transcriptome studies showed that mRNAs related to flower development had MADS-box

AP3 gene, hormone genes, etc. The miRNA-mRNA network analysis showed that the differentially expressed miRNAs

and mRNAs were involved in the differential formation of floral pattern, and miR5179 and its target genes AP3, miR160

and their target genes ARFs, miR164 and its target genes NAC021, miR159 and the target genes GAM1, bdi-miR159 and

the target genes CKX9, miR167b-3p and the target genes ANT may be involved in floral pattern formation, and the above

miRNA was upregulated in D. officinale. The protein interaction pathway showed that two kinds of dendrobium had the

key gene of AP3, D. loddigesii lacked four genes: CUL1, TIR1, TIR1A and RBS; there weret wo differentially expressed

ARFs genes in the auxin response interaction pathway of two Dendrobium, and D. loddigesii lacked one ARFI gene; D.

loddigesii flora specifically possessed the protein interaction pathway of auxin signal transduction target genes constituted

by the NAC021 gene. Differential expression of miRNAs/mRNAs in D. officinale and D. loddigesii and protein interaction

of target genes may be the main mechanisms leading to the difference between the two Dendrobium flower types.

2180 熱帶作物學報 第 44 卷

Keywords: Dendrobium officinale; Dendrobium loddigesii; flower pattern; transcriptome; small RNA; regulatory network

DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2023.11.005

MicroRNAs（miRNAs）是由單鏈前體（premiRNAs）自發(fā)配對形成發(fā)夾狀結構，并在轉錄后

通過介導靶基因 RNA 的降解或抑制蛋白質的翻

譯調控基因表達的非編碼小 RNA（small RNAs,

sRNAs）。在植物葉和根的形態(tài)發(fā)生、花的誘導、

器官發(fā)生、繁殖和脅迫響應等逆向生物學過程中

發(fā)揮重要作用[1-3]。根據前人研究意大利蘭的花序

中一個 MADS-box/DEF-like（AP3）轉錄本被

miR5179 同源物所切割[4]，在水稻中存在 miR5179

靶向調控 MADS-box 類基因[5]。AP3 基因有調控

多元化花被片和唇瓣的功能，表明在進化過程中

存 在 miRNA 介導的花發(fā)育調控機制。此外

miRNA172 作為 AP2 的負調控因子可抑制 AP2

基因表達，花期提前，使花瓣數目減少[6-7]。蘋果、

擬南芥中均有 miR160-Auxin 響應因子（ARF）[8-9]。

miR164 家族（miR164a, miR164b, miR164c）與其

靶基因 NAC（CUC1 與 CUC2）間的關系決定了植

物花型的完整性 [10] 。在春蘭中，

miR319/TCP4-miR396/GRF 聯(lián)級調控多膜細胞增

殖發(fā)育[11]。

目前對花模式和花型發(fā)育的分子機制的了

解還很有限，蘭科植物花器官高度特化，形態(tài)多

樣，為花的形態(tài)調控分子機理的研究提供了素材

模式[12-13]。鐵皮石斛（D. officinale）和美花石斛

（D. loddigesii）花器官迥異，唇瓣形態(tài)差異巨大，

鐵皮石斛唇瓣為反折的卵狀披針形，美花石斛的

唇瓣邊緣具短流蘇呈筒狀向內翻卷的近圓形[14]，

是研究花器官形態(tài)差異分子機理的理想材料。本

研究通過高通量測序技術檢測 2 種石斛的差異顯

著的花器官，對 microRNA 和 mRNA 表達譜進行

分析，構建 miRNA-mRNA 調控網絡，以期識別

對 2 種花型形成起到調控作用的差異 miRNAs 及

調控的靶點，以及靶基因互作差異，以期了解石

斛屬植物負責調控花被表型及調控花形態(tài)發(fā)生的

分子調控機制，并為未來蘭花分子植物育種提供

一定科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所采用的鐵皮石斛、美花石斛組織培

養(yǎng)苗種植于云南農業(yè)大學園林園藝學院基地大

棚，開花時期采摘其花蕾放入液氮凍存。

1.2 方法

1.2.1 轉錄組及 micro RNA 文庫的構建與測序

采用 Trizol 試劑分別提取鐵皮石斛和美花石斛不

同大小花蕾總 RNA，cDNA 文庫和小 RNAs 文庫

構建和測序方法參考文獻[15-19]，測序工作由上

海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.2.2 轉錄組功能注釋 使用 Diamond 軟件在

NR、Swiss-Prot、COG 數據庫進行序列比對，使

用 Blast2g、HMMER 軟件分別在 GO、Pfam 數據

庫比對，使用 KOBAS2.1 軟件獲得 KEGG

Orthology 結果。

1.2.3 miRNAs 鑒定 在 Illumina 測序平臺進行

small RNA 測序。測序得到的原始數據經過濾后

得到有效序列，有效序列經比對和軟件預測分別得

到鐵皮石斛和美花石斛文庫，以及保守 miRNAs 和

新 miRNAs，具體方法參考文獻[20-21]。

1.2.4 DEGs 分析 利用 RSEM 分析表達水平，

定量指標為 TPM（transcripts per million reads）。

基于表達量定量結果，使用 DEGseq 進行組間差

異基因分析，對不同樣品間的 raw counts 進行標

準化處理，|log2FC|≥1 & padjust<0.001 作為過濾

條件，篩選差異表達的 miRNAs 和 mRNAs，采

用 BH（fdr correction with Benjamini/Hochberg）

對 P-value 進行矯正。

1.2.5 miRNA- mRNA 調控網絡的構建 使用

psRobot 預測 miRNAs 的靶基因，對 miRNA 與

mRNA 的表達量進行關聯(lián)分析，獲得表達相關性

（正調控或負調控），使用 Cytoscape 軟件可視化。

設置 TSS 上游 5000 到下游 1000，P-value 閾值

（FIMO）為 0.000 05。

1.2.6 蛋白互作網絡構建 使用 STRING 數據庫

進行蛋白互作網絡分析，獲得蛋白互作關系

（protein-protein interaction, PPI），將所得結果導入

Cytoscape 軟件中進行可視化處理，構建 PPI 網絡。

2 結果與分析

2.1 鐵皮石斛、美花石斛的花器官形態(tài)學特征

比較分析

鐵皮石斛與美花石斛花型有很高觀賞價值，

其中唇瓣是主要觀賞部位，表形差別最大。鐵皮

第 11 期 臧 睿等：mRNAs/microRNAs 調控網絡探索石斛花型差異分子機理研究 2181

石斛具長圓披針形萼片和花瓣，萼片長約 1.8 cm，

寬 4~5 mm，具 5 條脈；唇瓣基部具 1 個綠色或黃

色的胼胝體，卵狀披針形，中部反折（圖 1A）。

美花石斛花瓣與萼片近似呈卵狀披針形，寬

8~9 mm；唇瓣近圓形，直徑 1.7~2.0 cm，上面中

央金黃色，呈筒狀向內翻卷，邊緣具短流蘇，兩

面密布短柔毛（圖 1B）。

圖 1 鐵皮石斛（A）和美花石斛（B）完全

開放的花器官

Fig. 1 Fully open floral organs of D. officinale

(A) and D. oddigesii (B)

2.2 轉錄組測序組裝及分析

本研究檢測到 2 種石斛的表達基因共 26 789

個。鐵皮石斛 25 821 個，其中已知基因 21 169

個，新基因 4652 個；美花石斛 21 586 個，其中

已知基因 19 546 個，新基因 2040 個。共有 22 724

（88.01%）、21 058（97.55%）個序列得到注釋。

2.3 花發(fā)育、激素反應相關基因分析

鐵皮石斛中獲得 92 個與花發(fā)育相關的基因，

根據功能注釋和序列比對，其中 AP2 類基因 6 個，

MADS-box 家族基因 63 個，NAC 類基因 4 個，

MYB 類基因 3 個，TCP 家族基因 16 個（圖 2）。

美花石斛中獲得 69 個與花發(fā)育相關的基因，其中

AP2 類基因 6 個，MADS-box 家族基因 42 個，

NAC 類基因 5 個，MYB 類基因 2 個，TCP 家族

基因 14 個（圖 3）。與激素反應（Auxin、GA、

CTK、ABA、BR）有關的基因，鐵皮石斛中有

206 個，美花石斛中有 193 個。

2.4 miRNA 分析及靶基因預測

sRNA 統(tǒng)計中鐵皮石斛、美花石斛的 miRNA

序列分別有 226 904、79 225 個。而 miRNA 成熟

體分別為 2755、2230 個，其中 2600、2185 個為

已知 miRNAs，155、45 個為未知 miRNAs。鐵皮

石斛、美花石斛中表達量最高的是 miR319 家族，

此外，miR535、miR159 和 miR171 家族等也有高

豐度的表達。

圖 2 鐵皮石斛與花型發(fā)育有關基因統(tǒng)計

Fig. 2 Statistics of genes involved to floral

development in D. officinale

圖 3 美花石斛與花型發(fā)育有關基因統(tǒng)計

Fig. 3 Statistics of genes involved to floral

development in D. loddigesii

鐵皮石斛有 2496 個 miRNA 預測到了 1264

個靶基因，6 個未知 miRNAs；美花石斛有 2076

個 miRNA 預測到了 1609 個靶基因，2 個未知

miRNAs，根據其靶向關系，存在一個基因被多個

miRNA 靶向，一個 miRNA 靶向多個基因。這些

miRNA 的靶基因大多被歸類為轉錄因子，如

MADS-box 轉錄因子（miR5179）、MYB 家族轉

錄因子（miR159、miR319）等。其他一些基因被

歸類為功能性基因蛋白質，如 F-box 蛋 白

（ miR393、 miR394）、cytokinin dehydrogenase

4-like（miR159）等，均參與植物的代謝和環(huán)境刺

激反應。Novel miRNA 的靶基因大多歸類為未知

功能基因。

2.5 與花型發(fā)育有關的 miRNA 及其靶基因

本項目擁有 2 個共表達的 miR5179 家族成員

osa-miR5179 和 bdi-miR5179，成熟序列相同

（UUUUGCUCAAGACCGCGCAAC），長度為

21 bp，且定位到參考基因組上，靶向 2 個差異表

達 的 AP3 基因，根據序列比對 MADS16

（LOC110093040）為 AP3-3 基因，MADS16

（LOC110103364）為 AP3-2 基因，它們可能是 2

種石斛花型形成的關鍵差異 miRNA 及靶基因。

miR319、miR159 共同調控 2 個參與花器官發(fā)育

2182 熱帶作物學報 第 44 卷

且為赤霉素轉錄激活因子（GAM1）的 MYB 類基

因，ath-miR5021 調控與花型發(fā)育有關的 4 個 TCP

家族基因；3 個 APETALA2-like 的基因與 miR172

相互作用，miR164 調控 2 個與花型發(fā)育相關的

NAC 家族基因；此外 miR167 與 2 個作為生長素

轉錄因子的基因（ARF）相互作用，bdi-miR159c

調控 1 個催化細胞分裂素的氧化基因（CKX9），

miR160 靶向 4 個作為生長素轉錄因子的基因

（ARF），miR167 靶向 ANT。另外，miR408、miR528

也調控生長素轉錄因子的表達。這與前人的研究

結果一致，因此，推測以上 miRNA 及其靶基因

為花型形成候選 miRNA 和靶基因。

2.6 miRNA-mRNA 調控網絡構建

將表達 miRNA 及其靶標進行 miRNA-mRNA

關聯(lián)分析，最后將數據導入 Cytosc-ape 軟件對

miRNA-mRNA 調控網絡進行可視化處理，篩選

與花型形成有關 miRNA 及其靶基因，得到 22

個共表達的靶基因及其相關 miRNA，和在鐵皮

石斛中特異性表達的 vca-miR167b-3p 及其靶基

因（表 1）。

表 1 miRNA-mRNA 調控網絡中與花型發(fā)育有關的 miRNA 及其靶基因統(tǒng)計

Tab. 1 Statistical of the miRNA and its target genes involved in floral pattern development in

miRNA-mRNA regulatory network

基因名稱

Gene name

TP_1vsMH_2

(log2FC) miRNA TP_1vsMH_2

(log2FC)

Nr 注釋

Nr description

MADS16

(LOC110106631)

?0.768 830 261 30 osa-miR5179;

bdi-miR5179

?1.622 324 615 93 MADS-box transcription factor 16-like [Dendrobium catenatum]

MADS16

(LOC110093040)

1.109 557 191 60 osa-miR5179;

bdi-miR5179

?1.622 324 615 93 MADS-box transcription factor 16 [Dendrobium catenatum]

MADS16

(LOC110103364)

?2.072 810 395 28 osa-miR5179;

bdi-miR5179

?1.622 324 615 93 MADS-box transcription factor 16 [Dendrobium catenatum]

MADS16

(LOC110096227)

0.553 360 403 33 bdi-miR5179;

osa-miR5179

?1.622 324 615 93 MADS-box transcription factor 16 [Dendrobium catenatum]

AP2-3

(LOC110107829)

?0.786 369 378 60 miR172 ?0.058 359 940 00 APETALA2-like protein 3 isoform X1 [Dendrobium catenatum]

AP2

(LOC110095317)

0.682 606 379 14 miR172 ?0.058 359 940 00 AP2-like ethylene-responsive transcription factor TOE3

isoform X1 [Dendrobium catenatum]

AP2

(LOC110097153)

?1.824 070 389 73 miR172 ?0.058 359 940 00 AP2-like ethylene-responsive transcription factor TOE3

[Dendrobium catenatum]

NAC021

(LOC110116607)

2.926 867 836 60 miR164 ?1.424 862 521 69 NAC domain-containing protein 21/22-like[Dendrobium

catenatum]

NAC021

(LOC110104882)

3.566 692 272 30 miR164 ?1.424 862 521 69 NAC domain-containing protein 21/22[Dendrobium catenatum]

GAM1

(LOC110091872)

4.058 220 420 70 miR319/159 0.551 705 000 00/

?1.113 824 573 00

transcription factor GAMYB isoform X1 [Dendrobium catenatum]

GAM1

(LOC110114505)

1.515 427 374 20 miR319/159 0.551 705 000 00/

?1.113 824 573 00

transcription factor GAMYB isoform X1 [Dendrobium catenatum]

TCP2

(LOC110093292)

0.623 023 112 54 miR319/159 0.551 705 000 00/

?1.113 824 573 00

transcription factor TCP2 [Dendrobium catenatum]

TCP24

(LOC110114709)

?0.043 670 325 15 miR319/159 0.551 705 000 00/

?1.113 824 573 00

transcription factor TCP24-like [Dendrobium catenatum]

TCP2

(LOC110094248)

?0.570 975 362 11 miR319/159 0.551 705 000 00/

?1.113 824 573 00

transcription factor TCP24-like [Dendrobium catenatum]

TCP3

(LOC110094779)

?0.192 780 588 84 miR319/159 0.551 705 000 00/

?1.113 824 573 00

Transcription factor TCP3 [Dendrobium catenatum]

ANT

(LOC110101314)

?1.132 614 587 44 vca-miR167b-3p ?3.000 836 239 18 AP2-like ethylene-responsive transcription factor ANT

[Dendrobium catenatum]

CKX9

(LOC110102256)

?2.019 303 535 24 bdi-miR159c ?1.766 370 985 55 cytokinin dehydrogenase 4-like[Dendrobium catenatum]

ARF 12

(LOC110112646)

?0.111 328 536 76 miR167 ?0.522 373 360 00 auxin response factor 12 isoform X1 [Dendrobium catenatum]

ARF 17

(LOC110104921)

0.474 397 750 04 miR167 ?0.522 373 360 00 auxin response factor 17-like [Dendrobium catenatum]

ARF18

(LOC110109117)

4.009 699 676 01 miR160 0.745 670 000 00 auxin response factor 18 isoform X1 [Dendrobium catenatum]

AFR18

(LOC110102977)

1.303 956 073 39 miR160 0.745 670 000 00 auxin response factor 18 [Dendrobium catenatum]

AFR17

(LOC110112371)

2.057 551 206 44 miR160 0.745 670 000 00 auxin response factor 17 isoform X1 [Dendrobium catenatum]

AFR18

(LOC110091857)

?0.093 840 471 84 miR160 0.745 670 000 00 LOW QUALITY PROTEIN: auxin response factor 18-like

[Dendrobium catenatum]

第 11 期 臧 睿等：mRNAs/microRNAs 調控網絡探索石斛花型差異分子機理研究 2183

將關聯(lián)分析得到與花型形成有關的共表達

miRNA 及其靶基因進行差異分析，刪除無顯著差

異靶點，得到 6 個與花型形成有關的關聯(lián)網絡（圖

4~圖 6）。鐵皮石斛特異表達的 vca-miR167b-3p

作用靶基因為 ANT（圖 4A）；2 個 miR160 負向調

控生長素反應因子（ARFs）ARF18(LOC110109117)、

ARF18（LOC110102977），其中 miR160 在鐵皮石

斛中上調表達，2 個靶基因在美花石斛中上調表達

（圖 4B）；在鐵皮石斛中上調表達的 2 個 miR5179

正向調控 2 個差異表達的 AP3 類靶基因，MADS16

（ LOC110093040 ）在美花石斛中上調表達，

MADS16（LOC110103364）在鐵皮石斛中上調表達

（圖 4C）；bdi-miR159c 及其靶基因 CKX9 在鐵皮石

斛中上調表達（圖 4D）；88 個 miR164 在鐵皮石斛

中上調表達負向調控 2 個 NAC 家族基因，NAC021

（LOC110104882）被 88 個 miR164 靶向，NAC021

（LOC110116607）被 87 個 miR164 靶向，2 個靶基

因在美花石斛中上調表達（圖 5）；44 個 miR159 在

鐵皮石斛中上調表達，2 個 MYB 家族靶基因在美

花石斛中上調表達并呈負調控關系（圖 6）。

圖 4 miR167（A）、miR160（B）、miR5179（C）、miR159（D）調控網絡

Fig. 4 miR167 (A), miR160 (B), miR5179 (C), miR159 (D) regulatory network

圖 5 miR164 調控網絡

Fig. 5 miR164 regulatory network

2184 熱帶作物學報 第 44 卷

圖 6 miR159 調控網絡

Fig. 6 miR159 regulatory network

2.7 靶基因 PPI 網絡

借助 STRING 數據庫和 Cytoscape 軟件對 2

種石斛構建 PPI 網絡，在可視化網絡篩選關聯(lián)分

析得到的靶基因。鐵皮石斛與美花石斛花發(fā)育相

關的蛋白互作通路和生長素反應互作通路各不相

同。鐵皮石斛花發(fā)育互作通路中 AP3-2

（LOC110103364）基因表達量遠高于美花石斛，

AP3-3（LOC110093040）基因表達量遠底于美花

石斛，美花石斛缺少 CUL1、TIR1、TIR1A、RBS

四個節(jié)點基因。生長素反應互作通路中 ARFs 在

鐵皮石斛中表達量高于美花石斛，美花石斛缺失

ARF18（LOC110110803）節(jié)點基因，而且特異性

擁有一條 NAC 基因組成的生長素信號轉導靶基

因蛋白互作通路（圖 7，圖 8）。

A：與花型形成（MADS-box）、生長素、乙烯反應有關蛋白互作通路；B：與生長素反應有關通路。

A: Protein interaction pathways related to floral type formation (MADS-box) and auxin response;

B: Protein interaction pathways related to the auxin response.

圖 7 鐵皮石斛靶基因蛋白互作通路圖

Fig. 7 Diagram of target gene protein interaction pathways in D. officinale

第 11 期 臧 睿等：mRNAs/microRNAs 調控網絡探索石斛花型差異分子機理研究 2185

A：與花型形成（MADS-box）有關基因蛋白互作通路；B：與生長素反應有關通路；C：與生長素（NAC）有關通路。

A: Protein interaction pathways related to floral type formation (MADS-box) and auxin response;

B: Protein interaction pathways related to the auxin response; C: Pathways related to auxin.

圖 8 美花石斛靶基因蛋白互作通路圖

Fig. 8 Diagram of target gene protein interaction pathways in D. loddigesii

3 討論

根據前人研究，MADS-box 家族基因在調控

花型形成中發(fā)揮重要作用，其中 AP3 亞家族作為

ABCDE 模型的 B 類基因具有調控多元化花被片

和唇瓣的功能[22]，包括 AP3-1、AP3-2 和 AP3-3

等 3 個進化枝，AP3-3 通常只在花瓣中特異性高

表達并作為身份特征基因，是石斛蘭的花器官發(fā)

育的重要基因[23]。根據轉錄組數據分析顯示，一

個在美花石斛中上調表達的 AP3-3 基因和在鐵皮

石斛中上調表達的 AP3-2 基因或許是致使 2 種石

斛花型和唇瓣結構差異的關鍵基因。此外已有研

究表明，意大利蘭和水稻的花序中 miR5179 同源

物靶向 AP3 轉錄本[4-5]，表明在花器官發(fā)育過程中

存在 miRNA 介導的 AP3 花發(fā)育調控機制，且在

miRNA-mRNA 調控網絡中，miR5179 在鐵皮石斛

上調表達并靶向 MADS-box B 類基因 AP3-3、

AP3-2，因此認為 AP3 的差異表達可能與 miR5179

的差異調控有關，說明石斛蘭中同樣存在 miR5179

靶向 AP3 基因表達的現象，miR5179 可能是石斛

花型發(fā)育的關鍵差異調控分子，miR5179-AP3 花

型發(fā)育調控機制可能是石斛蘭花型形成 mRNAs/

microRNAs 調控網絡的重要組成部分。

ANT 作為一個 A 類 AP2 同源基因可促進花瓣

細胞的特性，參與花器官的起始和發(fā)育，維持細

胞的分生組織能力，在器官發(fā)生過程中維持細胞

周期調節(jié)因子的表達，從而通過控制細胞數量調

控花器官大小，參與花器官發(fā)育調節(jié) INO 的自誘

導和表達模式調節(jié)花器官發(fā)育，并介導花模型 2

輪中的 AG 基因的下調[24]。本研究中一個在鐵皮

石斛特異性表達的 miR167 靶向差異顯著基因

ANT，表明 2 種石斛 ANT 的差異表達可能與該

miRNA 的缺失有關，因此認為 miR167-ANT 可能

是花器官發(fā)育的關鍵通路。

此外部分激素有關基因也與花型形成有關。

NAC 基因具有調控生長素合成的作用，本研究中

存在差異表達的 NAC021，是生長素信號轉導轉

錄激活因子，在擬南芥 NAC1 轉導 TIR1（生長素

受體蛋白）下游的生長素信號，可激活 2 個下游

生長素應答基因 DBP 和 AIR3 的表達[25]。在鐵皮

石斛的 PPI 網絡中 TIR1 與 UFO（花葉分生組織

特性因子）互作，而 UFO 與 4 個 AP3 基因互作，

包括差異表達的 AP3-2、AP3-3，所以 NAC021 基

因作為生長素調控通路的關鍵基因可能間接影響

了 AP3 基因的表達，從而在 2 種石斛花型形成過

程發(fā)揮作用。已知在核桃等其他園藝植物中

miR164 靶向 NAC 家族基因的表達[26]，本研究

miRNA-mRNA 調控網絡中差異表達的 miR164 靶

向 NAC021 基因，表明在蘭科植物中同樣存在

miR164-NAC 調控機制。

MYB 家族基因 GAM1 為大麥 GAMYB 同源

轉錄因子，是糊粉蛋白細胞中赤霉素依賴性淀粉

酶表達的轉錄激活因子，可能與淀粉酶啟動子的

5'-TAACAAA-3' box 結合參與花粉和花器官的發(fā)

育[27]。miR159 是植物中一類古老保守的 microRNA，

其靶基因主要是一類編碼 R2R3 MYB 轉錄因子的

GAMYB-like 基因。miR159-GAMYB 途徑高度保

守，miR159 通過轉錄后調控 GAMYB 在植物花

器官發(fā)育中發(fā)揮著重要作用[28]。本研究中差異表

達的 miR159 靶向調控了 2 個差異顯著的 GAM1，

說明 2 種石斛中存在 miR159-GAMYB 花器官發(fā)

育調控機制，miR159 可能通過靶向 GAM1 的表達

從而調控石斛蘭的花器官發(fā)育，影響花型形成。

細胞分裂素脫氫酶（CKX）對 CK 具有強底

物專一性，是目前已知的唯一參與 CK 降解過程

2186 熱帶作物學報 第 44 卷

的酶，已有研究表明，CKX 在植物體內以多基因

家族的形式存在，在系統(tǒng)進化樹上可分為 4 組，

但不同的 CKX 基因家族成員都包含 FAD 和

Cytokinine 兩個保守的結合域[29]，在本研究關聯(lián)

分析中差異表達的 bdi-miR159c 靶向 CKX9，使該

基因在鐵皮石斛中上調表達。生長素響應因子參

與的 TIR1/AFB-Aux/IAA-ARF 信號通路是植物體

內最重要的信號通路之一，ARF 家族成員在信號

通路中的表達可以調控植物體內如花器官發(fā)育等

多種生物學過程[30]，參與花器官的發(fā)育差異表達

的 miR160-ARF（Auxin 響應因子），在蘋果、擬

南芥中均有體現[8-9]，這與本研究結果一致。

MADS-box 蛋白互作差異可能導致石斛蘭花

型差異的關鍵，2 種石斛中均存在 4 個 B 類（AP3）

花同源性基因 MAD16 并與花葉分生組織特性因

子（UFO）互作，其中存在差異表達的節(jié)點 AP3-3、

AP3-2，且這 2 個節(jié)點在 miRNA-mRNA 調控網絡

中被 miR5179 靶向。研究表明許多激素信號通路

直接或間接參與花器官發(fā)育調控，目前研究發(fā)現

多種激素都是 MADS-box 的潛在靶點，直接或者

間接參與植物生長發(fā)育、花器官形態(tài)建成等過程。

在鐵皮石斛中存在花模式和激素反應有關基因構

成的調控網絡，CUL1 可與 F-box 蛋白形成 SCF

復合物，該復合物在花器官發(fā)育和生長素反應過

程中發(fā)揮調控作用[31]，且在鐵皮石斛 PPI 互作網

絡中 F-box 蛋白 UFO 和 TIR1（生長素受體蛋白）

與 CUL1 為互作關系。SCF（CUL1-UFO）復合物

正向調控 B 類（AP3）花同源性基因，SCF（CUL1-

TIR1）復合物作為生長素受體介導 Aux/IAA 蛋白

的蛋白酶降解和調控生長素因子的轉錄，這與本

研究結果一致，美花石斛 PII 網絡中則缺少 CUL1、

TIR1、TIR1A、RBS 基因，這可能是其花型存在差

異的原因之一。此外 ARFs 互作通路中美花石斛

缺少節(jié)點 ARF18（LOC110110803），鐵皮石斛則

缺少 NAC 互作通路，PPI 網絡中 AP3、ARFs、

NAC021 等節(jié)點均在 mRNA-miRNA 調控網絡顯

示。

綜上所述，本研究借助生物信息學成功篩選

并構建了 2 種石斛的 miRNA-mRNA 網絡和 PPI

網絡，發(fā)現 2 種石斛與花型形成有關的關聯(lián)網絡

和蛋白互作關系，探討了可能與花型形成有關的

分子發(fā)育機制，為今后闡明石斛屬植物花型形成

的分子調控機制提供重要的線索，為分子植物育

種提供數據支撐和參考依據。此外本研究存在一

些不足，由于篩選條件的限制，只能根據前人研

究對關鍵 mRNA 和 miRNA 進行分析，研究結果

具有局限性；缺乏證明 miRNA-mRNA 調控網絡

中靶向關系驗證實驗。在后續(xù)的研究中應通過相

關實驗進一步討論和驗證本研究的預測。

4 結論

從鐵皮石斛、美花石斛分析發(fā)現的 miR5179-

AP3 、 miR167-ANT 、 miR164-NAC 、 miR159-

GAMYB、miR159-CKX、miR160-ARF 關聯(lián)通路可

能是石斛屬植物花型差異的關鍵 miRNA-mRNA 通

路。其通路中的部分基因如 AP3、ARF、NAC 則是

PPI 網絡中的關鍵節(jié)點。以上 miRNA、mRNA 共同

構成分子調控網絡調控石斛的花型差異。

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熱帶作物學報 2023, 44(11): 2188?2195

Chinese Journal of Tropical Crops

收稿日期 2022-06-05；修回日期 2022-09-15

基金項目 福建省自然科學基金項目（No. 2023J01283）；福建農林大學優(yōu)秀碩士論文基金項目（No. 1122YS01009）。

作者簡介 章楊婷（1998—），女，碩士研究生，研究方向：園林植物與應用。*通信作者（Corresponding author）：周育真（ZHOU

Yuzhen），E-mail：zhouyuzhen@163.com。

一心維納斯蝴蝶蘭花香物質合成相關基因 RT-qPCR 內參

基因篩選

章楊婷1

，張燕萍1

，黃靜妍1

，王文君1

，童 妍1

，趙 凱2

，周育真1*

1. 福建農林大學風景園林與藝術學院/蘭科植物保護與利用國家林業(yè)和草原局重點實驗室，福建福州 350002；2. 福建師范

大學生命科學學院，福建福州 350117

摘 要：一心維納斯蝴蝶蘭（Phalaenopsis I-Hsin Venus）花型優(yōu)雅、花期持久、花香馥郁，是優(yōu)良的香花品種，具有

較高的園林觀賞價值和經濟價值。為篩選適用于一心維納斯蝴蝶蘭花香物質合成相關基因表達分析的內參基因，本研

究以一心維納斯蝴蝶蘭不同花期（中蕾期、初開期、盛開前期、盛開中期、盛開后期、衰敗期）的轉錄組數據為基礎，

選取了 ACT1、ACT2、ACT3、GAPDH、EF1α、TUA、TUB 和 Ubi 共 8 個管家基因作為候選內參基因，利用實時熒光

定量 PCR（RT-qPCR）技術檢測候選內參基因在花朵不同發(fā)育時期的表達情況，并利用 geNorm、NormFinder、BestKeeper

三個內參基因穩(wěn)定性分析軟件對候選內參基因進行分析。綜合分析結果表明，ACT1 的穩(wěn)定性最高，可作為一心維納斯

蝴蝶蘭相關基因表達分析的最適內參基因。

關鍵詞：一心維納斯蝴蝶蘭；內參基因；實時熒光定量 PCR；表達穩(wěn)定性

中圖分類號：S682.31 文獻標識碼：A

Selection of Suitable RT-qPCR Reference Genes for Floral Scent

Biosynthesis in Phalaenopsis I-Hsin Venus

ZHANG Yangting1

, ZHANG Yanping1

, HUANG Jingyan1

, WANG Wenjun1

, TONG Yan1

, ZHAO Kai2

,

ZHOU Yuzhen1*

1. College of Landscape Architecture and Art, Fujian Agricultural and Forestry University / Key Laboratory of National Forestry and

Grassland Administration for Orchid Protection and Utilization, Fuzhou, Fujian 350002, China; 2. College of Life Sciences, Fujian

Normal University, Fuzhou, Fujian 350117, China

Abstract: Phalaenopsis I-Hsin Venus is an excellent variety of fragrant flowers, with elegant flower types, long flowering period and rich floral fragrance, which has high garden ornamental value. ACT1, ACT2, ACT3, GAPDH, EF1α, TUA,

TUB and Ubi, were selected as the candidate internal reference genes based on the transcriptome data of different flower

development stages in Phal. I-Hsin Venus to select the appropriate reference genes for RT-qPCR analysis of the correlated genes in the biosynthesis pathway of the floral scent in Phalaenopsis I-Hsin Venus. The expression of the candidate internal reference genes in inflorescences at different stages was detected by RT-qPCR. The candidate internal parameter genes were analyzed by combining three internal parameter gene stability analysis software: geNorm, NormFinder and BestKeeper. The results of comprehensive analysis showed that ACT1 was the most stable and could be used

as the best internal reference gene for the expression analysis of Phal. I-Hsin Venus.

Keywords: Phalaenopsis I-Hsin Venus; reference genes; RT-qPCR; expression stability

DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2023.11.006

第 11 期 章楊婷等：一心維納斯蝴蝶蘭花香物質合成相關基因 RT-qPCR 內參基因篩選 2189

實時熒光定量 PCR 技術（ quantitative

real-time PCR, RT-qPCR）是指在 PCR 反應體系中

添加熒光基團（探針或者染料），在 PCR 擴增進

程中借助熒光信號的積累進行實時監(jiān)測 [1]。

RT-qPCR 目前已普遍應用于分子生物學研究和醫(yī)

學研究等領域[2]。因 RT-qPCR 的特異性強、無污

染性和準確性高，其被廣泛應用于基因表達驗證

方面的研究[3]。但是，RNA 的質量或試驗操作的

偏差等因素會影響最終結果的精準度[4]。使用內

參基因對結果進行校對并糾正，可以大大降低目

標基因與數據表達水平之間的差異，從而提高試

驗的準確性。

內參基因通常選用管家基因，這類基因以穩(wěn)

定表達著稱，但目前并沒有哪個內參基因能確保

在所有情況下都能穩(wěn)定表達[5]。理想的內參基因

在不同條件不同組織中均會穩(wěn)定表達，而試驗研

究中內參基因的恒定表達僅僅是在一定的試驗環(huán)

境下和一定的組織中才會實現[6]。在特定試驗條

件下或給特定組織或品種進行 RT-qPCR 表達穩(wěn)定

分析前，應該選擇合適的內參基因。目前常用的

內參基因主要包括肌動蛋白基因（ACT）、18S 核

糖體 RNA（18SrRNA）、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因

（GAPDH）、轉錄延伸因子基因（EF1α）、多聚泛

素酶基因（UBQ）、α 微管和 β 微管蛋白基因（TUA、

TUB）以及親環(huán)蛋白基因（CYP）等。

蝴蝶蘭（Phalaenopsis spp.）因花朵形態(tài)像蝴

蝶而得名，又稱蝶蘭，其花色艷麗，花姿嬌俏，

花期長，廣泛分布于中國、泰國、菲律賓、馬來

西亞等地，屬熱帶亞熱帶氣生蘭，被稱為“蘭花

皇后”。蝴蝶蘭的原生種數量少，市場上廣泛栽培

與應用的品種部分是雜交種，在花卉市場上頗受

歡迎[7]。隨著市場的不斷變化和消費者需求的多

樣化，品種的不斷創(chuàng)新及改良是必要手段，蝴蝶

蘭香花品種的培育是目前重要的育種目標之一。

一心維納斯蝴蝶蘭（Phal. I-Hsin Venus）是以金

龍蝴蝶蘭（Phal. Dragon’s Gold）和 Phal. I-Hsin

Viola Tria 為親本雜交選育而成的香花品種，具有

花香濃郁、花色絢麗多彩、花型輕盈、花期持久

等特性，是研究蝴蝶蘭花香的理想材料。前期研

究表明，一心維納斯蝴蝶蘭隨著花朵開放，花香

物質逐漸增加而產生花香，其香氣成分主要為萜

類物質，且成分復雜。目前還需對其花香合成與

釋放相關的分子機制進行更深入地挖掘。

本研究基于蝴蝶蘭一心維納斯品種的花朵轉

錄組數據，篩選出 ACT1、ACT2、ACT3、GAPDH、

EF1α、TUA、TUB 和 Ubi 這 8 個候選內參基因，

分別對其進行引物設計，并通過 RT-qPCR 得到在

蝴蝶蘭 6 個不同花期中的表達量。利用軟件評估

內參基因的穩(wěn)定性，篩選出理想的內參基因。為

后期開展一心維納斯蝴蝶蘭花香物質合成和釋放

相關功能基因研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究以福建農林大學森林蘭苑溫室大棚中

的蝴蝶蘭一心維納斯品種的花朵為材料，于 2021

年 3—6 月花朵集中開放時期的 10：00—14：00

采集，采集包括中蕾期（ZL）、初開期（CK，0 d）、

盛開前期（S7，7 d）、盛開中期（S15，15 d）、盛

開后期（S30，30 d）、衰敗期（SB，45 d 及以上）

6 個時期，設置 3 個生物學重復。采集后的樣品

迅速放入液氮中，迅速轉移至?80 ℃冰箱里備用。

1.2 方法

1.2.1 總 RNA 提取與 cDNA 合成 使用 RNA 提

取試劑盒（Plant RNA Kit, OMEGA）提取一心維

納斯蝴蝶蘭不同花期的總 RNA。使用 1%的瓊脂

糖凝膠電泳檢測提取 RNA 的完整性，超微量紫外

分光光度計檢測 RNA 的濃度和純度。使用反轉錄

試劑盒（PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA

Eraser 試劑盒，TaKaRa）將檢測合格的樣品 RNA

反轉錄成 cDNA，將得到的 cDNA 樣品放于-20 ℃

冰箱備用。

1.2.2 候選內參基因篩選 根據已測序完成的一

心維納斯蝴蝶蘭不同花期的轉錄組數據（未發(fā)

表），FPKM 值為 92.61 以上并且各基因樣品表達

量較為一致的情況下[8]，通過網站（http://orchidbase.itps.ncku.edu.tw/）[9]查找小蘭嶼蝴蝶蘭（Phal.

equestris）基因組數據進入 NCBI 的 Blast P 程序進

行同源基因比對，初步篩選出 8 個內參基因（表 1）。

1.2.3 RT-qPCR 通過 Primer 3（https://primer3.ut.

ee/）在線網站和 DNAMAN 9.0 軟件，基于已知

的內參基因的核苷酸序列來設計引物（表 2），引

物由福州白鯨生物科技有限公司合成。使用 TB

Green Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒（TaKaRa 公司）

進行 RT-qPCR，反應體系為：10 μL TB Green

Premix Ex TaqⅡ、正反引物各 0.8 μL、0.4 μL ROX

Reference DyeⅡ、6 μL 滅菌水、2 μL cDNA 溶液，

反應程序為：95 ℃預變性 30 s；95 ℃變性 5 s，

2190 熱帶作物學報 第 44 卷

表 1 根據 FPKM 值及 Blast P 比對篩選到的 8 個候選內參基因

Tab. 1 FPKM values and Blast P results of eight reference genes

基因 FPKM 值 FPKM value ID

Gene ID ZL CK S7 S15 S30 SB

比對結果

Blast result

基因

Gene

Cluster-12453.29110 154.95 245.18 151.11 185.91 187.15 200.06 Actin [Phal. equestris](XP_020579615.1) ACT1

Cluster-12453.26608 137.23 131.98 112.97 104.18 110.05 92.61 Actin [Phal. equestris]( XP_020579615.1) ACT2

Cluster-12453.24947 438.96 493.51 485.79 412.00 441.05 381.22 Actin [Phal. equestris](XP_020592572.1) ACT3

Cluster-12453.34291 920.55 942.18 865.43 1211.37 986.25 992.34 EF-1-alpha [Phal. equestris](XP_020578237.1)EF1α

Cluster-12453.24701 622.49 970.93 1704.86 1031.90 1014.65 743.37 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 2,

cytosolic [Phal. equestris](XP_020593213.1) GAPDH

Cluster-12453.24761 735.44 798.77 675.91 252.96 532.77 203.12 Tubulin alpha-3 chain [Phal. equestris]

(XP_020585177.1) TUA

Cluster-12453.24914 791.45 488.23 203.63 142.16 335.64 155.48 Tubulin beta chain-like [Phal. equestris]

(XP_020586293.1) TUB

Cluster-12453.26344 1274.65 1548.93 4773.55 1304.54 1307.18 1103.33 Ubiquitin; Flags: Precursor [Phal. equestris]

(XP_020591356.1) Ubi

表 2 候選內參基因的引物序列

Tab. 2 Primer sequences for internal control genes

基因名稱

Gene name

正向引物序列（5'?3'）

Forward primer sequence (5'?3')

反向引物序列（5'?3'）

Reverse primer sequence (5'?3')

產物長度

Product size/bp

ACT1 ATGCCATCCTTCGTTTGG GCTATTCTTCGCAGTCTCCAG 182

ACT2 GTGTTTGGATTGGAGGCTC GACGATTGAAGGACCAGATTC 98

ACT3 TGGATTTGCTGGAGATGATG CTTTGATTGAGCCTCGTCC 127

EF1α TGAAGATGATTCCCACGAAG TTGGCAGCAGATTTGGTAAC 166

GAPDH ATTGCTTGGCTCCTCTTGC TCCAGTCCTTGCTTGATGG 126

TUA TGCCAAGTGATACGACTGTG CTGGATGAAAGAGTTGCCTG 107

TUB ATACCGAGGGTGCTGAACTC TGGCATACTTGGAATCCTTG 94

Ubi CGTACCCTCGCCGATTACAA CACTTTCCCAGAGTCGCCAA 183

60 ℃退火延伸 30 s，40 個循環(huán)。溶解曲線溫度設

置為 60~95 ℃，升溫速度為 0.2 ℃/s。每個基因每

個時期 3 次技術重復，得出的數據計算△Ct 值后

使用 2?△△Ct 公式運算。

1.3 數據處理

將一心維納斯蝴蝶蘭 6 個花期的 cDNA 等量

混合，設置 5 個濃度梯度（5?1

、5?2

、5?3

、5?4

、

5?5

），每個濃度梯度設置 3 個重復，對樣品進行

RT-qPCR。以獲得的 5 個梯度下各個內參基因的

Ct 值為縱坐標，稀釋倍數的對數值為橫坐標制作

標準曲線，并利用公式計算各候選內參基因的擴

增效率（E）[10]，E=(10?1/k

?1)?100%。

參考當前已有的試驗中對內參基因穩(wěn)定性的

分析方法 [11] ，通過 geNorm 、 NormFinder 和

BestKeeper 三個分析軟件對各候選內參基因在一

心維納斯蝴蝶蘭 6 個不同花期中的穩(wěn)定性進行分

析，綜合 3 個軟件得出的穩(wěn)定性排名，篩選出最

適的內參基因。

2 結果與分析

2.1 內參基因 RT-qPCR 分析

RT-qPCR 分析得出的結果如圖 1 所示，溶解

曲線均僅出現單一峰，表明 8 個內參基因均未出

現引物二聚體。引物二聚體會產生熒光信號，干

擾到目的基因的定量[12]，無引物二聚體，說明引

物的特異性較好，滿足 RT-qPCR 下一步試驗的

條件。

以一心維納斯蝴蝶蘭不同發(fā)育階段的 cDNA

為模板進行 RT-qPCR 擴增，根據標準曲線得到的

斜率（K）、相關系數（R2

），計算引物擴增效率（E）。

結果表明（表 3），ACT1 和 ACT3 擴增效率分別

為 121.95%和 112.23%，高于 110%。其余的 6 個

候選內參基因的擴增效率均在 90%~110%之間，

且 8 個候選內參基因相關系數（R2）在 0.9826~

0.9998 之間，表明特異性及擴增效率良好，滿足

RT-qPCR 操作。

第 11 期 章楊婷等：一心維納斯蝴蝶蘭花香物質合成相關基因 RT-qPCR 內參基因篩選 2191

圖 1 候選內參基因溶解曲線

Fig. 1 Dissolution curve of each reference gene

表 3 8 種引物的相關系數與擴增效率

Tab. 3 Amplification efficiency and correlation

of eight candidate genes

基因

Gene

E/% R2 K

ACT1 121.95 0.9983 ?2.8881

ACT2 101.78 0.9976 ?3.2799

ACT3 112.23 0.9996 ?3.0599

EF1α 94.79 0.9826 ?3.4535

GAPDH 96.99 0.9993 ?3.3962

TUA 102.18 0.9997 ?3.2708

TUB 104.57 0.9998 ?3.2170

Ubi 105.92 0.9960 ?3.1878

候選內參基因的 Ct 值越大，基因的表達量越

??；反之，候選內參基因的 Ct 值越小，基因的表

達量越大，且同一個候選內參基因 Ct 值的波動越

大，說明該基因的表達穩(wěn)定性越小。對 8 個內參

基因在各樣本中的表達水平（Ct 值）進行分析（表

4），在一心維納斯蝴蝶蘭 6 個花期中，各候選內

參基因在不同樣本中的 Ct 平均值為 20.789~

27.735。其中 GAPDH 的平均 Ct 值最低，其表達

量最高；ACT1 的平均 Ct 值最高，其表達水平最

低；ACT1、ACT3、TUB、ACT2、TUA、Ubi、EF1α、

GAPDH 的平均表達水平依次升高。TUB 的 Ct 值

變化幅度最大，Ct 差值為 3.594；GAPDH 波動范

圍最小，Ct 差值為 1.981。

表 4 8 個候選基因在 6 個樣本中的 Ct 值

Tab. 4 Ct values of eight candidate reference genes in six samples

基因 Gene ZL CK S7 S15 S30 SB 平均值 Average

ACT1 27.245 26.739 26.862 27.786 29.026 28.749 27.735

ACT3 26.695 26.906 26.127 27.288 28.421 28.188 27.271

TUB 24.468 23.908 25.123 26.461 27.502 26.962 25.737

ACT2 23.744 23.829 23.711 24.622 25.793 25.766 24.578

TUA 24.449 23.717 23.122 24.892 25.720 25.477 24.563

Ubi 23.378 22.750 22.527 23.871 25.174 24.494 23.699

EF1α 20.757 22.439 19.893 20.849 22.492 21.975 21.401

GAPDH 20.749 20.326 19.878 20.513 21.859 21.411 20.789

2192 熱帶作物學報 第 44 卷

2.2 候選基因表達穩(wěn)定性分析

2.2.1 geNorm 軟件分析 通過 geNorm 軟件計算

候選內參基因的表達穩(wěn)定值 M（表 5），M 值與穩(wěn)

定性呈負相關，M<1.5 時被認為是理想內參。在

本研究中，8 個候選內參基因在不同時期花序中

的 M 值均小于 0.7，表現出較高的穩(wěn)定性。在不

同時期花序中，ACT1 和 ACT2 的 M 值最低

（0.207），穩(wěn)定性最好，其次是 Ubi（0.257），而

相對來說，EF1α 表達最不穩(wěn)定（M 值最高，為

0.663）。但由于 M<1.5 時就能被認為是理想內參，

則 8 個內參基因均有較為良好的穩(wěn)定性，表達穩(wěn)

定性由大到小排序為 ACT1=ACT2>Ubi>ACT3>

GAPDH>TUA>TUB>EF1α。

表 5 geNorm 分析候選基因的表達穩(wěn)定性

Tab. 5 Expression stability of candidate genes

analyzed by geNorm

基因名稱 Gene name M 排名 Rank

ACT1、ACT2 0.207 1

Ubi 0.257 2

ACT3 0.283 3

GAPDH 0.330 4

TUA 0.374 5

TUB 0.495 6

EF1α 0.663 7

2.2.2 NormFinder 軟件分析 使用 NormFinder

軟件計算出的表達穩(wěn)定值 M 越小，說明該基因越

穩(wěn)定，反之，M 值越大，該基因穩(wěn)定性就越差。

如表 6 所示，在不同時期花序中，8 個內參基因

的穩(wěn)定性依次為 Ubi>ACT1>ACT3>ACT2>TUA>

GAPDH>TUB>EF1α，其中，Ubi 表達穩(wěn)定性最高，

EF1α 表達穩(wěn)定性最低。

表 6 NormFinder 軟件分析候選基因的表達穩(wěn)定性

Tab. 6 Expression stability of candidate genes

analyzed by NormFinder

基因名稱 Gene name M 排名 Rank

Ubi 0.011 1

ACT1 0.110 2

ACT3 0.136 3

ACT2 0.185 4

TUA 0.282 5

GAPDH 0.295 6

TUB 0.868 7

EF1α 1.109 8

2.2.3 BestKeeper 軟件分析 使用 BestKeeper 軟

件計算 Ct 值的標準偏差（stardand deviaton, SD）

及變異系數（coefficient of variation, CV）并比較

各值的大小，分析判斷該內參基因的表達穩(wěn)定性。

SD 和 CV 越小，穩(wěn)定性越好。由表 7 可知，除了

TUB 之外的內參基因的 SD 值均小于 1，表達穩(wěn)

定性依次為 GAPDH>ACT3>ACT1>TUA>Ubi>

ACT2>EF1α，其中 GAPDH 穩(wěn)定性最好，EF1α 穩(wěn)

定性較差。TUB 的 SD 值大于 1，說明穩(wěn)定性較

差，相對來說，不適合作為內參基因。

表 7 BestKeeper 軟件分析候選基因的表達穩(wěn)定性

Tab. 7 Expression stability of candidate genes analyzed by

BestKeeper

基因名稱

Gene name

標準偏差

SD

變異系數

CV

排名

Rank

GAPDH 0.56 2.71 1

ACT3 0.69 2.55 2

ACT1 0.79 2.84 3

TUA 0.80 3.26 4

Ubi 0.81 3.43 5

ACT2 0.82 3.32 6

EF1α 0.82 3.87 7

TUB 1.24 4.81 8

2.2.4 綜合評價 上述 3 個分析結果表明，3 個

軟件的結果存在相似之處，但同時也存在差異。

geNorm 軟件分析結果表明，ACT1 和 ACT2 穩(wěn)定

性最高；NormFinder 軟件分析結果表明，Ubi 穩(wěn)

定性最高；BestKeeper 軟件分析結果表明，

GAPDH 穩(wěn)定性最高。因此，對 3 個軟件分析的結

果進行幾何平均值計算并排名（表 8），排名越高，

幾何平均值越小，該基因表達越穩(wěn)定。在一心維

納斯蝴蝶蘭花朵不同發(fā)育時期中，ACT1 的表達

表 8 Excel 綜合分析候選基因的表達穩(wěn)定性排名

Tab. 8 Expression stability of candidate genes was ranked

by Excel comprehensive analysis

基因名稱

Gene name

幾何平均值

Geometric mean value

排名

Rank

ACT1 1.817 1

Ubi 2.154 2

ACT3 2.621 3

ACT2、GAPDH 2.884 4

TUA 4.642 5

TUB 6.952 6

EF1α 7.319 7

第 11 期 章楊婷等：一心維納斯蝴蝶蘭花香物質合成相關基因 RT-qPCR 內參基因篩選 2193

最穩(wěn)定，是一心維納斯蝴蝶蘭花朵不同發(fā)育時期

中最理想的內參基因，其次是 Ubi；表達最不穩(wěn)

定的是 EF1α，不合適用作內參基因。

3 討論

RT-qPCR 技術是被廣泛應用的基因表達分析

的主要技術手段，但其結果的準確性需依靠試驗

所選出的對特定物種表達穩(wěn)定性較高的內參基

因，未經試驗證實而使用其他試驗中發(fā)表的內參

基因可能會導致結果出現偏差[13]。因此，在進行

目的基因表達水平研究時，首先需要篩選在特定

條件下合適的內參基因。目前，多種觀賞花卉的內

參篩選試驗均有報道，如石蒜（Lycoris radiata）[14]、

萱草（Hemerocallis fulva）[10]、茉莉花（Jasminum

sambac）[15]等，大辣椒蝴蝶蘭（Phal. Hybrid, Big

Chili）在低溫脅迫條件下的內參基因研究已有報

道[16]，但還未見蝴蝶蘭花香釋放過程中相關內參

基因的篩選研究。

本研究通過 3 種軟件分析了 8 個候選內參基

因在一心維納斯蝴蝶蘭花朵不同發(fā)育時期中的穩(wěn)

定性情況。3 種分析軟件得出的結果有所不同，

但表達比較穩(wěn)定和最不穩(wěn)定的候選內參基因基本

相同。geNorm 軟件和 NormFinder 軟件得出的結

果較為相似，BestKeeper 軟件得出的結果相差較

大，可能是 BestKeeper 軟件分析時直接使用 Ct

值這一原始數據，導致與 geNorm 和 NormFinder

軟件比較差異性相對大。該分析結果在其他內參

基因篩選的報道中也常有出現，如曹映輝等[17]在

建蘭（Cymbidium ensifolium）花香物質合成相關

基因內參基因篩選中，geNorm 和 NormFinder 軟

件得出的結果一致性較高，均表明 TUB 與 CYP 表

達較為穩(wěn)定，而 BestKeeper 卻不同；齊香玉等[15]

在茉莉（J. sambac）不同組織（含花朵）中內參

基因的篩選試驗中表明，在 BestKeeper 中 Actin

的穩(wěn)定性最好，但是其在 geNorm 和 NormFinder

中的穩(wěn)定性卻較差，反之 SAND 和 UPL7 在

BestKeeper 中的穩(wěn)定性不好，但其在 geNorm 和

NormFinder 中的穩(wěn)定性較好。因此，需要對 3 個

軟件的最后結果進行幾何平均數計算并分析排

名，降低誤差，以提高結果的準確性，最后根據

綜合分析得到最理想的內參基因。

Actin 基因參與真核生物細胞的許多重要生

命活動，如細胞形狀的維持、胞質環(huán)流、細胞運

動、細胞分裂、細胞分化、細胞內的物質運輸、

極性鍵成以及信號轉導等[18]。在理想狀態(tài)下，無

論是細胞類型或發(fā)育階段不同，還是處理方法不

同，一個理想的內參基因都能穩(wěn)定表達。由于

Actin 基因在個體各個生長階段的大多數組織中

持續(xù)表達，變化小，序列高度保守，Actin 基因常

作為內參基因使用[19]。一心維納斯蝴蝶蘭花朵不

同發(fā)育時期的理想候選內參基因是 ACT1。在其他

物種的內參基因篩選報道中，也有 ACT 被選為理

想的內參基因的情況。李晗等[20]選擇羽衣甘藍

（Brassica oleracea var. acephala）不同發(fā)育時期

的柱頭作為材料通過qRT-PCR對7個候選內參基因

進行篩選，篩選出 ACT 基因為最合適的內參基因。

ACT 在馬鈴薯（Solanum tuberosum）中也能穩(wěn)定表

達[21]。Actin 在甘草干旱條件下[22]、板藍根 ABA 處

理條件下及冬油菜低溫脅迫條件下的表達均最為

穩(wěn)定[23-24]。

EF1α 基因在一心維納斯蝴蝶蘭花朵不同時

期中表達的穩(wěn)定性最差，而仇志浪等[25]在甜櫻桃

（Prunus avium）花芽不同時期的內參基因篩選中

得出的最佳內參基因是 EF1α；NICOT 等[26]在馬

鈴薯植株不同脅迫條件下的內參基因篩選中得出

的最穩(wěn)定基因也是 EF1α。說明并不存在理想的內

參基因適用于所有植物，在不同植物不同條件下，

需要根據實際情況篩選合適的內參基因。

在聚寶紅玫瑰蝴蝶蘭（Phal. cultivar, Jiuhbao

Red Rose）內參基因的研究中，基于 geNorm 和

NormFinder 分析，Actin 在蝴蝶蘭的大多數測試樣

本中表現出高度穩(wěn)定性，表明 Actin 是蝴蝶蘭

qRT-PCR分析的合適參考基因[27]。CHUANG等[28]

在研究貝麗娜蝴蝶蘭（Phal. bellina）花香物質合

成相關功能基因時，選用 PbActin1 作為內參基因。

本研究則著重篩選出蝴蝶蘭花朵花香釋放時期所

適用的內參基因，為今后蝴蝶蘭花香物質合成相

關基因功能及分子機制的研究提供更有針對性的

參考依據。

4 結論

本研究利用 qRT-PCR 技術，通過 3 個分析軟

件（geNorm、NormFinder、BestKeeper）來分析

評估一心維納斯蝴蝶蘭的 8 個候選內參基因

（ACT1, ACT2, ACT3, EF1α, GAPDH, TUB, TUA,

Ubi）在不同花期中的穩(wěn)定性，經過綜合分析表明，

內參基因穩(wěn)定性排序為 ACT1>Ubi>ACT3>ACT2=

GAPDH>TUA>TUB>EF1α，得出 ACT1 為最為理

2194 熱帶作物學報 第 44 卷

想的內參基因，Ubi 次之。在一心維納斯蝴蝶蘭

花香物質合成與釋放的研究過程中，對相對基因

表達量進行分析時，可用 ACT1 基因作為內參基

因進行校正。

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熱帶作物學報 2023, 44(11): 2196?2198

Chinese Journal of Tropical Crops

收稿日期 2023-07-25；修回日期 2023-09-13

基金項目 中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項“藏東南（墨脫、察隅等）熱帶生物種質資源收集與保護”（No.

1630032022001）；海南省自然科學基金面上項目（No. 321MS088）。

作者簡介 董 旭（1998—），女，碩士研究生，研究方向：蘭科植物種質資源學。*通信作者（Corresponding author）：黃明忠

（HUANG Mingzhong），E-mail：hmz121@foxmail.com。

藏南蝴蝶蘭——中國蝴蝶蘭屬一未詳知種

董 旭1,2，徐世松1,3,4,5，楊虎彪1,3,4,5，王清隆1,3,4,5，袁浪興1,3,4,5，劉 震6

，

王祝年1,3,4,5，楊光穗1,3,4,5，尹俊梅1,3,4,5，王家保1,3,4,5，黃明忠1,3,4,5*

1. 中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所，海南?？?571101；2. 海南大學園藝學院，海南海口 570228；3. 農業(yè)

農村部華南作物基因資源與種質創(chuàng)制重點實驗室，海南儋州 571737；4. 海南省熱帶觀賞植物種質創(chuàng)新利用工程技術研究

中心，海南儋州 571737；5. 海南省熱帶作物資源遺傳改良與創(chuàng)新重點實驗室，海南?？?570228；6. 墨脫縣林業(yè)和草原

局，西藏林芝 860700

摘 要：本研究報道了中國蘭科（Orchidaceae）蝴蝶蘭屬（Phalaenopsis Blume）一未詳知種——藏南蝴蝶蘭（P.

arunachalensis），對其形態(tài)進行描述并提供照片。該種與紅河蝴蝶蘭（P. honghenensis）、華西蝴蝶蘭（P. wilsonii）和

小尖囊蝴蝶蘭（P. taenialis）相近，但該種具有向下彎曲的細距，側裂片分離部分不及中裂片的一半以及側裂片末端匕

狀，這些可區(qū)別于其他物種。

關鍵詞：蝴蝶蘭屬；植物分類；西藏

中圖分類號：S682.31 文獻標識碼：A

Phalaenopsis arunachalensis, a Little Known Species of Phalaenopsis

in China

DONG Xu1,2, XU Shisong1,3,4,5, YANG Hubiao1,3,4,5, WANG Qinglong1,3,4,5, YUAN Langxing1,3,4,5,

LIU Zhen6

, WANG Zhunian1,3,4,5, YANG Guangsui1,3,4,5, YIN Junmei1,3,4,5, WANG Jiabao1,3,4,5,

HUANG Mingzhong1,3,4,5*

1. Tropical Crops Genetic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou, Hainan 571101, China;

2. School of Horticulture, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China; 3. Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Danzhou, Hainan 571737, China; 4. Hainan Engineering Technology Research Center of Tropical Ornamental Plant Germplasm Innovation and Utilization, Danzhou, Hainan

571737, China; 5. Key Laboratory of Tropical Crops Germplasm Resources Genetic Improvement and Innovation of Hainan Province, Haikou, Hainan 570228, China; 6. Medog Forestry and Grassland Bureau, Linzhi, Tibet 860700, China

Abstract: Phalaenopsis arunachalensis K. Gogoi & Rinya is reported as a little known species from Medog, Tibet

Autonomous Region, China. The detailed morphological descriptions and photos are also provided. This species is

similar to P. honghenensis F. Y. Liu, P. wilsonii Rolfe and P. taenialis (Lindl.) Christenson & Pradhan. However, this

species has a minutely spurred that bends down, the free part of lateral lobes which are less than half length of the

mid-lobe, and dagger-like of lateral lobes ends, which can distinguish from other species.

Keywords: Phalaenopsis; plant taxonomy; Tibet

DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2023.11.007

蘭科是單子葉植物中最大的科，現有 736 屬 約 28 000 種[1]。蝴蝶蘭屬（Phalaenopsis Blume）

第 11 期 董 旭等：藏南蝴蝶蘭——中國蝴蝶蘭屬一未詳知種 2197

全球約 80 種，分布于熱帶亞洲至澳大利亞。我國

有 22 種，主要產于秦嶺以南[2-4]。近幾年，蝴蝶

蘭屬新類群不斷被報道[5-9]。

筆者在西藏墨脫的植物調查中發(fā)現了 1 種蝴

蝶蘭屬植物，通過查閱相關文獻和標本解剖，確

定該種蘭科植物為藏南蝴蝶蘭（P. arunachalensis）[10]。憑證標本保存于中國熱帶農業(yè)科學院熱

帶作物品種資源研究所植物標本室（ATCH）。

藏南蝴蝶蘭（新擬，圖 1~圖 2）

Phalaenopsis arunachalensis K. Gogoi &

Rinya, Lankesteriana. 2020, 20(3): 275-280.

Type: China. Tibet: Medog County, Lower

Subansiri, Ziro, 1400 m, 16 October 2019, fl. 15

April 2020, K. Gogoi and K. Rinya 00809 (Holotype: OHT; Isotypes: ASSAM, TOSEHIM).

附生草本，根叢生，扁平，表面多具疣狀突

起。莖長 1 cm，具 2~3 片葉。葉斜橢圓形，長 5~

10 cm，寬 2.5~3.5 cm，先端尖，葉鞘宿存，有紫

紅色斑點。花序近于垂直，總狀花序，長 15~25 cm，

具 5~6 朵花?；ò事研?，長約 6 mm?；ǘ渲?/p>

徑 3.0~3.2 cm，萼片和花瓣呈玫粉色，唇瓣紫色；

花梗和子房長 3.2~3.5 cm；中萼片長橢圓形，長

1.5~1.6 cm，寬 0.8 cm，先端鈍；側萼片斜橢圓卵

形，長 1.5 cm，寬 0.9 cm，先端鈍；花瓣匙型，

長 1.5 cm，寬 0.8 cm，先端鈍；唇瓣具距，3 裂；

側裂片長圓形，長 9 mm，寬 2 mm，先端斜截形；

中裂片長圓形，長 9 mm，寬 4 mm，邊緣向下彎

曲，先端稍鈍而不裂，上面中央具 1 條縱向脊突；

距乳頭狀，長 2 mm；中裂片基部具 1 枚叉狀附屬

物；兩側裂片之間具 1 枚中部呈凹陷狀的肉質胼

胝體。合蕊柱長 9 mm，具 2~3 mm 蕊柱足。藥帽

短喙狀，紫紅色?；ǚ蹓K 4 個，近球形。

圖 1 藏南蝴蝶蘭生境（晏啟 攝）

Fig. 1 Habitat of Phalaenopsis arunachalensis

(Photo by Yanqi)

A：花朵；B：中萼片；C：側萼片；D：花瓣；E：去除萼片和花瓣的花；F：唇瓣（左：正面；右：背面）；

G：花藥和藥帽（正面）；H：花藥和藥帽（背面）。

A: Flower; B: Dorsal sepal; C: Lateral sepal; D: Petal; E: Flowers without sepals and petals removed; F: Lip (left: front view; right: back

view); G: Pollinia and anther cap (front view); H: Pollinia and anther cap (back view).

圖 2 藏南蝴蝶蘭

Fig. 2 Phalaenopsis arunachalensis

花期：3—4 月。

生境：海拔 800~1700 m 的高大喬木上。

分布：中國西藏墨脫。

憑證標本： Tibet (西 藏 ), Medog (墨 脫 ),

Beibeng (背崩). elev. 1610 m, 2022-05-14, Huang

220524015 (ATCH), Primary andsecondary

broad-leaved forests.

討論：該種模式產地為我國藏南地區(qū)，原文

獻記載該物種為常綠類型。而據我們的野外觀察，

在水分充足的地方不落葉，當環(huán)境較干旱時也會

出現落葉現象，符合落葉蝴蝶蘭組（ Sect.

Aphyllae ）的習性。該種與紅河蝴蝶蘭（ P.

honghenensis）、華西蝴蝶蘭（P. wilsonii）和小尖

囊蝴蝶蘭（P. taenialis）相似，如圖 3[10-11]和圖 4。

藏南蝴蝶蘭與紅河蝴蝶蘭均具有明顯的距，但前

者側裂片為匕狀且分離部分的長度不及中裂片的

2198 熱帶作物學報 第 44 卷

一半；與小尖囊蝴蝶蘭區(qū)別在于后者具粗距且中

裂片末端平展；與華西蝴蝶蘭區(qū)別于后者不具明

顯的距，僅為不足 1 mm 的突起，并且唇基具爪，

側裂片為鐮刀狀。

A：藏南蝴蝶蘭[10]；B：華西蝴蝶蘭[11]；

C：紅河蝴蝶蘭[11]；D：小尖囊蝴蝶蘭[11]。

A: P. arunachalensis; B: P. wilsonii; C: P. honghenensis;

D: P. taenialis.

圖 3 藏南蝴蝶蘭及其近緣種的唇瓣側視圖比較

Fig. 3 Side view comparison of the lip of Phalaenopsis

arunachalensis and its relative species

A： 藏南蝴蝶蘭；B：華西蝴蝶蘭；C：紅河蝴蝶蘭。

A: P. arunachalensis; B: P. wilsonii; C: P. honghenensis.

圖 4 藏南蝴蝶蘭及其近緣種的花朵正視圖

Fig. 4 Front view of the flower of Phalaenopsis

arunachalensis and its relative species

致謝 感謝武漢市伊美凈科技發(fā)展有限公司晏啟工

程師提供精美的生境照片。在本研究過程中，承蒙西藏農

牧學院的陳學達和李孟凱，墨脫縣背崩鄉(xiāng)小學的白瑪措姆

校長，中國熱帶農業(yè)科學院的劉國道副院長、豐明處長和

秦曉威主任，中國熱帶農業(yè)科學院香料飲料研究所的蘇凡

和吉訓志，中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所

的覃星導副所長和董建琪等同志在野外考察中的指導與

幫助，謹以致謝！

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熱帶作物學報 2023, 44(11): 2199?2207

Chinese Journal of Tropical Crops

收稿日期 2022-09-08；修回日期 2022-11-07

基金項目 格西溝國家級自然保護區(qū)蘭科資源調查項目（No. 0703-1941CNIITC2027）；雅江縣生物物種（植物）調查評估服

務項目（No. N5133112022000016）；四川水利職業(yè)技術學院科研項目（No. 2021SCSZYD-04）。

作者簡介 鄭 煒（1985—），女，博士，教授，研究方向：植物資源調查與生態(tài)環(huán)境保護。*通信作者（Corresponding author）：

劉勝祥（LIU Shengxiang），E-mail：1612066112@qq.com。

四川格西溝國家級自然保護區(qū)蘭科植物多樣性與分布格局研究

鄭 煒1

，晏 啟2

，施要強1

，伍小剛3

，李 剛4

，劉勝祥5*，李八斤4

，張 惠4

，

謝貴模2

，楊紹平1

1. 四川水利職業(yè)技術學院資源環(huán)境工程學院，四川成都 611231；2. 武漢市伊美凈科技發(fā)展有限公司，湖北武漢

430070；3. 中國科學院成都生物研究所，四川成都 610041；4. 雅江縣林業(yè)和草原局，四川雅江 627450；5. 華中

師范大學，湖北武漢 430079

摘 要：為了解四川格西溝國家級自然保護區(qū)蘭科植物多樣性與分布特征，于 2020 和 2021 年采用樣線樣方結合法，

在保護區(qū)內進行系統(tǒng)性調查，共設置了 17 條總長 95 km 的樣線，涵蓋保護區(qū)各功能區(qū)、生境類型以及海拔范圍。結果

表明：（1）保護區(qū)內調查到蘭科植物 20 屬 34 種。其中珍稀瀕危物種有 10 種，包括 5 種國家二級保護野生種類；四川

省新記錄種 2 種[褐花羊耳蒜（Liparis brunnea）、齒突羊耳蒜（L. rostrata）]；生活型以地生蘭為主，屬的地理成分以

北溫帶分布占絕對優(yōu)勢。（2）34 種蘭科植物共調查到 6703 株，分布于 290 個點位，以二葉盔花蘭（Galearis spathulata）

數量最多，大花鳥巢蘭（Neottia megalochila）最少，火燒蘭（Epipactis helleborine）分布點位最多。紫點杓蘭（Cypripedium

guttatum）植株高度與海撥呈極顯著負相關性，其余種類在同物候期的種間高度變化輕微。（3）保護區(qū) 3100~3300 m 內

的蘭科植物種屬數最多，其次是 2900~3100 m 區(qū)間，3900~4100 m 內的蘭科植物數量最多。（4）頭蕊蘭（Cephalanthera

longifolia）數量與坡度因子呈顯著的中度正相關，二葉盔花蘭數量與海拔呈顯著的強正相關，叉唇角盤蘭（Herminium

lanceum）數量與植被呈顯著的強正相關，角盤蘭屬（Herminium）數量與海撥呈顯著的中度負相關。綜上，在四川省

內，格西溝自然保護區(qū)的蘭科植物資源相對豐富，分布格局符合“中間高度膨脹型”，大部分種類的數量與環(huán)境因子不

顯著相關，與歷史上對該保護區(qū)的調查相比，本次調查到的蘭科植物種屬數量大幅增加，但有 3 種國家重點保護且觀

賞價值高的杓蘭屬植物未調查到，1 種杓蘭屬植物在調查期間種群數量下降。因此，對保護區(qū)的蘭科植物保護、宣傳、

執(zhí)法等刻不容緩。

關鍵詞：蘭科；數量；分布；環(huán)境

中圖分類號：Q948 文獻標識碼：A

Diversity and Distribution Pattern of Orchids in Gexigou National

Nature Reserve, Sichuan, China

ZHENG Wei1

, YAN Qi2

, SHI Yaoqiang1

, WU Xiaogang3

, LI Gang4

, LIU Shengxiang5*, LI Bajin4

, ZHANG Hui4

,

XIE Guimo2

, YANG Shaoping1

1. College of Resources and Environment, Sichuan Water Conservancy College, Chengdu, Sichuan 611231, China; 2. Wuhan

Imagination Science and Technology Development Co. Ltd., Wuhan, Hubei 430070, China; 3. Chengdu Institute of Biology, Chinese

Academy of Sciences, Chengdu, Sichuan 610041, China; 4. Yajiang County Forestry and Grassland Administration, Yajiang, Sichuan 627450, China; 5. Central China Normal University, Wuhan , Hubei 430079, China

Abstract: In order to understand the diversity and distribution characteristics of orchids in Gexigou National Nature

Reserve in Sichuan province, a systematic survey was conducted using the line transect combined with sample sampling

method from 2020 to 2021. A total length of 95 km including 17 lines were set up, covering various function, habitat and

2200 熱帶作物學報 第 44 卷

elevation of the reserve. 34 species of Orchidaceae in 20 genera were investigated. Among them, 10 were rare and endangered species, five were wild species under second-class national protection; and two (Liparis brunnea and L. rostrate)

were new record species in Sichuan province. Most of them were mainly in terrestrial orchid of life type and absolutely

dominant in north temperate zone of geographical. A total of 6703 orchids of 34 species were investigated and distributed in 290 sites. Galearis spathulata and Neottia megalochila were the most and least abundant species respectively,

and Epipactis helleborine was the most widely-distributed. Among them, the height of Cypripedium guttatum showed a

significant negative correlation with elevation, while there was a slightly correlation in other species. Most of Orchidaceae genera were distributed in 3100-3300 m, followed by 2900-3100 m, while the maximum number of individuals

were distributed in 3900-4100 m. The number of Cephalanthera longifolia was positively correlated with slope significantly, the number of Galearis spathulata was positively correlated with elevation significantly, the number of Herminium

lanceum was positively correlated with vegetation significantly, the number of whole genus of Herminium was positively

correlated with elevation moderately. In general, the orchid resources in Gexigou Nature Reserve are relatively rich, and

more distribute in the middle elevation. The number of some species is significantly correlated with environmental factors.

Compared with the previous investigations in this reserve, the number of orchid species is significantly increased. However,

three national protected species of Cypripedium with high ornamental value were not found, and the population of one

species of Cypripedium decreased. Therefore, it is urgent to protect, publicize and enforce the law on orchids in the reserve.

Keywords: Orchidaceae; quantity; distribution; environment

DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2023.11.008

蘭科是世界上被子植物中的第三大的科[1]，全

世界蘭科植物約有 736 屬 28 000 種[2]?！吨袊参?/p>

志》中共收錄中國野生蘭科植物 171 屬 1247 種[3]；

2000—2019 年間，研究人員發(fā)現并正式發(fā)表中國蘭

科植物共 376 種，使中國蘭科植物增至 1677 種[4]；

而正在進行的全國野生蘭科植物資源專項調查項

目階段性成果中又報道了 43 個新種和新記錄種[5]；

中國蘭科植物合計達 1720 種。蘭科植物又是世界

上最受威脅的類群之一[6]，在全球瀕危物種數據

庫中有超過 600 種蘭科植物[7]，《野生動植物瀕危

物種國際貿易公約》（CITES）中，將所有蘭科植

物納入保護范圍[8]，2021 年中國調整后的《國家

重點保護野生植物名錄》中，也新增了蘭科植物

中的兜蘭屬大部分植物作為國家一級保護野生植

物，蘭屬大部分、杓蘭屬大部分等作為國家二級

保護野生植物[9]。蘭科植物作為一個亟須重點保

護的類群，其野外種群容易受到自身及外界因素

的影響從而產生巨大的變化。因此，本研究針對

格西溝國家級自然保護區(qū)的蘭科植物種類、區(qū)系

地理及分布格局進行初步研究，為保護區(qū)決策部

門制訂野生蘭科植物保護策略提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

四川格西溝國家級自然保護區(qū)（以下簡稱格西

溝自然保護區(qū)）在 1993 年成立，于 2012 年晉升為

國家級。保護區(qū)位于四川省甘孜藏族自治州雅江縣

河口鎮(zhèn)，距縣城 3 km，地處雅礱江中游右岸、青

藏高原東南部橫斷山脈地帶，地理位置為東經

100°46′51″~101°02′32″，北緯 29°47′52″~30°05′30″，

南北長 23.56 km，東西寬 15.29 km，總面積

22 896.8 hm2

（圖 1）。海拔幅度在 2600~4702 m

圖 1 格西溝自然保護區(qū)地理位置

Fig. 1 Geographical location of Gexigou National

Nature Reserve

第 11 期 鄭 煒等：四川格西溝國家級自然保護區(qū)蘭科植物多樣性與分布格局研究 2201

之間，東部雅礱江河谷海拔較低。屬大陸性季風

高原型氣候特征，年均氣溫 2~10 ℃，平均降水量

約 705 mm，有明顯的旱季（11—翌年 4 月），植

被和土壤類型豐富[10]。

1.2 方法

采用樣線和樣方法對保護區(qū)蘭科植物開展野

外調查。于 2020 年 8 月和 2021 年 6—7 月選擇蘭

科植物的主要開花期開展調查。在考慮可達性的

前提下，盡量將樣線均勻布設于核心區(qū)、緩沖區(qū)

和實驗區(qū)，涵蓋不同海拔帶、溝谷、山坡、山頂

生境。考察樣線合計 17 條，總長度 95 km，海拔

區(qū)間介于 2700~4300 m 之間，生境以溝谷和山坡

為主，山頂相對較少（圖 2）。

圖 2 蘭科植物調查樣線與樣點圖

Fig. 2 Orchids survey sample line and sample point map

對樣線上所有蘭科植物進行調查，記錄種類、

數量、高度、物候、地理坐標、坡度、坡向等，

對每種蘭科植物設置典型樣方了解其植被類型信

息。每種蘭科植物的分布有時具有成叢性，如黃

花杓蘭（Cypripedium flavum）、山西杓蘭（C.

shanxiense），有時具有明顯的連續(xù)性，連續(xù)分布

于同一植被類型、坡向和坡度的生境內，將這些

成叢分布以及連續(xù)（不超過 20 m）分布的個體于

同一個分布點位，統(tǒng)計每種蘭科植物的分布點位

和分布數量。

1.3 數據處理

調查數據錄入 Excel 2010 軟件，并在 SPSS 19

軟件中進行相關性分析；用 Shapiro-Wilk 軟件對

數據進行正態(tài)性檢驗，不符合正態(tài)分布的數據先

進行正態(tài)轉換后，用 Pearson 相關系數分析相關

性；對轉換后仍無法滿足正態(tài)分布的數據，用

Spearman 相關系數分析相關性。調查路線采用

ArcGIS 10. 8 軟件進行制圖。

2 結果與分析

2.1 格西溝自然保護區(qū)蘭科植物種類與區(qū)系

通過野外調查累積調查到蘭科植物 20 屬 34

種[其中 1 種未知屬種，物種分類系統(tǒng)參照中國植

物志英文版（Flora of China），表 1]。其中，國家

二級重點保護野生植物 5 種：黃花杓蘭、紫點杓

蘭 （ C. guttatum ）、 山 西 杓 蘭 、 西 南 手 參

（Gymnadenia orchidis）和獨蒜蘭（Pleione bulbocodioides）。根據《中國物種紅色名錄》，有瀕

危種 1 種：紫點杓蘭；易危種 3 種：黃花杓蘭、

山西杓蘭、西南手參；近危種 5 種：西藏玉鳳花

（Habenaria tibetica）、扇唇舌喙蘭（Hemipilia

flabellata）、角盤蘭（Herminium monorchis）、寬

萼角盤蘭（H. souliei）、川西兜被蘭（Neottianthe

compacta）。四川省蘭科種類新記錄種 2 種，分

別是褐花羊耳蒜（Liparis brunnea）、齒突羊耳蒜

（L. rostrata）（圖 3）。

34 種蘭科植物中，腐生蘭有 3 種（7.9%）：

高山鳥巢蘭（Neottia listeroides）、尖唇鳥巢蘭（N.

acuminata）、大花鳥巢蘭（N. megalochila），附

生蘭僅有獨蒜蘭（ 2.6% ），其余均為地生蘭

（89.5%）。

除去 1 種不知屬種的蘭科植物，20 屬中，鳥

巢蘭屬有 4 個種，杓蘭屬、角盤蘭屬、兜被蘭屬、

舌喙蘭屬均有 3 個種，羊耳蒜屬、舌唇蘭屬、玉

鳳花屬有 2 個種，其余 12 個屬內均只含 1 種。在

屬級水平上，將格西溝的蘭科植物 20 屬劃分為 7

個類型 2 個變型（表 2）。熱帶分布占 20%，溫帶

分布占 65%。說明保護區(qū)內蘭科植物屬以溫帶分

布占優(yōu)勢，尤其是北溫帶分布，達 8 屬，占 40%。

中國-喜馬拉雅分布有 1 屬。

2202 熱帶作物學報 第 44 卷

表 1 格西溝自然保護區(qū)蘭科植物名錄

Tab. 1 List of orchids in Gexigou National Nature Reserve

屬名

Genus

種

Species

保護區(qū)內典型生境

Typical habitat in the reserve

瀕危狀況

Endangered

status

保護等級

Protection

level

蝦脊蘭屬 Calanthe 蝦脊蘭屬未知種 Calanthe sp. 山楊林下，苔蘚多的地面

頭蕊蘭屬 Cephalanthera 頭蕊蘭 Cephalanthera longifolia 黃背櫟林林下，腐殖質層厚的地面

黃花杓蘭 Cypripedium flavum 夾雜有高山松的闊葉林林緣和林下，苔蘚多的

地面

易危 國家二級

紫點杓蘭 Cypripedium guttatum 低海拔處在有高山松的闊葉林林緣和林下，苔

蘚多的地面；高海拔處在杜鵑灌叢林下

瀕危 國家二級

杓蘭屬 Cypripedium

山西杓蘭 Cypripedium shanxiense 夾雜有高山松的闊葉林林緣和林下，苔蘚多的

地面

易危 國家二級

火燒蘭屬 Epipactis 火燒蘭 Epipactis helleborine 山坡林下、草叢或溝邊多種生境

盔花蘭屬 Galearis 二葉盔花蘭 Galearis spathulata 杜鵑灌叢林下或草叢中，有苔蘚的地面

斑葉蘭屬 Goodyera 小斑葉蘭 Goodyera repens 杜鵑灌叢林下，有苔蘚的多石少土山坡處

手參屬 Gymnadenia 西南手參 Gymnadenia orchidis 高山草地、山坡林緣，石礫較多的地面 易危 國家二級

玉鳳花屬 Habenaria 落地金錢 Habenaria aitchisonii 白樺林下，有苔蘚的陡坡處

西藏玉鳳花 Habenaria tibetica 鱗皮冷杉或高山松櫟類混交林下，有苔蘚的陡

坡處

近危

舌喙蘭屬 Hemipilia 心葉舌喙蘭 Hemipilia cordifolia 高山松林下，石質巖石上

扇唇舌喙蘭 Hemipilia flabellata 高山松林下，石質巖石上 近危

角盤蘭屬 Herminium 叉唇角盤蘭 Herminium lanceum 各種林下、灌叢下或草地中

角盤蘭 Herminium monorchis 河灘邊草地中 近危

寬萼角盤蘭 Herminium souliei 各種林下、灌叢下或草地中 近危

羊耳蒜屬 Liparis 褐花羊耳蒜 Liparis brunnea 灌木林下，苔蘚多的地面

齒突羊耳蒜 Liparis rostrata 鱗皮冷杉林下石上覆土中

原沼蘭屬 Malaxis 原沼蘭 Malaxis monophyllos 高山松林下

鳥巢蘭屬 Neottia 高山鳥巢蘭 Neottia listeroides 松櫟類混交林林下林窗處

尖唇鳥巢蘭 Neottia acuminata 松櫟類混交林林下

大花鳥巢蘭 Neottia megalochila 松櫟類混交林林下

西藏對葉蘭 Neottia pinetorum 灰背高山櫟林下

兜被蘭屬 Neottianthe 川西兜被蘭 Neottianthe compacta 高山草地中 近危

二葉兜被蘭 Neottianthe cucullata 栒子灌叢林下

二葉兜被蘭（原變種）

Neottianthe cucullata var. cucullata

針闊葉混交林下，苔蘚密生處

闊蕊蘭屬 Peristylus 一掌參 Peristylus forceps 林緣草地上

舌唇蘭屬 Platanthera 二葉舌唇蘭

Platanthera chlorantha

白樺林下

小舌唇蘭 Platanthera minor 杜鵑灌叢林下

獨蒜蘭屬 Pleione 獨蒜蘭 Pleione bulbocodioides 高山松林林緣苔蘚覆蓋的巖石上 國家二級

小紅門蘭屬 Ponerorchis 廣布小紅門蘭

Ponerorchis chusua

松櫟杜鵑林下林窗處

鳥足蘭屬 Satyrium 鳥足蘭（原變種）

Satyrium nepalense var. ciliatum

草坡上、疏林下或高山松林下

綬草屬 Spiranthes 綬草 Spiranthes sinensis 路邊次生草地或山坡草地上

未知屬 未知種 闊葉林林緣

第 11 期 鄭 煒等：四川格西溝國家級自然保護區(qū)蘭科植物多樣性與分布格局研究 2203

褐花羊耳蒜（L. brunnea） 齒突羊耳蒜（L. rostrata）

圖 3 四川省蘭科植物 2 個新記錄種

Fig. 3 Two new record species of orchids in

Sichuan province

2.2 格西溝自然保護區(qū)蘭科植物數量、物候、

高度特征

所有樣線的 2 次調查合計 34 種 6703 株蘭科

植物。各蘭科植物的分布點位和數量如圖 4 所示，

其中二葉盔花蘭（Galearis spathulata）最多，達

1972 株，大花鳥巢蘭最少僅 1 株；超過 100 株的

有 13 種，10~100 株之間的有 14 種，10 株之內的

有 8 種。所有蘭花共分布于 290 個點位，其中火

燒蘭（Epipactis helleborine）點位最多，達到 45

個點位，分布點位大于等于 10 個的有 9 種，小于

10 個的有 26 種，有 5 種只分布于 1 個點位。

表 2 格西溝自然保護區(qū)蘭科植物分布區(qū)類型

Tab. 2 Types of orchids in Gexigou National Nature Reserve

分布區(qū)類型 Distribution type 屬 Genera 屬數 Number of genera 占比 Percentage/%

1.世界分布 羊耳蒜屬、原沼蘭屬 2

2.泛熱帶分布 蝦脊蘭屬 1 5

5.熱帶亞洲至熱帶澳大利亞分布 闊蕊蘭屬 1 5

6.熱帶亞洲至熱帶非洲分布 鳥足蘭屬 1 5

7-2.熱帶印度至華南分布 獨蒜蘭屬 1 5

8.北溫帶分布 杓蘭屬、盔花蘭屬、小紅門蘭屬、舌唇蘭屬、玉鳳

花屬、斑葉蘭屬、火燒蘭屬、綬草屬

8 40

9.東亞-北美間斷分布 頭蕊蘭屬 1 5

10.歐亞溫帶分布或舊世界溫帶分布 角盤蘭屬、手參屬、鳥巢蘭屬、兜被蘭屬 4 20

14-2.中國-喜馬拉雅分布 舌喙蘭屬 1 5

圖 4 蘭科植物分布數量與點位

Fig. 4 Number and location of orchids

由于調查月份在 6—8 月，是該地區(qū)大多蘭科

植物的主花期。植株高度在 3~40 cm 之間，對同

樣物候的同種蘭科植物而言，不同植株之間高度

變化很小。比較特殊的是紫點杓蘭，同樣是花期，

2204 熱帶作物學報 第 44 卷

其最大個體高達 30 cm，最小個體高度僅 5 cm，

海拔越高，個體越小。Pearson 相關系數也表明，

其個體高度與海拔之間呈極顯著負相關關系（r=

–0.968，P<0.01）。

2.3 格西溝自然保護區(qū)蘭科植物整體分布

在垂直分布上，自然保護區(qū)海拔區(qū)間為 2700~

4702 m，本次調查海拔為 2700~4300 m，出現蘭科

植物的海拔區(qū)間為2823~4055 m。以 200 m為梯度，

制作保護區(qū)蘭科植物分布海拔圖（圖 5）。在

3100~3300 m 內的蘭科植物種屬數最多，有 14 屬

23 種，其次是 2900~3100 m 區(qū)間。而 3900~4100 m

內的蘭科植物數量最多，遠高于其他海拔區(qū)間。

圖 5 保護區(qū)不同海拔區(qū)間的蘭花種類和數量

Fig. 5 Species and quantity of orchids at different elevation in the reserve

在水平分布上，格西溝自然保護區(qū)的核心區(qū)

有 16 屬 21 種合計 2336 株蘭科植物，緩沖區(qū)有 8

屬 9 種合計 202 株蘭科植物，實驗區(qū)有 17 屬 25

種合計 4165 株蘭科植物。北部（格西溝流域）有

14 屬 21 種 1822 株蘭科植物，中部（G318 及無

名河及兩側）有 12 屬 15 種合計 2941 株蘭科植物，

南部（下獨溝流域）有 15 屬 19 種合計 1940 株蘭

科植物。

2.4 屬/種內分布與環(huán)境因素關系

本次調查中記錄了各蘭科植物分布點位的植

被類型、坡向和坡度，記錄的植被類型有自然保

護區(qū)科學考察集[10]中提到的針葉林（21 種 2730

株）、針闊葉混交林（26 種 2039 株）、落葉闊葉

林（2 種 12 株）、常綠闊葉林（2 種 11 株）、落葉

闊葉灌叢（7種 247株）、常綠闊葉灌叢（6種 1159）、

高山草甸（1 種 7 株）、流石灘（1 種 17 株）。并

根據實際情況，新增了雜草草地和裸地這 2 個次

生植被/土地類型，種類數量均較少，其中雜草草

地中僅有綬草和寬萼角盤蘭，裸地中有火燒蘭、

二葉舌唇蘭和扇唇舌喙蘭。坡度按 0°、30°以下和

30°以上分 3 類，平地上有 12 種 271 株，緩坡上

有 28 種 4294 株，陡坡上則有 20 種 2138 株，尤

以扇唇舌喙蘭分布區(qū)坡度最大，部分區(qū)域接近垂

直，落地金錢和西藏玉鳳花次之。坡向按北、北

偏東、東偏北、東等依次劃分的 12 種坡向，其中，

北向有 14 種 1833 株，北東向 12 種 1056 株，東

北向 5 種 36 株，東南向 13 種 854 株，南東向 7

種 139 株，南向 3 種 70 株，南西向 10 種 170 株，

西南向 5 種 46 株，西向 14 種 758 株，西北向 18

種 1295 株，北西向 9 種 125 株，其余為無坡向。

此外，對分布點位大于等于 10 的物種或多種

的屬[包括頭蕊蘭（23 點位 184 株）、杓蘭屬（23

點位 284 株）及紫點杓蘭（18 點位 230 株）、火

燒蘭（45 點位 209 株）、二葉盔花蘭（13 點位 1972

株）、西南手參（10 點位 41 株）、舌喙蘭屬（11

點位 493 株）、角盤蘭屬（45 點位 824 株），叉唇

角盤蘭（25 點位 393 株），寬萼角盤蘭（18 點位

373 株）、鳥巢蘭屬（13 點位 50 株），鳥足蘭（原

變種）（10 點位 374 株）、綬草（37 點位 585 株），

進行分布數量與環(huán)境因素的相關性分析。結果表

明：僅頭蕊蘭數量與坡度因子呈顯著正相關；二

葉盔花蘭的數量與海拔呈極顯著正相關；叉唇角

盤蘭數量與植被呈極顯著正相關；角盤蘭屬數量

與海撥呈顯著負相關（表 3）。

3 討論

3.1 格西溝自然保護區(qū)蘭科植物資源相對豐富

西南地區(qū)是中國蘭科植物最為突出的地區(qū)之

一[11]，據記載，四川有蘭科植物 450 余種[12]，2020

年至今，又報道了十余種蘭科植物四川省新記錄

種[13~16]，四川蘭科植物有近 460 種。格西溝自然

保護區(qū)內的 38 種蘭科植物占四川省蘭科植物的

8.44%，占全國 1720 種蘭科植物的 2.21%。與鄰近

的栗子坪國家級自然保護區(qū)[17]（102°10′33″E~

102°29′07″E，28°51′02″N~29°08′42″N）和臥龍國

家級自然保護區(qū) [18] （ 102°52′E~103°25′E ，

30°45′N~31°25′N）相比，格西溝保護區(qū)雖然蘭科

植物種屬最少，但其單位面積上的蘭科植物種數

是其他保護區(qū)的 4~114 倍。此外，從蘭科植物株

數來看，格西溝自然保護區(qū)內調查到的株數達到

6703 株，遠高于栗子坪保護區(qū)的 1800 株（表 4）。

加上 2 種四川省蘭科種類新記錄，說明在四川省

內，該保護區(qū)的蘭科植物資源相對豐富。

第 11 期 鄭 煒等：四川格西溝國家級自然保護區(qū)蘭科植物多樣性與分布格局研究 2205

表 3 蘭科植物種內數量分布與環(huán)境因子的相關系數

Tab. 3 Correlation coefficient between intraspecific

quantitative distribution of orchids and

environmental factors

項目

Item

海拔

Elevation

植被

Vegetation

坡度

Slope

坡向

Aspect

頭蕊蘭數量 –0.268 0.259 0.415* 0.109

紫點杓蘭數量 –0.100 0.282 0.274 –0.090

杓蘭屬數量 –0.011 0.235 0.263 –0.184

火燒蘭數量 –0.049 0.108 0.061 –0.262

二葉盔花蘭數量 0.688**

西南手參數量 0.395 0.484 0.410 0.397

舌喙蘭屬數量 0.274 –0.160 0.224 –0.034

叉唇角盤蘭數量 –0.162 0.639** –0.241 0.166

寬萼角盤蘭數量 –0.417 –0.342 0.197 –0.195

角盤蘭屬數量 –0.307* 0.196 –0.064 0.261

鳥巢蘭屬數量 0.066 –0.067 0.438 –0.327

鳥足蘭(原變種)數量 0.453 0.235 0.059

綬草數量 –0.204 0.009 0.102 0.008

注：陰影數據為 Pearson 相關系數，其余為 Spearman 相關

系數；**表示在 0.01 水平（雙側）上極顯著相關，*

表示在 0.05

水平（單側）上顯著相關。

Note: Shaded data are Pearson’s correlation coefficients, and

others are Spearman’s correlation coefficients; ** indicate extremely

significant correlation at 0.01 level (two-sided), *

indicates significant correlation at 0.05 level (one-sided).

表 4 格西溝與相鄰區(qū)蘭科植物比較

Tab. 4 Comparison of orchids between Gexigou and

adjacent areas

自然保護區(qū)

Nature

reserve names

屬數

Number

of genera

種數

Number

of species

野外調查株數

Number of plants

in field survey

面積

Area/hm2

格西溝 21 38 34 種 6703 株 22 896.8

栗子坪 30 70 26 種 1800 株 4 794 000.0

臥龍 32 74 無調查數據 200 000.0

3.2 格西溝自然保護區(qū)蘭科植物分布格局

保護區(qū)內蘭科植物的種類豐富度在水平分布

上比較平均，北部略多于南部，中部最少，這與

3 個區(qū)域大環(huán)境無論海拔高度還是與雅礱江的距

離都類似有關，因此沒有很大的差異。在垂直分

布上，3100~3300 m 區(qū)間的蘭科植物種屬最多，

物種多樣性最高，符合“中間高度膨脹型”，與貴

州佛頂山國家級自然保護區(qū)的蘭科植物分布[19]

相似。

調查到的 34 種 6703 株蘭科植物，主要處于

針葉林、針闊葉混交林和高山灌叢植被類型中，3

種生境下數量比例達到 88%，這 3 種植被類型大

多是原生植被類型，適應蘭科植物生長。而裸地

和雜草草地是由保護區(qū)內道路影響形成，綬草、

寬萼角盤蘭、火燒蘭、二葉舌唇蘭、扇唇舌喙蘭

等已擴張到這些次生生境，說明其適應性較好、

生境廣泛。蘭科植物主要分布于緩坡上，陡坡上

常見的扇唇舌喙蘭、落地金錢和西藏玉鳳花大多

生長于多石基質，靠苔蘚或石縫即可存活。在不

同坡向上的數量排序中，排名前 5 位的坡向中，

陰坡半陰坡占 4 位，比例達 73%，說明北坡、西

北、北東和西坡等陰坡半陰坡是蘭科植物的主要

生境，陽坡出現的有火燒蘭、頭蕊蘭、綬草、廣

布小紅門蘭、寬萼角盤蘭、綬草、叉唇角盤蘭、

小斑葉蘭等。

從不同蘭科植物種/屬分布數量與環(huán)境因子

的相關性分析結果來看，大部分物種/屬的分布數

量與環(huán)境因子無顯著相關關系，二葉盔花蘭和角

盤蘭屬的數量都與海拔顯著相關。二葉盔花蘭在

高海撥區(qū)成片集群分布，最大集群量達到 504 株，

已成為杜鵑常綠闊葉灌叢的草本層優(yōu)勢物種。而

角盤蘭屬則傾向于成群分布于低海拔區(qū)域，它們

個體間間距常常很近。頭蕊蘭的數量則與坡度因

子呈顯著正相關，在平坦地段數量少，在陡峭崎

嶇之處生長更多。叉唇角盤蘭的數量與植被呈極

顯著正相關，在針闊葉混交林下分布明顯，較針

葉林下更多。

4 展望

受保護區(qū)地形地貌及空間可達性制約，本研

究對山頂區(qū)域的調查不甚充足，尤其是高海拔的

4300~4700 m 區(qū)域，還應對其進行詳細調查。建

議對保護區(qū)內一些蘭科種類集中分布的區(qū)域設立

保護點并進行監(jiān)測，對那些數量和點位均較少的

蘭科植物尤其是珍稀瀕危植物開展保育與繁殖生

態(tài)學研究。

本研究歷時 2 年，在前后 2 次同路線的調查

中，有 4 株叢生于低海拔且靠近國道 318 的紫點

杓蘭消失。此外，與前人在該保護區(qū)內蘭科植物

調查[10, 20]相比，雖然本次調查獲得的蘭科植物種

屬數大幅增加，但也失去了毛杓蘭（C. franchetii），

無苞杓蘭（C. bardolphianum）和西藏杓蘭（C.

tibeticum）的蹤跡。這幾種杓蘭都是國家保護種

類，也是觀賞價值較高的種類，花期很容易被發(fā)

現，因此推測是人為破壞帶來的種類消失和減少。

2206 熱帶作物學報 第 44 卷

如今川西旅游熱度持續(xù)上漲，318 線自駕人車逐

年增多，加強對保護區(qū)內觀賞蘭科植物的宣傳保

護及森林執(zhí)法刻不容緩。

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熱帶作物學報 2023, 44(11): 2208?2218

Chinese Journal of Tropical Crops

收稿日期 2022-12-20；修回日期 2023-01-31

基金項目 國家重點研發(fā)計劃項目（No. 2021YFD1200200）。

作者簡介 徐 言（1998—），女，碩士研究生，研究方向：蘭花種質資源與遺傳育種。*通信作者（Corresponding author）：

于曉南（YU Xiaonan），E-mail：yuxiaonan626@126.com；賈瑞冬（JIA Ruidong），E-mail：jiaruidong@caas.cn。

基于 SSR 標記的西南地區(qū)野生帶葉兜蘭資源遺傳多樣性分析

徐 言1,2，陳之光2

，徐玉鳳2

，葛 紅2

，楊樹華2

，趙 鑫2

，寇亞平2

，

于曉南1*，賈瑞冬2*

1. 北京林業(yè)大學園林學院/花卉種質創(chuàng)新與分子育種北京市重點實驗室/國家花卉工程技術研究中心/城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京市實

驗室，北京 100083；2. 中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所/農業(yè)農村部花卉生物學與種質創(chuàng)制重點實驗室（北方），北京

100081

摘 要：帶葉兜蘭[Paphiopedilum hirsutissimum (Lindl. ex Hook. f.) Stein]具有較高的觀賞價值，是中國珍稀瀕危保護植

物。為了研究中國西南地區(qū)野生帶葉兜蘭資源的遺傳特性，促進野生帶葉兜蘭資源的保護和利用，本研究利用 SSR 分

子標記技術對中國西南地區(qū)廣西、云南、貴州 3 ?。▍^(qū)）收集的 6 個居群 190 份帶葉兜蘭資源進行遺傳多樣性和群體

遺傳結構分析。結果表明：從 115 對引物中共篩選出 10 對擴增效果好的引物，10 對 SSR 引物在 190 份帶葉兜蘭中共

檢測到 50 個等位基因，平均每個位點等位基因（Na）為 5 個，平均有效等位基因數（Ne）為 2.4835 個；平均 Shannon

信息指數（I）為 0.8592，平均觀測雜合度（Ho）為 0.4518；平均期望雜合度（He）為 0.4387，平均 Nei’s 基因多樣性

指數（h）為 0.4370，平均多態(tài)信息含量（PIC）為 0.3996。6 個野生帶葉兜蘭居群的 Na為 2.8000~4.3000，Ne為 1.9655~2.4060，

Ho 為 0.3891~0.4839，He 為 0.3795~0.4683，Shannon 信息指數（I）為 0.6584~0.8369，Nei’s 基因多樣性指數（h）為

0.3648~0.4382。廣西雅長（GYC）和貴州萬峰湖（QWF）居群具有較高的遺傳多樣性（h=0.4382, h=0.4276），廣西木

論（GML）居群具有最低的遺傳多樣性（h=0.3648）。分子方差分析（AMOVA）結果表明，遺傳變異主要發(fā)生在居群

內個體間（94%），而居群內遺傳分化很?。?%）?；谶z傳距離構建的 UPGMA 聚類分析結果顯示，6 個居群遺傳距

離較小，居群間遺傳距離和地理位置不完全相關。Structure 和主坐標分析結果表明，居群間存在均質化現象，無明顯

類群劃分。綜上，帶葉兜蘭資源遺傳多樣性較為豐富，研究結果可為中國西南地區(qū)野生帶葉兜蘭資源的保護和利用提

供理論依據。

關鍵詞：帶葉兜蘭；野生居群；SSR 標記；遺傳多樣性；遺傳結構

中圖分類號：S682.31 文獻標識碼：A

Genetic Diversity of Wild Paphiopedilum hirsutissimum Populations in

Southwest China with SSR Markers

XU Yan1,2, CHEN Zhiguang2

, XU Yufeng2

, GE Hong2

, YANG Shuhua2

, ZHAO Xin2

, KOU Yaping2

,

YU Xiaonan1*, JIA Ruidong2*

1. College of Landscape Architecture, Beijing Forestry University / Beijing Key Laboratory of Ornamental Plants Germplasm Innovation & Molecular Breeding / National Engineering Research Center for Floriculture / Beijing Laboratory of Urban and Rural Ecological Environment, Beijing 100083, China; 2. Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences /

Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Flower Crops (North China), Ministry of Agriculture and Rural Affairs,

Beijing 100081, China

Abstract: Paphiopedilum hirsutissimum (Lindl. ex Hook. f.) Stein is a rare and endangered plant in China with high

ornamental value. In order to explore the genetic characteristics of wild P. hirsutissimum resources in Southwest China,

and contribute to the protection and utilization of the wild resources, this study used SSR molecular marker to analyze

第 11 期 徐 言等：基于 SSR 標記的西南地區(qū)野生帶葉兜蘭資源遺傳多樣性分析 2209

the genetic diversity and population genetic structure of 190 P. hirsutissimum resources which collected from six populations in Guangxi, Yunnan and Guizhou provinces in Southwest China. In this study, the results showed that ten pairs of

primers with good amplification effect were selected from 115 pairs of primers, and 50 alleles were detected by 10 pairs

of SSR primers of 190 P. hirsutissimum. The average number of alleles (Na) was five and the average number of effective alleles (Ne) was 2.4835. The average Shannon information index (I) was 0.8592. The average observed heterozygosity (Ho) was 0.4518 and the average expected heterozygosity (He) was 0.4387. The average polymorphic information

content (PIC) was 0.3996 and the average Nei’s expected heterozygosty (h) was 0.4370. In this six wild P. hirsutissimum

populations, the number of alleles (Na) was from 2.8000 to 4.3000. The number of effective alleles (Ne) was from 1.9655

to 2.4060. The observed heterozygosity (Ho) was from 0.3891 to 0.4839. The expected heterozygosity (He) was from

0.3795 to 0.4683. The Shannon information index (I) was from 0.6584 to 0.8369, and the Nei’s expected heterozygosty

(h) was from 0.3648 to 0.4382. In the six wild populations, the genetic diversity of Guangxi Yachang (GYC) and

Guizhou Wanfeng Lake (QWF) populations was generally higher (h=0.4382, h=0.4276), while the genetic diversity of

Guangxi Mulun (GML) population was relatively low (h=0.3648). Analysis of molecular variance (AMOVA) results

showed that genetic variation mainly occurred among individuals within the population (94%), while genetic differentiation within populations was very small (6%). UPGMA cluster analysis based on genetic distance showed that the genetic distance of the six P. hirsutissimum populations was very small, there was no obvious group division and the genetic distance was not completely related to the geographical location. The results of Structure and principal coordinate

analysis were consistent with those of UPGMA cluster analysis. Structure and principal coordinate analysis results

showed that there was homogenization among the populations, and there was no obvious group division. In summary,

the genetic diversity of Paphiopedilum hirsutissimum resources is relatively rich, which can provide a theoretical basis

for the protection and utilization of wild P. hirsutissimum resources in Southwest China.

Keywords: Paphiopedilum hirsutissimum; wild populations; SSR; genetic diversity; genetic structure

DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2023.11.009

帶葉兜蘭[Paphiopedilum hirsutissimum (Lindl.

ex Hook. f.) Stein]為蘭科（Orchidaceae），杓蘭亞

科 （ Subfam. Cypripedioideae ）兜蘭屬

（Paphiopedilum Pfitz.）植物，自然花期 3—5 月，

主要分布于中國、印度東北部、越南、老撾和泰

國，其中在中國分布于廣西北部至西部、貴州西

南部、云南東南部等地[1]。由于生境破壞、過度

采集和非法貿易等情況嚴重，使帶葉兜蘭野生資

源遭受嚴重的威脅。目前帶葉兜蘭野生種已被列

入《野生動植物瀕危物種國際貿易公約》（CITES）

附錄Ⅰ的保護范圍，絕對禁止在國際上貿易[2-4]。

它還被收錄于《中國高等植物紅色名錄》，評估等

級為易危（VU），且有野生帶葉兜蘭居群呈現破

碎化現象的報道[5-6]。此外帶葉兜蘭是一個變異幅

度很大的種，在花的結構上有很多變化[1]。因此，

利用分子技術對帶葉兜蘭野生資源及其遺傳狀況

進行研究具有重要的意義。

分子標記技術在蘭科植物研究中已被廣泛使

用。在兜蘭屬植物研究中，有基于 ITS 序列[7-8]、

RAPD[9]和 SRAP[10]標記的種間親緣關系及其分

類歸屬研究，有基于 cpDNA[11]分子標記的系統(tǒng)進

化研究，有基于轉錄組數據開發(fā) SSR 引物[12-13]

的研究，以及基于 SRAP[14-16]、ISSR[16-18]和 SSR[12]

標記的遺傳多樣性研究，其中關于帶葉兜蘭的研

究報道較少，僅見基于 SRAP 標記對廣西木論自

然保護區(qū)的 40 份野生帶葉兜蘭資源[14]和基于

SSR 標記對廣西雅長自然保護區(qū)的 32 份野生帶

葉兜蘭資源進行遺傳多樣性研究的報道[12]。中國

西南地區(qū)的云南、貴州和廣西 3 個?。▍^(qū)）均為

中國帶葉兜蘭的主要分布地區(qū)，而只有以上 2 篇

研究廣西地區(qū)帶葉兜蘭單居群遺傳多樣性的文

獻，涉及的采集樣本均有一定的地域局限性，且

未涵蓋多居群和群體結構研究，不足以反映中國

帶葉兜蘭資源的遺傳水平。

SSR 簡單重復序列（SSR）又稱為微衛(wèi)星

（microsatellites）或者串聯(lián)重復序列（STR），由 1~6

個堿基為重復單位組成的短串聯(lián)重復序列，它廣

泛、豐富且隨機地分布于真核生物基因組中[19]。SSR

標記具有數量多、分布廣、多態(tài)性高、重復性好、

共顯性和易檢測等特點，已經成為研究種群遺傳多

樣性和遺傳結構的最有效分子標記之一[20]。

本研究以云南、貴州和廣西的 6 個野生帶葉

兜蘭居群為研究材料，在已發(fā)表的帶葉兜蘭表型

多樣性研究的基礎上[21]，利用 SSR 標記技術對其

進行遺傳多樣性分析和群體結構分析，并綜合分

析表型數據和分子數據，以期為中國西南地區(qū)野

2210 熱帶作物學報 第 44 卷

生帶葉兜蘭的資源保護工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

根據網上搜索、相關文獻記載和實地踏查情

況，采集來源于帶葉兜蘭天然分布區(qū)內廣西、云

南和貴州 3 ?。▍^(qū)）的 6 個野生居群，共計 190

份樣品，具體采樣信息見表 1 和圖 1。其中在廣

西木論（GML）和云南柳井（YDZ）居群帶葉兜

蘭分布范圍較窄，數量較少，因此采集到的樣本

數量也相對較少。采樣標準為居群間的地理距離

大于 10 km，株間距大于 10 m，且無病蟲害。每

個單株采集新鮮葉片放入裝有變色硅膠的塑料自

封袋中，干燥備用。

表 1 6 個居群的采樣信息

Tab. 1 Sample information of six populations

居群（簡稱）

Population system (abbreviation)

采樣地點

Collection site

樣品數量

Sample quantity

樣品編號

Sample No.

GML 廣西壯族自治區(qū)環(huán)江縣木論鄉(xiāng) 13 GML 01-13

GYC 廣西壯族自治區(qū)樂業(yè)縣雅長鄉(xiāng) 39 GYC 01-39

YDZ 云南省文山州文山縣柳井彝族鄉(xiāng) 9 YDZ 01-09

YFD 云南省文山州西疇縣法斗鄉(xiāng) 40 YFD 01-40

QWF 貴州省安龍縣萬峰湖鎮(zhèn) 58 QWF 01-58

QJS 貴州省興義市桔山鎮(zhèn) 31 QJS 01-31

圖 1 樣品采集點分布圖

Fig. 1 Geographic distribution of sample locations

1.2 方法

1.2.1 基因組 DNA 提取 基因組 DNA 的提取參

照本實驗室改良后的亨利兜蘭基因組 CTAB 提取

方法進行[22]。獲取的基因組 DNA 用 1%瓊脂糖凝膠

電泳檢測純度和完整性，并用 Nanodrop 2000 微量

分光光度計（Thermo，美國）檢測濃度和質量，將

合格的 DNA 樣品保存于?20 ℃，備用。

1.2.2 SSR 引物篩選 參考本實驗室基于亨利兜

蘭轉錄組數據開發(fā)的引物[22]，從 115 對引物中共

篩選出 10 對擴增效果好的 SSR 引物（表 2）。引

第 11 期 徐 言等：基于 SSR 標記的西南地區(qū)野生帶葉兜蘭資源遺傳多樣性分析 2211

表 2 10 對 SSR 引物信息

Tab. 2 Information of ten SSR primers

位點

Locus

引物序列（5'?3'）

Primer sequences (5'?3')

退火溫度

Annealing temperatue/℃

重復單元

Repeat motif

片段長度

Size range/bp

DY011 F: CGAAGCACGGGTCTCTTTCT

R: ACCACCGACATTACCTGCAG

60.0 TTC (7) 107

DY356 F: TGCAGATGAGCCCATGCATT

R: TCACGCCTGTATTTCTGCGT

60.2 GAA (6) 260

DY376 F: GGCACTTACAGCAAGGCTCT

R: GAGACCTGGGCCCATCAAAA

60.1 CTG (6) 102

DY383 F: ACGCGGCAAAAATGATGAGG

R: AGGAGGGTTCATGCAGTAGT

58.9 TCA (6) 100

DY413 F: CAGGCTCCAAAACAAGGCAC

R: GGGACTGGGGAGTAAAAGGC

60.0 CAG (7) 263

DY669 F: CAAACCTCGCTCGGAAGACT

R: AGGGTTTCTATCGCTTGGCC

60.0 TCGAC (6) 259

DY687 F: GCTGCCAATTCGAATGGAGG

R: GCTGCCGATTCTCCTTCCTT

59.9 GGC (6) 203

DY716 F: AGCTATGAGGAACTGCGCTG

R: TGTTGACATGATCCGTGGCA

60.1 GGC (6) 182

DY800 F: AGCTTGAAGTACTTGGGGGC

R: TCCACCTTCTCCTCCTCACT

59.6 TGG(8) 146

DY877 F: GGCGATTGACCTCTGCTGAT

R: TCGGCTTTGGTTGCTGAGAT

60.1 CGC (6) 217

物由生工生物工程（上海）股份有限公司北京分

公司合成。

1.2.3 PCR 擴增及測序 在 C1000 Touch 實時定

量 PCR 儀（Bio-Rad，美國）上進行反應，PCR 反

應體系（20 μL）：10×buffer 2.0 μL，dNTPs 1.5 μL，

上、下游引物各 2.0 μL，Ex Taq 0.2 μL，DNA 3.0 μL，

ddH2O 9.3 μL。PCR 擴增反應程序為：94 ℃預變性

5 min；94 ℃變性 30 s，65 ℃退火 30 s，72 ℃延伸

40 s，循環(huán) 10 次；94 ℃變性 30 s，60 ℃退火 30 s，

72 ℃延伸 40 s，循環(huán) 15 次；94 ℃變性 30 s，55 ℃

退火 30 s，72 ℃延伸 40 s，循環(huán) 10 次；72 ℃延伸

10 min；4 ℃保存。PCR 產物使用 2%瓊脂糖凝膠電

泳檢測，合格后送至上海天昊生物公司進行基于二

代測序技術的 SSR 基因分型。

1.3 數據處理

采用 Excel 2010 軟件統(tǒng)計并整理 SSR 基因分

型數據。利用 Genalex 6.501[23]和 PopGene 1.32[24]

軟件計算多態(tài)性位點比率（PPB）、等位基因數

（Na）、有效等位基因數（Ne）、Shannon 信息指

數（I）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、

Nei’s 基因多樣性指數（h）、Nei’s 遺傳距離（Gd）、

遺傳相似性（Gi）和基因流（Nm）等。利用 PIC-Calc

軟件計算多態(tài)信息含量（PIC）。利用 Genalex

6.501[23]軟件進行基于遺傳距離的主成分分析

（PCoA）和分子方差分析（AMOVA）。利用 Mega

7.0[25]軟件的非加權平均法（UPGMA）進行聚類

分析，并構建基于遺傳距離的聚類圖。利用

Structure 2.3.4[26]軟件進行遺傳結構分析，設置 K

值為 1~10，對不同的 K 值進行 10 次重復運算。使

用馬爾可夫鏈法（Markov’s Chain Monte Carlo,

MCMC），設 burn-in 為 100 000 次，run-length 為

100 000 次迭代，之后用在線軟件 Structure harvester

（http://taylor0.biology.ucla.edu/structure harvester/）

根據?K 峰值位置來確定最佳分組群，并繪制群體

結構分析圖。

2 結果與分析

2.1 SSR 標記多態(tài)性

利用 10 對 SSR 引物對 190 份帶葉兜蘭材料進

行 SSR 多態(tài)性分析（表 3）。由表 3 可知，共檢測

到 50 個 Na，Na 在 2~9 之間，平均每個 SSR 標記 5

個等位基因。Ne為1.0269~ 6.7468，平均值為2.4835。

I 在 0.0843~2.0272 之間，平均值為 0.8592。Ho 在

0.0265~0.8677 之間，平均值為 0.4518。He 在

0.0263~0.8540 之間，平均值為 0.4387 。 h 在

0.0262~0.8518 之間，平均值為 0.4370。PIC 在

0.0260~0.8346 之間，平均值為 0.3996 。參照

BOTSTEIN 等[27]提出的衡量基因變異程度高低的

PIC 指標，有 4 個位點（DY383、DY687、DY716、

DY800）是高度多態(tài)性位點（PIC>0.50），4 個位點

（DY356、DY376、DY413、DY669）是中度多態(tài)

性位點（0.25<PIC≤0.50），2 個位點（DY011、

DY877）是低度多態(tài)性位點（PIC≤0.25）。

2212 熱帶作物學報 第 44 卷

表 3 10 對 SSR 引物的多態(tài)性分析

Tab. 3 Polymorphism analysis of ten SSR primers

位點

Locus

觀測等位基因數

Na

有效等位基因

數 Ne

Shannon 信息指

數 I

觀測雜合度

Ho

期望雜合度

He

基因多樣性指

數 h

多態(tài)信息含量

PIC

DY011 4 1.0269 0.0843 0.0265 0.0263 0.0262 0.0260

DY356 4 1.3741 0.5840 0.2707 0.2730 0.2723 0.2588

DY376 4 1.4707 0.6174 0.3457 0.3209 0.3200 0.2966

DY383 9 6.7468 2.0272 0.8360 0.8540 0.8518 0.8346

DY413 2 1.9886 0.6903 0.4811 0.4985 0.4971 0.3736

DY669 5 1.3824 0.5774 0.2919 0.2774 0.2766 0.2592

DY687 5 2.9327 1.1811 0.6667 0.6664 0.6590 0.5916

DY716 7 3.6963 1.4146 0.8677 0.7314 0.7295 0.6817

DY800 5 3.1602 1.2554 0.6878 0.6854 0.6836 0.6202

DY877 5 1.0567 0.1603 0.0437 0.0538 0.0537 0.0532

均值 5 2.4835 0.8592 0.4518 0.4387 0.4370 0.3996

2.2 居群遺傳多樣性

帶葉兜蘭各野生居群遺傳多樣性檢測結果見

表 4。6 個居群的多態(tài)性位點比率（PPB）在

70%~100%之間，平均值為 88.33%。Na 在 2.8000~

4.3000 之間，平均值為 3.3833。Ne為 1.9655~2.4060，

平均值為 2.1901。I 在 0.6584~0.8369 之間，平均值

為 0.7425。Ho 在 0.3891~0.4839 之間，平均值為

0.4465。He在 0.3795~0.4683 之間，平均值為 0.4205。

h 在 0.3648~0.4382 之間，平均值為 0.4008。表明 6

個帶葉兜蘭居群的遺傳多樣性豐富，其中廣西木論

（GML）遺傳多樣性最低，廣西雅長（GYC）和貴

州萬峰湖（QWF）遺傳多樣性較高。

表 4 基于 10 對 SSR 引物的帶葉兜蘭 6 個居群的遺傳多樣性

Tab. 4 Genetic diversity for the six populations of P. hirsutissimum based on ten SSR primers

居群

Population

多態(tài)性比率

PPB/%

觀測等位基因數

Na

有效等位基因數

Ne

Shannon 信息指

數 I

觀測雜合度

Ho

期望雜合度

He

基因多樣性

指數 h

GML 70 2.8000 2.1056 0.6584 0.3891 0.3795 0.3648

GYC 100 3.9000 2.2820 0.8245 0.5070 0.4452 0.4382

YDZ 90 2.9000 1.9655 0.6753 0.4222 0.3981 0.3742

YFD 90 3.2000 2.2494 0.7453 0.4839 0.4683 0.4135

QWF 100 4.3000 2.4060 0.8369 0.4132 0.4329 0.4276

QJS 80 3.2000 2.1323 0.7143 0.4633 0.3988 0.3864

均值 88.33 3.3833 2.1901 0.7425 0.4465 0.4205 0.4008

2.3 居群遺傳分化

帶葉兜蘭居群的分子方差分析（AMOVA）結

果表明，帶葉兜蘭居群間的遺傳變異僅有 6%，而

居群內的遺傳變異有 94%，絕大部分遺傳變異發(fā)

生在各居群的內部（表 5）。說明野生帶葉兜蘭資

源的遺傳多樣性以居群內的變異為主，居群內分

化程度較高，而居群間遺傳分化較小。

2.4 聚類和主坐標分析

遺傳距離和遺傳相似性是衡量居群親緣關系

的重要指標，6 個居群間的 Nei’s 遺傳距離（Gd）

和遺傳相似性（Gi）見表 6。6 個居群間 Gd 在

0.0169~0.1330 之間，Gi 在 0.8755~0.9832 之間。

其中 GML 和 YDZ 居群間的 Gd 最大（0.1330），

GYC 和 QWF 居群間的 Gd 最?。?.0169）。GYC

和 QWF 居群間的 Gi 最大（0.9832），GML 和 YDZ

居群間的 Gi 最小（0.8755）。

根據居群間的 Nei’s 遺傳距離采用 UPGMA

法進行聚類分析（圖 2），結果顯示，廣西雅長

（GYC）和貴州萬峰湖（QWF）首先聚為一支，

再依次和貴州桔山（QJS）、云南法斗（YFD）、

云南柳井（YDZ）聚集，最后和廣西木論（GML）

聚集。結果表明居群間遺傳距離與地理距離無顯

第 11 期 徐 言等：基于 SSR 標記的西南地區(qū)野生帶葉兜蘭資源遺傳多樣性分析 2213

表 5 帶葉兜蘭群體間分子方差分析（AMOVA）

Tab. 5 Molecular variance analysis (AMOVA) among P. hirsutissimum populations

變異來源

Source of variation

自由度

df

均方和

SS

均方偏差

MS

方差組分

Variance components

變異百分比

Percentage of variation/%

P

居群間 5 64.978 12.996 0.284 6 <0.001

居群內 184 828.037 4.500 4.500 94 <0.001

總計 189 893.016 4.784 100

表 6 帶葉兜蘭居群間的遺傳距離（Gd）和遺傳相似性（Gi）

Tab. 6 Nei’s genetic distance (Gd) and genetic identity (Gi) of P. hirsutissimum

居群 Population GML GYC YDZ YFD QWF QJS

GML 0.9107 0.8755 0.9209 0.8926 0.8862

GYC 0.0936 0.9458 0.9597 0.9832 0.9613

YDZ 0.1330 0.0557 0.9285 0.9508 0.9604

YFD 0.0824 0.0412 0.0742 0.9750 0.9592

QWF 0.1136 0.0169 0.0505 0.0253 0.9751

QJS 0.1208 0.0395 0.0404 0.0416 0.0252

注：對角線下方為 Nei’s 遺傳距離（Gd），對角線上方為 Nei’s 遺傳相似性（Gi）。

Note: Below diagonal is Nei’s genetic distance (Gd), and above diagonal is Nei’s genetic identity (Gi).

圖 2 基于 Nei’s 遺傳距離的帶葉兜蘭居群的聚類圖

Fig. 2 Cluster of the population of P. hirsutissimum based

on Nei’s genetic distance

著相關性。

為進一步研究群體間的遺傳關系，對 190 份

帶葉兜蘭進行主坐標分析（PCoA）。其中第一主成

分和第二主成分分別可以解釋總變量的 31.63%和

10.07%（圖 3）。主坐標結果表明帶葉兜蘭居群間

均質化明顯，居群內存在著種質混雜現象。

2.5 居群遺傳結構

利用 Structure 的貝葉斯聚類方法對 6 個帶葉

兜蘭居群進行遺傳結構分析，根據 EVANNO 等[28]

的方法用最大似然值?K 來確定 K 值。Structure

圖 3 基于 Nei’s 遺傳距離的主坐標分析圖

Fig. 3 Principal coordinate analysis diagram based on

Nei’s genetic distance

分析結果顯示 K 在 1~10 之間，K 為 2 時，?K 取

得最大值（圖 4），表明 6 個居群 190 個個體的

基因型分為 2 種。2 種基因型在每個居群中分布

比例相似，不能按照不同基因池區(qū)分（圖 5），

表明帶葉兜蘭居群間均質化，可能由于較高基

因流導致。

圖 4 ?K 分布圖

Fig. 4 Distriction of ?K

2214 熱帶作物學報 第 44 卷

圖 5 帶葉兜蘭居群 Structure 聚類結果（K=2）

Fig. 5 Clustering results of P. hirsutissimum (K=2)

3 討論

3.1 帶葉兜蘭居群的遺傳多樣性

遺傳多樣性是體現一個物種進化潛力和抵抗

外界環(huán)境變化的能力，遺傳多樣性水平越高，物

種適應環(huán)境變化的能力越強，反之越弱[29]。本研

究所選的 6 個居群是本實驗室從 2013 年開始，通

過查閱文獻、網上搜索和多年實地踏查所收集到

的所有居群，其中貴州萬峰湖（QWF）、貴州桔

山（QJS）、云南法斗（YFD）和云南柳井（YDZ）

這 4 個居群均是首次對其進行研究報道。

本研究對 6 個帶葉兜蘭居群的 SSR 檢測結果

表明，在物種水平（I=0.8592, h=0.4370）和居群

水平（PPB=83.33%, I=0.7425, h=0.4008）上均具

有豐富的遺傳多樣性。與以往的兜蘭屬植物遺傳

多樣性研究相比，高于朱亞艷等[10]利用 SRAP 標

記分析的 8 種兜蘭的遺傳多樣性（PPB=80.26%,

I=0.4241, h=0.2879），略高于李宗艷等[17]利用 ISSR

標記分析的 7 個硬葉兜蘭居群的遺傳多樣性（PPB=

96.04%, I=0.4889, h=0.3244），略高于 HUANG 等[16]

利用 ISSR 和 SRAP 標記分析的 15 個硬葉兜蘭居群

的遺傳多樣性（ISSR: PPB=80.28%, I=0.4236; SRAP:

PPB=70.67%, I=0.3301），也高于秦惠珍等[18]利用

ISSR 標記分析的 8 個白花兜蘭居群的遺傳多樣性

（PPB=78.33%, I=0.4191, h= 0.2808）。高麗霞等[14]

利用 SRAP 標記分析的廣西木論自然保護區(qū)的 40

份野生帶葉兜蘭的遺傳多樣性（PPB=24.22%,

I=0.1582, h=0.1282）低于本研究中同位于廣西木

論縣木論自然保護區(qū)的廣西木論（GML）的遺傳

多樣性（PPB=70%, I=0.6584, h=0.3648），推測可

能與本研究采用的 SSR 標記具有更高的多態(tài)性和

保護區(qū)的保護有關。CHEN 等[12]利用 SSR 標記分

析的廣西雅長自然保護區(qū)的 32 份野生帶葉兜蘭

的遺傳多樣性（ Na=2.9300, Ne=2.2200, He=

0.5313）略高于本研究中同位于廣西雅長自然保

護區(qū)的廣西雅長（GYC）的遺傳多樣性（Na=

3.9000, Ne=2.2820, He=0.4452）。本研究對 6 個帶

葉兜蘭居群的研究也顯示了廣西木論（GML）的

遺傳多樣性最低，廣西雅長（GYC）的遺傳多樣

性較高，推測可能和位于雅長自然保護區(qū)的帶葉

兜蘭居群較大，而位于木論自然保護區(qū)的居群較

小有關。本研究與上述近緣或相同物種的多項指

標比較表明，帶葉兜蘭整體遺傳多樣性豐富，高

于硬葉兜蘭和白花兜蘭。

3.2 帶葉兜蘭居群的遺傳結構

遺傳分化是反映遺傳結構的重要指標。本研

究通過 AMOVA 分析顯示，94%的遺傳分化發(fā)生

在居群內，居群間遺傳分化很?。?%），即帶葉

兜蘭主要遺傳變化來自居群內的個體間變異。李

宗艷等[17]利用 ISSR 標記對 7 個硬葉兜蘭居群進

行 AMOVA 分析顯示，硬葉兜蘭居群內（60.4%）

的遺傳變異大于居群間（39.60%）。HUANG 等[16]

利用 ISSR 和 SRAP 標記對 15 個硬葉兜蘭居群進

第 11 期 徐 言等：基于 SSR 標記的西南地區(qū)野生帶葉兜蘭資源遺傳多樣性分析 2215

行 AMOVA 分析，ISSR 標記結果顯示硬葉兜蘭居

群內（69%）遺傳變異大于居群間（31%），SRAP

標記結果也顯示硬葉兜蘭居群內（75%）遺傳變

異大于居群間（25%）。秦惠珍等[18]利用 ISSR 分

子標記對 8 個白花兜蘭居群進行 AMOVA 分析顯

示白花兜蘭居群內（87.53%）遺傳變異大于居群

間（12.47%）。多項指標表明多數兜蘭屬植物的遺

傳變異均以居群內的遺傳變異為主。這一結果可

能與兜蘭具有欺騙性授粉的特征有關，欺騙性授

粉的物種比向傳粉者提供回報的物種具有更高

的基因流動，且兜蘭種子細小也有利于遠距離傳

播[11]。此外，評價居群的遺傳結構需要結合物種

的繁育系統(tǒng)和傳粉方式等因素進行綜合分析，目

前尚無帶葉兜蘭繁育和傳粉的相關報道，后續(xù)應

加強對這方面的研究來進一步闡明其遺傳結構的

形成原因。

遺傳結構是評價遺傳資源的關鍵。本研究通

過 UPGMA 聚類、PCoA 分析和 Structure 群體結

構分析對帶葉兜蘭資源進行劃分，3 種分析方法

得到的結果相似，均顯示 6 個野生帶葉兜蘭居群

無明顯的類群劃分，居群間存在基因漸滲的現象

且均質化明顯。這可能會降低物種的長期適應性

進化能力，增加在不斷變遷的環(huán)境中因隨機事件

而滅絕的風險。推測很可能因為現存的各個居群

起源于相同的祖先居群，由于在歷史中發(fā)生生境

片段化，造成這一連續(xù)分布的祖先居群殘留成目

前多個分散的居群。

3.3 表型多樣性和遺傳多樣性關聯(lián)分析

本研究與本實驗室王文曉等[21]的帶葉兜蘭表

型多樣性分析結果相比，其中有 5 個居群采樣地

點均與王文曉等文中相對應（王文曉等文中的

YDZ 居群采樣地由云南省馬關縣斗嘴鄉(xiāng)更正為

云南省文山縣柳井彝族鄉(xiāng)斗咀村，居群字母簡稱

YDZ 不變）。王文曉等根據 18 個表型性狀變異系

數分析顯示，5 個野生居群內變異系數由高到底

為云南法斗（YFD）＞貴州萬峰湖（QWF）＞廣

西雅長（GYC）＞云南柳井（YDZ）＞廣西木論

（GML），本研究根據遺傳多樣性分析結果顯示，

6 個野生居群遺傳多樣性由高到低為廣西雅長

（GYC）＞貴州萬峰湖（QWF）＞云南法斗（YFD）

＞貴州桔山（QJS）＞云南柳井（YDZ）＞廣西

木論（GML），二者結果部分相似；但王文曉等

根據巢氏方差分析表型分化系數顯示，居群間的

表型分化大于居群內，而本研究根據 AMOVA 分

析遺傳分化系數顯示，居群內的遺傳分化遠遠大

于居群間；聚類結果也不同，王文曉等按照表型

性狀 Q 型聚類將居群劃分為 3 類，云南法斗

（YFD）和云南柳井（YDZ）為一類群，廣西雅

長（GYC）和廣西木論（GML）為一類群，貴州

萬峰湖（QWF）為一類群，其結果大致同地理位

置及生境相符。這種利用表型性狀檢測植物遺傳

變異和多樣性的方法簡便易行，能夠短期內基本

了解植物的遺傳變異水平[30]。但植物形態(tài)學特征

受環(huán)境影響較大，在不同生境下營養(yǎng)和生殖性狀

均會出現差異，因此存在一定的局限性[31]。而利

用 SSR 分子標記技術是從 DNA 水平上反映個體

間的遺傳變異現象，不受生長發(fā)育和時間的制約，

避免環(huán)境干擾，成本低，檢測效率高，能更準確

地反映類群間的親緣關系[32]。基于 SSR 技術，本

研究聚類結果表明，不同居群的帶葉兜蘭的遺傳

結構未嚴格按照地理距離劃分，這一結果與本實

驗室硬葉兜蘭 13 個居群遺傳多樣性分析結果類

似，廣西木論（GML）居群和其他居群遺傳距離

最遠（數據尚未發(fā)表）。其原因可能是：（1）由于

貴州萬峰湖（QWF）居群位于 5 個居群的中間位

置，與其他居群有相對較大的基因流交流，基因

重組的空間和機會更大，更容易擴大種群的遺傳

多樣性水平；（2）貴州萬峰湖（QWF）和廣西雅

長（GYC）居群分別位于紅水河水系的上下游，

通過紅水河水系增加了這 2 個居群間的基因交

流，因此這 2 個居群間關系最近。

3.4 帶葉兜蘭資源保護

遺傳多樣性是種質資源保護與評價的重要指

標[33]。通過對中國西南地區(qū)的 6 個帶葉兜蘭居群

的遺傳多樣性進行研究，結果表明帶葉兜蘭具有

相對豐富的遺傳多樣性，但居群間存在均質化現

象。在 6 個居群中，貴州萬峰湖（QWF）居群和

位于廣西雅長自然保護區(qū)的廣西雅長（GYC）居

群遺傳多樣性較高，應作為核心種群重點保護，

可見選擇在廣西雅長作為全國唯一一個國家級蘭

科植物自然保護區(qū)，在帶葉兜蘭的保護上其意義

重大。由于帶葉兜蘭居群內個體間的遺傳變異較

高，因此也要加強對居群內部每個個體的保護，

以保持最大遺傳變異基因庫為目標。

此外，通過全基因組重測序和簡化基因組測

序等高通量測序技術開發(fā)分子標記，已廣泛應用

于大田作物和蔬菜中，這也給蘭科植物起源和進

化帶來新的研究方向[34]。如簡化基因組測序技術

2216 熱帶作物學報 第 44 卷

有不參考基因組就可以進行大量 SNPs 開發(fā)的優(yōu)

勢，目前在蘭科植物中石斛屬[35]、蝴蝶蘭屬[36]

上已有應用，但尚無新型分子標記技術應用于兜

蘭屬植物的報道。為了更好地保護兜蘭屬植物，

今后可以利用新型高通量測序技術開發(fā)新的標記

技術，加強與鄰國的交流，增加越南、老撾、印

度、泰國等國家野生居群采樣，以全面了解帶葉

兜蘭資源的遺傳狀況。

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Chinese Journal of Tropical Crops

收稿日期 2023-08-02；修回日期 2023-09-14

基金項目 國家熱帶植物種質資源庫建設項目（No. NTPGRC2023）；國家大宗蔬菜產業(yè)技術體系花卉?？诰C合試驗站專項資

金項目（No. CARS-23-G60）。

作者簡介 冷青云（1985—），男，碩士，助理研究員，研究方向：熱帶花卉遺傳育種與種苗繁育。*通信作者（Corresponding

author）：尹俊梅（YIN Junmei），E-mail：yinjunmei2004@163.com。

基于流式細胞術的蘭屬雜交后代倍性鑒定

冷青云，陸錦萍，黃少華，徐世松，李海燕，牛俊海，尹俊梅*

中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所/農業(yè)農村部華南作物基因資源與種質創(chuàng)制重點開放實驗室/海南省熱帶觀賞

植物種質創(chuàng)新利用工程技術研究中心/海南省熱帶作物資源遺傳改良與創(chuàng)新重點實驗室，海南?？?571101

摘 要：倍性鑒定是熱帶花卉種質資源鑒定及新品種選育的基礎工作之一。本研究利用流式細胞儀對蘭屬雜交后代進

行倍性鑒定。針對裂解液種類、試驗材料組織器官等關鍵環(huán)節(jié)，以細胞核解離情況、主峰清晰程度、變異系數及取材

容易程度等方面為評價指標，建立鑒定體系，并比較不同倍性植株的氣孔性狀差異。結果表明：CyStain UV Precise P

為 3 種裂解液中最優(yōu)，組織器官以嫩葉為宜；從 3 個雜交組合后代中鑒定出三倍體 6 株，四倍體 2 株，不同倍性間的

氣孔長度、寬度和密度均差異顯著（P<0.05），氣孔長度和寬度的排序為四倍體>三倍體>二倍體，而氣孔密度的排序

則相反。該研究結果對雜交蘭多倍體選育及開展不同倍性間雜交育種具有重要應用價值。

關鍵詞：流式細胞術；蘭屬；倍性鑒定

中圖分類號：S682.3 文獻標識碼：A

Ploidy Identification of Cymbidium Hybrid Seedlings by Flow Cytometry

LENG Qingyun, LU Jinping, HUANG Shaohua, XU Shisong, LI Haiyan, NIU Junhai, YIN Junmei*

Tropical Crops Genetic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Crop Gene

Resources and Germplasm Enhancement in Southern China, Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Hainan Provincial Engineering Technology Research Center of Tropical Ornamental Plant Germplasm Innovation and Utilization / Key Laboratory of

Tropical Crops Germplasm Resources Genetic Improvement and Innovation of Hainan Province, Haikou, Hainan 571101, China

Abstract: Ploidy identification is one of the basic tasks for germplasm resources and new variety breeding of tropical

flowers. In this study, flow cytometry was used to identify the ploidy level of Cymbidium hybrid seedlings. aiming at the

key links such as the type of dissociated liquid, the tissue organ of the test material, evaluation indexes such as the nuclear dissociation, the clear degree of the main peak, the easy degree of sampling, and the coefficient of variation. A

technique system was established and the stomatal traits of different ploidy were analyzed. The results showed that

CyStain UV Precise P was the best of the three dissociated liquid and young leaves were most suitable. Six triploid and

two tetraploid were identified from the offspring of the three hybrid combinations. There were significant differences in

stomatal length, width and density between different ploidy (P<0.05). The rank of stomatal length and stomatal width

was tetraploid>triploid>diploid, while stomatal density was reversed. This study is valuable for the polyploid selection

and use of different ploidy germplasm resources for cross breeding of Cymbidium hybrid.

Keywords: flow cytometry; Cymbidium; ploidy identification

DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2023.11.010

蘭屬（Cymbidium Sw.）是蘭科（Orchidaceae）

重要觀賞類群之一，原生種約 86 種[1]，主要分布

于亞洲熱帶和亞熱帶地區(qū)，向南到澳大利亞北部，

中國是該屬的分布中心和多樣性中心，分布于秦

嶺山脈以南地區(qū)，約有 63 種[2]。種內品種及種間

雜種和品種間雜交種超過 2 萬種，截至 2022 年，

2220 熱帶作物學報 第 44 卷

在國際蘭花雜種登錄權威機構（International Registration Authority for Orchid Hybrids, RHS）上登

錄的蘭屬植物雜交種有超過 17 363 個[3]。

蘭屬育種方式有選擇育種、雜交育種與誘變

育種等，其中雜交育種是蘭屬植物的主要育種手

段。在雜交育種工作中，了解親本及雜交后代的

倍性和育性十分重要，有利于提高育種的成功

率。通過染色體計數法對一些蘭屬原生種及雜交

品種（雜交蘭和大花蕙蘭）進行倍性鑒定研究，

原生種及雜交蘭主要是二倍體，大花蕙蘭（Cymbidium hybridium）的染色體倍性多樣化，有二倍

體、三倍體、四倍體、六倍體和非整倍體[4-10]。

然染色體計數法對細胞學操作技術要求較高，且

費時費工，面對大規(guī)模種質資源及雜交后代群體

的倍性鑒定需要尋找一種快速便捷、高通量鑒定

的方法。

流式細胞術（flow cytometry, FCM）是 20 世

紀 70 年代發(fā)展起來的一種對懸浮的單細胞進行

高速分析和分選的技術。在植物學研究中，常用

于倍性分析、細胞計數、細胞周期分析及植物基

因組大小估算等研究，具有分析速度快、靈敏度

高、可靠性好等優(yōu)點[11-12]。近年來在紅掌[13]、香

蕉[14]、橡膠[15]、火龍果[16]、茉莉花[17]、桂花[18]、

三角梅[19-20]等植物倍性鑒定中應用。在蘭科植物

研究中，已有超過 26 屬 70 種的基因組大小是通

過 FCM 評估，包括蘭屬、兜蘭屬（Paphiopedilum）、

樹蘭屬（Epidnedium）等[21-25]，另外，FCM 也應用

于對化學誘變劑處理后的蝴蝶蘭（Phalaenopsis）、

石斛（Dendrobium)、白芨（Bletilla）倍性鑒定[26-29]。

本研究通過流式細胞術對蘭屬 3 個雜交后代群體

進行倍性鑒定，以期為快速鑒定雜種后代倍性提

供技術方法，并獲得優(yōu)良的多倍體植株，為今后

的多倍體育種提供種質材料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為親本黃金小神童（Cymbidium Golden

Elf. ‘Sundust’）、冬風蘭（Cymbidium dayanum Rchb.

f）、美花蘭（Cymbidium insigne Rolfe）以及其雜

交后代群體，其中，黃金小神童為雜交種，其他

為原生種，具體組合及雜交后代數量見表 1。所

有材料均保存于中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品

種資源研究所八隊熱帶花卉種質資源圃。

表 1 蘭屬雜交組合情況表

Tab. 1 List of Cymbidium hybrid seedlings

序號

No.

母本

Female parent

父本

Male parent

后代數量

No. of hybrids

1 黃金小神童 冬鳳蘭 126

2 黃金小神童 美花蘭 98

3 黃金小神童×冬鳳蘭 美花蘭 56

1.2 方法

1.2.1 蘭屬流式細胞術倍性檢測技術體系構建

裂解液種類、試驗材料組織部位是影響倍性檢測

的關鍵環(huán)節(jié)。本試驗應用了 3 種裂解液 Galbraith’s

buffer （ GLB ）（ 30 mmol/L Na3C6H5O7·2H2O 、

45 mmol/L MgCl2 、 20 mmol/L 3-[nmorpholino]

propanesulfonic acid]、0.1% Triton X-100（w/V），

pH 7.0）、Woody Plant Buffer（WPB）（0.2 mol/L

Tris-HCl，86 mmol/L NaCl, 10 mmol/L 焦亞硫酸

鈉 ， 4 mmol/L MgCl2·6H2O, 2 mmol/L EDTANa2·2H2O，1% PVP-10，1%（V/V）Triton X-100，

pH 7.5[26]、CyStain UV Precise P 試劑盒，以黃金

小神童幼嫩葉片、根尖組織、花梗、花萼片為材

料，利用流式細胞儀測定相對熒光強度（relative

fluorescence intensity of PI-stained nuclei，FL）和

G0/G1 期的變異系數（coefficient of variation，

CV），篩選出最適合裂解液及組織部位，每個處

理重復 3 次。

1.2.2 蘭屬雜交后代流式細胞術倍性檢測 基于

黃金小神童為試驗材料構建的蘭屬流式細胞術倍

性檢測技術體系：解離液為 CyStain UV Precise P，

幼嫩葉片為試材，檢測其倍性。

將樣品置于含 1.0 mL 預冷的 GLB 解離液的

培養(yǎng)皿中，用鋒利的刀片切碎，2 min 后用 300

目尼龍網過濾，濾液加入預冷的碘化丙啶（PI）

和 RNAase 溶液，工作濃度均為 50 μg/mL。置于

冰上避光染色 0.5~1 h后上機檢測，儀器為 Sysmex

CyFlow? Ploidy Analyser，激發(fā)光為 488 nm，每

次檢測收集 5000 個顆粒，儀器自帶軟件作圖分析，

變異系數控制在 5%以內。每份材料重復 3 次。

1.2.3 不同倍性氣孔形狀觀察 葉片氣孔大小和

密度比較：取不同倍性葉片，在葉片下表皮均勻

涂上一層透明指甲油，待指甲油干后，用鑷子挑

取其表皮置于有蒸餾水的載玻片上，吸取多余的

水分，加蓋玻片后在 Leica DM2500 生物顯微鏡

40×物鏡下觀察測量。每片至少觀察 10 個視野，

記錄每個視野內氣孔器的個數，每片選取 30 個氣

孔，測量每個氣孔器的長度和寬度。

第 11 期 冷青云等：基于流式細胞術的蘭屬雜交后代倍性鑒定 2221

2 結果與分析

2.1 蘭屬流式細胞術倍性檢測技術體系構建

2.1.1 不同裂解液對細胞核解離的影響 以黃金

小神童嫩葉為供試材料，利用流式細胞儀研究 3

種裂解液對蘭屬植物的裂解效果（圖 1，表 2），

發(fā)現 3 種裂解液均能較好地保證完整的細胞核從

破碎細胞中裂解出來，同時可降解細胞中的次生

代謝產物。對于 FL 值，3 種裂解液有顯著差異，

其中 GLB 裂解液裂解樣品得出的 FL 值最低，最

高的 FL 值出現在 CyStain UV Precise P 裂解的樣

品中，且顯著高于另外 2 個裂解液。在用 3 種裂

解液對蘭屬進行流式分析中，CV 值差異不顯著，

最高的為 WPB 裂解液，CV 值為 5.66%，大于 5%；

最低為 GLB 裂解液，為 3.93%。裂解液的選擇標

準為有最高的 FL 值和最低的 CV 值，通過表 2

發(fā)現，CyStain UV Precise P 在 3 種裂解液種中最

佳。從圖 1 也可看出，CyStain UV Precise P 制備

的樣品流式細胞圖出峰清晰、穩(wěn)定、雜峰少，并

且可以清晰地觀察到 G2 期。因此，選定 CyStain

UV Precise P 試劑盒為本研究后期的裂解液。

圖 1 3 種裂解液的流式覆蓋圖

Fig. 1 Overlays of distributions obtained with

three buffers by FCM

表 2 3 種細胞裂解液流式細胞術參數評定

Tab. 2 Assessment of flow cytometric parameters

in three nuclear isolation buffers

裂解液

Nuclear isolation buffers

相對熒光強度

FL

變異系數

CV/%

GLB 12 495.67±145.36a

3.93±0.46a

WPB 13 838.33±609.45b

5.66±1.09a

CyStain UV Precise P 18 676.33±117.12c

4.04±0.76a

注：同列數據后不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

Note: Different lowercase letters after the same column of data

indicate significant difference (P<0.05).

2.1.2 不同組織部位對植物倍性的影響 本研究

分別使用植株的嫩葉、根尖、花梗和花萼片來驗

證不同組織器官對植物倍性檢測結果準確性的影

響。由圖 2 可知，4 種組織器官均能裂解出細胞

核，嫩葉和花梗有一個明顯峰值，其峰值清晰，

細胞碎片少，根尖和花萼片流式 DNA 含量直方

圖顯示出 2C、4C、8C 共 3 個峰值，根尖在 2C、

4C 處峰值等高，花萼片的主峰值出現在 4C 處，

是葉片主峰值的 2 倍，這 2 種組織呈現體內多倍

化現象，不適合作為蘭屬倍性檢測的組織材料，

花梗能較好地出峰，也無多倍化細胞干擾，但其

取材時間只能在開花期特定時間采集，而葉片可

以在任何季節(jié)取材，是理想的蘭屬倍性檢測組織

部位。在后續(xù)的研究中選擇以幼嫩葉片為材料開

展流式細胞術檢測。

2.2 蘭屬雜交后代流式細胞術倍性檢測

以 CyStain UV Precise P 試劑盒為裂解液，利

用流式細胞儀對 3 個親本及其雜交后代進行倍性

檢測。測定結果見圖 3，3 個親本流式細胞圖出峰

清晰、穩(wěn)定、雜峰少，熒光強度在 12 251~13 509

之間，差異不大。因 3 個親本均為二倍體，將雜

交后代 DNA 相對含量峰值在 12 800 左右定為二

倍體，三倍體峰值在 19 200 左右和四倍體峰值在

25 600 左右。雜交后代倍性檢測統(tǒng)計結果見表 3，

共檢測出多倍體 8 株，其中黃金小神童×美花蘭后

代檢測出三倍體 1 株，占比為 1.02%；（黃金小神

童×冬鳳蘭）×美花蘭后代檢測出三倍體 5 株，占

比 8.92%；四倍體 2 株，占比 3.57%。

2.3 不同倍性氣孔形狀比較

蘭屬二倍體、三倍體和四倍體的氣孔性狀分

析結果表明（表 4，圖 4），不同倍性間的氣孔長

度、寬度和密度均差異顯著（P<0.05）；氣孔長

度和寬度的排序為四倍體>三倍體>二倍體，而氣

孔密度的排序則相反。

3 討論

目前，流式細胞術是大規(guī)模檢測植物倍性的

有效手段，具有快速、準確、操作簡便和可重復

性強等優(yōu)點。其中裂解液種類和試驗材料組織部

位是影響其準確性的關鍵因素。前人研究發(fā)現

GLB 對蘭屬裂解效果最好[24-25]。本研究在對蘭屬

植物裂解試驗中，發(fā)現 CyStain UV Precise P 試劑

盒裂解液是所用 3 種裂解液中效果最佳的，

CyStain UV Precise P 為專利產品，配方成分未公

2222 熱帶作物學報 第 44 卷

圖 2 不同組織器官流式細胞儀測定直方圖

Fig. 2 Histograms of different tissue parts using flow cytometry

表 3 雜交后代倍性檢測結果

Tab. 3 Ploidy analysis of hybrid seedlings

序號

No.

母本

Female parent

父本

Male parent

后代數量

No. of hybrids

二倍體數

Diploid/%

三倍體數

Triploid/%

四倍體數

Tetraploid/%

1 黃金小神童 冬鳳蘭 126 126(100.00) 0(0.00) 0(0.00)

2 黃金小神童 美花蘭 98 97(98.98) 1(1.02) 0(0.00)

3 黃金小神童×冬鳳蘭 美花蘭 56 49(87.50) 5(8.92) 2(3.57)

表 4 不同倍性蘭屬種質葉片氣孔特征比較

Tab. 4 Comparison of different ploids stomatal characters

in Cymbidium hybrids

倍性

Ploids

氣孔長度

Stomatal

length/μm

氣孔寬度

Stomatal

width/μm

氣孔密度

Stomatal

density/(個·mm–2)

二倍體 18.13±0.38a

11.39±0.58a

101.85±14.80a

三倍體 23.93±1.13b

13.06±0.71b

71.06±7.11b

四倍體 26.65±1.05c

20.23±0.47c

49.74±7.10c

注：同列數據后不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

Note: Different lowercase letters after the same column of data

indicate significant difference (P<0.05).

開，且售價偏高，GLB 含有檸檬酸鈉和 TritonX100，能清除蘭屬植物葉肉細胞中含有大量的糖

類、酚類等黏性物質，其裂解的細胞懸浮液也能

出較好的峰值，因此在對蘭屬物種進行流式細胞

技術測定時，無法獲得 CyStain UV Precise P 試劑

盒裂解液的情況下，也可選擇 GLB 進行試驗。蘭

科普遍存在核內再復制現象[12]，蘭屬組織器官中

也均存在多倍體化[30]。本研究所選的 4 種植物組

織中，根尖和花萼片均存在不同程度的內源多倍

體化現象，內源多倍體化在植物倍性鑒定中會造

成倍性改變的假象，對結果的準確性產生影響；

嫩葉和花梗出峰穩(wěn)定，因嫩葉不受開花等影響，

在幼苗期及成苗期均可以采樣，是蘭屬倍性檢測

的最佳組織材料。

多倍體育種是觀賞植物育種的重要方向之一。

第 11 期 冷青云等：基于流式細胞術的蘭屬雜交后代倍性鑒定 2223

圖 3 不同種（品種）流式細胞儀測定直方圖

Fig. 3 Histograms of different species (varieties) using flow cytometry

D1：二倍體；D2：三倍體；D3：四倍體；比例尺：50 μm。

D1: Diploid; D2: Triploid; D3: Tetraploid; Scale: 50 μm.

圖 4 不同倍性蘭屬種質葉片氣孔特征

Fig. 4 Stomatal characters of different ploids in Cymbidium hybrids

目前商業(yè)化的大花蕙蘭品種多數為多倍體。不同

倍性品種間雜交是蘭屬多倍體的主要選育途徑，

三倍體可由四倍體為親本與二倍體雜交產生，四

倍體由四倍體和四倍體雜交產生，二倍體品種間

雜交也能產生四倍體的子代[8, 10]。本研究在 2 個

二倍體為親本的雜交組合后代中檢測到三倍體和

四倍體，四倍體可能是由二倍體合子經體細胞加

倍后發(fā)育成植株，三倍體是由未減數分裂的 2n 配

2224 熱帶作物學報 第 44 卷

子和經減數分裂 n 配子受精融合發(fā)育而成，其中

2n 配子來源于母本的概率大于父本，因為在獲得

多倍體雜交組合的母本均為雜交種，黃金小神童

是建蘭（C. ensifolium）和大花蕙蘭（C. Enid Haupt）

的雜交種，經多次雜交選育而成，具有 50%建蘭、

12.5%美花蘭和 6.25%獨占春的血統(tǒng)[英國皇家園

藝學會（RHS）的蘭科植物品種國際登錄網]。有

研究表明遠緣雜交是獲得高效發(fā)生 2n 配子資源

的有效手段，雜交種在配子形成過程中減數分裂

異常，出現 2n 配子概率顯著高于原生種[31-32]。

從本研究中雜交組合 3 比組合 2 出現多倍體比例

高的現象，也可發(fā)現雜交代數越高，遺傳背景越

復雜，獲得可育配子比例低，產生后代數量也相

對少，但更容易出現多倍體。在蘭屬雜交育種中，

親本選擇可以親緣關系較遠，親本至少有一方是

經過多代雜交后的雜交種，這樣子代植株倍性會

相對豐富。

染色體組的加倍會導致基因表達和調控的改

變，從而造成植物形態(tài)和生理上的相應變化，如

葉片變寬、變厚，花瓣變厚、顏色變深，氣孔長

度和寬度增大、密度降低、育性和抗性改變等。

本研究發(fā)現，隨著倍性的提高氣孔的長度和寬度

均增大，氣孔密度變小。這與張源源等[33]在橡膠

多倍體研究中的結果相似。而株型、花朵數量、

大小和顏色、花期長短、抗性及育性等特性有待

進一步觀察。

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Chinese Journal of Tropical Crops

收稿日期 2023-06-30；修回日期 2023-09-15

基金項目 河南省重點研發(fā)與推廣專項（科技攻關）（No. 232102111101）；河南省林木種質資源建設項目（豫財環(huán)資[2023]60 號）。

作者簡介 王世堯（1996—）， 男，碩士，研究實習員，研究方向：蝴蝶蘭栽培與育種。*通信作者（Corresponding author）：

王 ?。╓ANG Jun），E-mail：wangjun.hnzz@163.com。

基于表型的蝴蝶蘭花色數量分類

王世堯，張 果，楊書才，蔣拴麗，王瑞華，王 俊*

鄭州市農林科學研究所，河南鄭州 450005

摘 要：為精準界定蝴蝶蘭的花色，建立基于表型的蝴蝶蘭花色數量分類體系。本研究利用分光測色儀和比色卡測定

146 份蝴蝶蘭種質的花色表型，通過聚類分析且結合 ISCC-NBS 色名表示法對各蝴蝶蘭的花色命名，并進行數量分類研

究。結果表明：蝴蝶蘭花瓣和萼片顏色差異不大，唇瓣相較二者顏色更暗，彩度較大。基于側花瓣的 L*

、a*

、b*

值聚

類分析的分類結果不能完全表征蝴蝶蘭花色的分類特點；ISCC-NBS 色名表示法將蝴蝶蘭花色分為黃、棕、紅、紫羅蘭、

粉、紫、白 7 大色系，各色系與 CIE Lab 表色系統(tǒng)的各參數具備較好的對應關系，可實現對不同蝴蝶蘭花色的定量描

述，色系分類合理；蝴蝶蘭花色豐富，且其不同色系的花色存在顯著差異，缺乏藍綠色系；整體上蝴蝶蘭花色明度和

彩度呈負相關，可分為 2 個類群，第 1 類群包含黃、棕、紫羅蘭、粉、紫、白色系，第 2 類群為紅色系。

關鍵詞：蝴蝶蘭；花色表型；數量分類；聚類分析；ISCC-NBS 色名表示法

中圖分類號：S682.31 文獻標識碼：A

Numerical Classification of Phalaenopsis Flower Colour Based on

Phenotype

WANG Shiyao, ZHANG Guo, YANG Shucai, JIANG Shuanli, WANG Ruihua, WANG Jun*

Zhengzhou Institute of Agriculture and Forestry Science, Zhengzhou, Henan 450005, China

Abstract: The study aimed to define the floral colour of Phalaenopsis precisely and establish a classification system of

Phalaenopsis based on floral colour phenotypes. In this study, the floral colour phenotypes of 146 Phalaenopsis germplasm resources were determined using colourimeter and RHSCC, and the floral colours of each Phalaenopsis were

named by cluster analysis and combined with ISCC-NBS system, and the quantitative classification was studied. The

results showed that the colour of Phalaenopsis petals and sepals did not differ much, and the lip petals were darker and

more colourful than petals and sepals. The classification results based on cluster analysis of L*

, a*

and b*

of petals could

not fully characterize the classification of Phalaenopsis flower colours. The ISCC-NBS system divided Phalaenopsis

flower colour into yellow, brown, red, violet, pink, purple and white groups. Each group had a preferable correspondence with L*

, a*

and b*

parameters of the CIE Lab system, which could realize the quantitative description of different

Phalaenopsis flower colour and the colour group classification was reasonable. Phalaenopsis were rich and colourful, and

there were significant differences between different colour groups of Phalaenopsis, but lacking blue-green colour. Overall

the brightness and colouration of Phalaenopsis were negatively correlated, and could be divided into two groups, the first

type containing yellow, brown, violet, pink, purple and white groups, the second type containing red colour groups.

Keywords: Phalaenopsis; flower colour phenotype; numerical classification; cluster analysis; ISCC-NBS method

DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2023.11.011

蝴蝶蘭（Phalaenopsis spp.），因花姿似蝴蝶

飛舞而得名，素有“蘭之皇后”之美譽[1]。當前，

全球已登錄 38 963 個栽培蝴蝶蘭品種，長期的雜

交育種使蝴蝶蘭具有豐富絢麗的色彩[2]?；ㄉ?/p>

2228 熱帶作物學報 第 44 卷

觀賞植物的重要經濟性狀，精準定義蝴蝶蘭花色

對其分類、品種鑒定及產業(yè)交流的規(guī)范性舉足輕

重[3]。陳和明等[4]基于 213 份蝴蝶蘭資源的 18 個

性狀構建蝴蝶蘭品質性狀綜合評價體系，花色性

狀為品質評價的關鍵指標之一，且變異程度較高。

湯楷等[5]對 17 份蝴蝶蘭新品種（系）的 16 個性

狀運用加權主成分分析法進行商品性綜合評價，

花色權重占 20.87%。近年來，蝴蝶蘭花色表型研

究主要借助定性描述及比色卡來鑒別花色，宋一

嵐等[6]通過定性描述將蝴蝶蘭分為白、黃、紫紅、

深紫、暗紫及 6 個復色鑲嵌色系；陳劍鋒等[7]利

用比色卡對 127 份蝴蝶蘭各花器官的主色進行了

定義，但 2 種方式皆易受環(huán)境和人為因素影響進

而造成較大誤差。分光色差儀等精密儀器可有效

消除上述影響，具備穩(wěn)定性高、可量化的特點，

目前已廣泛應用于菊花[8]、荷花[9]、百合[10]、月

季[11]等多種重要觀賞植物的花色分類研究中，使

得花色表型的數量化得以實現。

隨著蝴蝶蘭種質資源愈加豐富，蝴蝶蘭在花

色素組成[12]、花色功能基因鑒定[13-14]及基于形態(tài)

特征的系統(tǒng)分類學[15-16]等方面開展了大量的研究

工作，但基于蝴蝶蘭花色表型數量化的分類研究

尚無相關報道。對觀賞植物的花色進行精準評價亦

是建立其與各組遺傳標記之間聯(lián)系的前提[17]，因

此，亟須建立一套科學系統(tǒng)的基于表型的蝴蝶蘭

花色數量分類體系。本研究通過使用分光測色儀

結合英國皇家園林協(xié)會 RHS 植物比色卡（Royal

Horticultural Society Colour Chart, RHSCC）對 146

份蝴蝶蘭種質進行花色測定，采用聚類分析和

ISCC-NBS 色名表示法對其進行分類命名，并對

分布情況進行分析，以期精準定義蝴蝶蘭花色并

科學分類，為蝴蝶蘭品種數量分類與鑒定、花色

定向育種等工作提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料均為鄭州市農林科學研究所蝴蝶蘭

種質資源圃所收集、保存的資源。2022 年 9—10

月對資源圃內資源利用降溫設備進行催花處理，

2023 年 1—2 月進入盛花期。經初步鑒定和篩選，

選取長勢良好，花色表型穩(wěn)定的 146 份蝴蝶蘭種

質（部分如圖 1 所示），于盛花期的晴朗上午進行

取樣測定。

圖 1 供試部分蝴蝶蘭種質

Fig. 1 Selected Phalaenopsis germplasm for testing

1.2 花色表型的測定

對每個品種選取具有典型顏色特征的 3 朵

花，分別利用 RHSCC 和分光測色儀（三恩時

TS7036）進行測定：在室內自然光條件下用比色

卡進行比色，3 次重復后以出現頻率最高的顏色

為最終測定結果；在光源 C/2°、測量口徑 4 mm

的參數設置下使用測色儀，置花被片平鋪于白紙

上，將集光孔對準測定部位（圖 2），測定 3 個重

復，取均值代表花被片顏色。

蝴蝶蘭側花瓣、萼片及唇瓣由斑點、條紋等

圖案導致的異色，根據其是否能覆蓋底色來判定，

若連成片狀且顏色異于底色則認為是復色，若不

能將底色覆蓋則定義為純色。

1~3：純色測定部位；A(a)~C(c)：復色測定部位。

1-3: The measuring position of pure colour flower; A(a) -C(c): The

measuring position of the biocolour flower.

圖 2 蝴蝶蘭花色測定部位

Fig. 2 Measuring position of Phalaenopsis