高純度質(zhì)粒大量快速提取試劑盒產(chǎn)品信息：

保存條件：收到本產(chǎn)品后按照上面指示溫度存放各成份，儲存18 個月不影響使用效果。產(chǎn)品介紹：

本試劑盒采用改進 SDS-堿裂解法裂解細胞，離心吸附柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜在高鹽、低pH 值狀態(tài)下選擇性地結合溶液中的質(zhì)粒 DNA，再通過去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細菌成分去除，最后通過低鹽、高 pH 值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。

產(chǎn)品特點：

1.離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜全部采用進口特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復性好。克服了國產(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端。2.不需要使用有毒的苯酚、氯仿等試劑，從 100-200 ml 大腸桿菌LB 培養(yǎng)液中，可快速提取 0.2-0.5 mg 高質(zhì)量的高拷貝質(zhì)粒 DNA，提取率達80 %左右。3.獲得的質(zhì)粒產(chǎn)量高、超螺旋構象比例高、純度好，可以直接用于酶切、轉化、PCR、體外轉錄和測序等各種分子生物學實驗。

試劑盒組成 保存

DP107-01

10 次

RNase A（干粉） 室溫 1 支

溶液 P1 4℃ 100ml

溶液 P2 室溫 100ml

溶液 P3 室溫 100ml

3M 乙酸鈉 室溫 1ml

去蛋白液 PD 室溫 100ml

漂洗液 WB 室溫

25ml×2

第一次使用前加入 100ml 無水乙醇洗脫緩沖液 EB 室溫 10ml

吸附柱 AC 室溫 10 個

收集管（50ml） 室溫 10 個

注意事項：

1.第一次使用時，將試劑盒所帶全部的 RNase A 加入溶液P1 后（終濃度100μg/ml）置于 4℃保存。如果溶液 P1 中 RNase A 失活，提取的質(zhì)?？赡軙形⒘縍NA殘留，在溶液 P1 中補加 RNase A 即可。

2.環(huán)境溫度低時溶液 P2 中 SDS 會析出出現(xiàn)渾濁或者沉淀，可在37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復澄清，不要劇烈搖晃，以免形成大量的泡沫。3.避免試劑長時間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH 值變化。4.溶液 P3 和去蛋白液 PD 中含有刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套，避免沾染皮膚、眼睛和衣服。若沾染皮膚或眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。5.提取質(zhì)粒的量與細菌培養(yǎng)濃度、質(zhì)?？截悢?shù)等因素有關。如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)粒或大于 10 kb 的大質(zhì)粒，應加大菌體使用量，同時按比例增加P1、P2、P3的用量，洗脫緩沖液應在 70℃預熱?？梢赃m當?shù)难娱L吸附和洗脫的時間，提高提取效率。6.得到的質(zhì)粒 DNA 可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。OD260值為 1 相當于大約 50 μg/ml DNA。電泳可能為單一條帶，也可能為2 條或者多條DNA 條帶，這主要是不同程度的超螺旋構象質(zhì)粒泳動位置不一造成，與提取物培養(yǎng)時間長短、提取時操作劇烈程度等有關。本公司產(chǎn)品正常操作情況下基本超螺旋可以超過 90%。

7.洗脫液 EB 不含有螯合劑 EDTA，不影響下游酶切、連接等反應。也可以使用水洗脫，但應該確保 pH 大于 7.5，pH 過低影響洗脫效率。用水洗脫，質(zhì)粒應該保存-20℃。質(zhì)粒 DNA 如果需要長期保存，可以用 TE 緩沖液洗脫（10 mMTris-HCl，1mMEDTA，pH 8.0），但是 EDTA 可能影響下游酶切反應，使用時可以適當稀釋。自備試劑：無水乙醇

操作步驟：

提示：

? 第一次使用前請先在漂洗液 WB 瓶中加入指定無水乙醇，充分混勻，加入后請及時在方框打鉤標記已加入乙醇，以免多次加入!

? 將 RNase A（干粉）倒入溶液 P1 中并使用 P1 沖洗離心管，混勻，每次使用后置于 2-8℃保存。

? 將溶液 P3 放在冰上預冷。

1. 取 100-300 ml 過夜培養(yǎng)的菌液，12,000 rpm 離心 3 min，盡可能的倒干上清，收集菌體。

2. 用 10 ml 溶液 P1 重懸菌體沉淀，移液器吹打或者渦旋振蕩至徹底懸浮。3. 加 10 ml 溶液 P2，溫和地上下翻轉 4 -7 次使菌體充分裂解，室溫放置4 min。

4. 加 10 ml 溶液 P3，立即溫和地上下翻轉 4 -7 次，充分混勻此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。冰上靜置 5 min，4℃條件下 12,000 rpm 離心 10 min，小心取上清，避免吸取到漂浮的白色沉淀。

5. 取上清加入新的 50 ml 離心管（自備）中，向上清中加入11 ml 異丙醇，上下顛倒混勻。

6. 將上一步 5 中的混合溶液加入吸附柱 AC 中（吸附柱放入收集管中），靜置2min，12,000 rpm 離心 2 min，倒掉收集管中的廢液。

注意：吸附柱的最大容積為 15 ml， 所以第 5 步中所得溶液分多次過柱。如果離心機轉子傾角較大時，建議加入吸附柱的溶液體積不超過10 ml，以防發(fā)生漏液現(xiàn)象。7. 加入 10 ml 去蛋白液 PD，12,000 rpm 離心 2 min，棄掉廢液。8. 加入 10 ml 漂洗液 WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000 rpm離心2min，棄掉廢液。

9. 重復操作步驟 8。

10. 將吸附柱 AC 放回空收集管中，最高速（最好大于12,000 rpm，如果離心機轉速低，需要相應延長離心時間）離心 5 min，去除基質(zhì)膜上的乙醇殘留，用槍頭吸除內(nèi)圈壓環(huán)和柱壁之間可能殘留的乙醇，室溫或者烘箱晾干幾分鐘。注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶促反應（酶切、PCR 等）。

11. 取出吸附柱 AC，放入一個干凈的 50 ml 離心管（自備）中，在吸附膜的中間部位加 1 ml 洗脫緩沖液 EB（事先在 65-70℃水浴中預熱效果更好），室溫放置2 min，12,000rpm 離心 5 min。需要較多量質(zhì)粒，可將得到的溶液重新加入吸附柱中，離心2min。（注意：洗脫液的 pH 值對于洗脫效率有很大影響。若用ddH2O 做洗脫液應保證其pH值在 7.5-8.0 圍內(nèi)，pH 值低于 7.0 會降低洗脫效率。洗脫緩沖液用量的多少主要是依據(jù)質(zhì)粒的拷貝數(shù)以及實驗所需要的濃度來確定。洗脫緩沖液體積不少于1 ml，體積過小影響回收效率。DNA 產(chǎn)物應保存在-20℃，以防 DNA 降解。）可選步驟（如果需要更高濃度的質(zhì)粒，可進行如下操作）：12. 上述 1 ml 洗脫液分兩管，每 0.5 ml 洗脫液加入 1 ml 無水乙醇以及50 μl 3M乙酸鈉，混勻，-20℃放置 1 小時，12,000 rpm 離心 10 min，小心棄上清。13. 加入 0.5 ml 的 70%乙醇洗滌沉淀, 室溫 12,000 rpm 離心5 min，小心棄上清。14. 重復操作步驟 13。

15. 空氣中干燥沉淀約 5-10 min，根據(jù)需要用適當體積（一般100 μl）的緩沖液EB溶解沉淀。

BM241119