二、研究進展 █

﹣193﹣

在動物模型篩選出最優(yōu)類型的 LF 為 apo-LF，用來指導(dǎo) LPS 誘導(dǎo)

的體外幼鼠原代腸上皮細胞炎癥模型，將分離鑒定完成的幼鼠原代腸

上皮細胞培養(yǎng)到密度為 80%左右，將細胞分為對照組（不含任何藥

物）、LF（1 g/L）、LF（5 g/L）、LF（10 g/L）組、LPS 組、LPS+LF

（1 g/L）、LPS+LF（5 g/L）組和 LPS+LF（10 g/L）組，將細胞培養(yǎng)

48 h 左右，收集細胞進行 Q-PCR 和 WB 檢測。試驗結(jié)果顯示，與正

常組相比，apo-LF 組無顯著變化，LPS 組 PPAR-γ 和 PFKFB3 的 mRNA

和蛋白水平顯著降低，而 NF-κB、TNF-α 和 IL-1β 水平顯著升高

（p<0.01）。與 LPS 組相比，apo-LF+LPS 組的 PPAR-γ 和 PFKFB3 的

mRNA 和蛋白水平顯著升高，而 NF-κB、TNF-α 和 IL-1β 水平顯著降

低（p<0.01）。且在該試驗中篩選出 apo-LF 最合適的劑量為 10 g/L。

結(jié)果證明了 apo-LF 通過調(diào)控 PPAR-γ 和 NF-κB 通路及 TNF-α、IL-1β

和 PFKFB3 基因緩解 LPS 誘導(dǎo)的幼鼠原代腸上皮細胞的炎癥損傷。

█ MRT 2022 年度報告

﹣194﹣

圖 2 PPAR-γ、PFKFB3、NF-κB、TNF-α 和 IL-1β 在幼鼠腸上皮細胞的表達水平。A：

RT-PCR 檢測 PPAR-γ、PFKFB3、NF-κB、TNF-α 和 IL-1β 的 mRNA 水平；B：化學(xué)發(fā)光儀

捕捉的 PPAR-γ、PFKFB3、NF-κB、TNF-α 和 IL-1β 蛋白條帶；C：western blot 檢測

PPAR-γ、PFKFB3、NF-κB、TNF-α 和 IL-1β 的蛋白水平。

二、研究進展 █

﹣195﹣

3 結(jié)論

該研究通過 LPS 誘導(dǎo)幼鼠炎癥模型試驗，篩選出最優(yōu)鐵飽和度

的乳鐵蛋白為缺鐵型乳鐵蛋白（apo-LF），繼續(xù)通過 LPS 誘導(dǎo)幼鼠原

代腸上皮細胞炎癥模型試驗驗證了apo-LF通過調(diào)控PPAR-γ、PFKFB3、

NF-κB 通路發(fā)揮其活性作用。

研究成果已發(fā)表在《Journal of Dairy Science》雜志，該研究由現(xiàn)

代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資金（CARS-36）和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工

程（ASTIP-IAS12）資助，范琳琳和姚倩倩為文章第一作者，李慧穎

和鄭楠為文章通訊作者。

（撰稿人：范琳琳）

——FAN LINLIN, YAO QIANQIAN, WU HAOMING, WEN

FENGEN, WANG JIAQI, LI HUIYING, ZHENG NAN. Protective effects

of recombinant lactoferrin with different iron saturations on enteritis injury

in young mice.

Journal of Dairy Science. 2022,S0022-0302(22)00203-X.

█ MRT 2022 年度報告

﹣196﹣

10. 工業(yè)污染區(qū)重金屬對牛奶品質(zhì)的影響

奶牛養(yǎng)殖過程中，多種因素導(dǎo)致氧化應(yīng)激，如飼料中的農(nóng)藥和霉

菌毒素殘留及飼料中油脂的氧化變質(zhì)、抗生素的使用、日糧中重金屬

及微量元素的含量等，均會引起體內(nèi)活性氧過量而造成抗氧化系統(tǒng)損

傷，誘發(fā)氧化應(yīng)激。重金屬導(dǎo)致動物體內(nèi)自由基升高，發(fā)生氧化應(yīng)激。

奶牛氧化應(yīng)激進程中，會對牛奶產(chǎn)生很多影響，使牛奶中的成分發(fā)生

變化，比如脂肪酸的組成，維生素 E、β-胡蘿卜素和維生素 C 的含量

的變化，進而影響貨架期及風(fēng)味。

中國約有 3850 個皮革及皮革制品加工廠。皮革加工是砷（As）、

鉛（Pb）、鉻（Cr）、鎘（Cd）和其他重金屬的來源。本試驗研究皮

革加工區(qū)牧場重金屬引起的氧化應(yīng)激對奶牛血液中氧化及抗氧化指

標的影響及與重金屬的關(guān)系；探索氧化應(yīng)激引起牛奶脂肪酸濃度的變

化。

1 試驗方法

以皮革工業(yè)區(qū)（污染區(qū)）附近 2 個牧場作為試驗組及遠離（>50

km）皮革加工區(qū)的 1 個牧場作為對照組（非污染區(qū)），每個牧場選取

15 頭泌乳中期荷坦奶牛，共 45 頭奶牛（胎次=2.49 ± 0.66，DIM=197.3

± 15.9d，產(chǎn)奶量=24.20 ± 3.14 kg）。

二、研究進展 █

﹣197﹣

早上 5:30，晨飼前，從奶牛頸靜脈采集血液，一管采集到抗凝管

中，4 ℃保存，用于重金屬測定；一管采集到促凝管中，3000× g，4 ℃

離心 15 min 分離出血清，分裝在凍存管中?80 ℃保存，用于抗氧化指

標的測定。6:00 和 17:00 采集生乳樣品，并按照 6:4 的比例混合，用

于脂肪酸的測定。

全血樣品經(jīng)微波消解后用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP- MS）

測定重金屬。血清樣品按試劑盒說明書的方法操作測定抗氧化指標。

生乳樣品經(jīng)前處理后用氣相色譜-質(zhì)譜儀（GC-MS）測定脂肪酸。

2 試驗結(jié)果

污染區(qū)和非污染區(qū)奶牛血液中 As，Pb 和 Cr 的濃度差異顯著

（P<0.05）。其中，污染區(qū)奶牛血液中 Pb 的濃度（16.27 ± 8.63 μg/L）

是非污染區(qū)（6.25 ± 3.04 μg/L）的 2 倍以上（P<0.05）（表 1）。

表 1 污染區(qū)和非污染區(qū)奶牛血液重金屬含量

重金屬(μg/L) 非污染區(qū) (n = 15) 污染區(qū)(n = 30) P 平均值 ± 標準差 范圍 平均值 ± 標準差 范圍

As 1.25 ± 0.18 1.04–1.66 1.61 ± 0.28 1.19?2.18 0.000

Pb 6.25 ± 3.04 2.76–12.08 16.27 ± 8.63 6.48?46.43 0.000

Cr 1.55 ± 0.56 1.08–2.98 2.54 ± 1.51 1.16?9.11 0.014

Cd 0.125 ± 0.043 0.07–0.21 0.119 ± 0.057 0.06?0.26 0.702

將污染區(qū)的 2 個牧場和非污染區(qū)的 1 個牧場血液中的重金屬和

主要氧化應(yīng)激參數(shù)數(shù)據(jù)分為 3 組，進行 PCA 分析。污染區(qū)與對照區(qū)

發(fā)生明顯的分組和聚類（圖 1）。說明由重金屬引起的奶牛的氧化應(yīng)

激，總體上來說，污染區(qū)和對照區(qū)存在差異。與非污染區(qū)相比，污染

區(qū)奶牛血清中的 GST、GPX 和 GSH 水平顯著降低（P<0.05）（表 2）。

█ MRT 2022 年度報告

﹣198﹣

圖 1. 奶牛血液中重金屬和氧化應(yīng)激的 PCA 分析。注：A, 牧場 A；B, 牧場 B；牧場 A

和牧場 B 為污染牧場；Control, 牧場 C, 非污染牧場。

表 2 污染區(qū)和非污染區(qū)奶牛血清中氧化應(yīng)激參數(shù)的濃度

抗氧化指標 非污染區(qū)(n = 15) 污染區(qū)(n = 30)

SOD U/mL 66.90 ± 8.25 69.10 ± 7.99

GST U/mL 68.81 ± 16.66 a

52.09 ± 21.16 b

GPX U/L 501.04 ± 58.62 a 435.29 ± 19.14 b

GR ng/mL 267.96 ± 114.50 292.83 ± 134.76

CAT ng/mL 23.98 ± 6.93 21.67 ± 5.66

GSH μmol/L 33.18 ± 19.91 a

13.18 ± 7.99 b

MT ng/mL 1458.19 ± 520.18 1195.85 ± 426.03

MDA nmol/mL 28.11 ± 19.11 20.23 ± 20.47

牛奶是膳食脂肪的重要來源，尤其含有豐富的脂肪酸對人體健康

有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)污染區(qū)牧場生乳中不飽和脂肪酸亞油酸

（c18:2n6c）的比例顯著低于非污染區(qū)（表 3）。C18:2n6c 可以提高

胰島素敏感性，從而降低 2 型糖尿病的發(fā)病率，對人體健康具有有益

作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)生乳中的 C18:2n6c 含量與奶牛的血 Pb 水平之

間存在顯著的負相關(guān)性（n=45，r=?0.536，P<0.01），與血清 GSH 呈

顯著的正相關(guān)關(guān)系 (n = 45, r = 0.381, P < 0.01）（圖 2）。

二、研究進展 █

﹣199﹣

表 3 污染區(qū)和非污染區(qū)生乳中脂肪酸的含量

脂肪酸(%) 非污染區(qū)(n = 15) 污染區(qū)(n = 30)

C6:0 1.96 ± 0.22 1.91 ± 0.55

C8:0 1.4 ± 0.19 1.32 ± 0.52

C10:0 8.5 ± 1.52 a

7.28 ± 2.19 b

C12:0 4.11 ± 0.71 a

3.26 ± 0.81 b

C13:0 0.04 ± 0.06 0.05 ± 0.05

C14:0 12.25 ± 1.26 a

11.19 ± 1.39 b

C15:0 1.23 ± 0.14 a

1.10 ± 0.18 b

C16:0 32.01 ± 2.74 a

35.72 ± 4.54 b

C17:0 0.82 ± 0.22 0.75 ± 0.091

C18:0 11.13 ± 1.6 10.69 ± 2.08

C20:0 0.09 ± 0.08 0.10 ± 0.07

C23:0 0.19 ± 0.11 0.18 ± 0.07

總飽和脂肪酸 75.98 ± 8.66 75.72 ± 9.41

C14:1 1.30 ± 0.22 1.21 ± 0.31

C15:1 0.25 ± 0.17 0.21 ± 0.10

C16:1 1.58 ± 0.41 1.64 ± 0.66

C17:1 0.16 ± 0.12 0.15 ± 0.09

C18:1n9t 0.45 ± 0.24 0.45 ± 0.29

C18:1n9c 20.97 ± 2.48 21.03 ± 1.63

C20:1 0.22 ± 0.20 0.15 ± 0.11

總單不飽和脂肪酸 24.93 ± 7.02 24.83 ± 7.20

C18:2n6t 0.29 ± 0.11 0.23 ± 0.11

C18:2n6c 2.77 ± 0.51 a 2.35 ± 0.49 b

C18:3n6 0.19 ± 0.19 0.19 ± 0.15

C18:3n3 0.35 ± 0.22 0.29 ± 0.13

C20:3n3 0.23 ± 0.19 0.25 ± 0.19

總多不飽和脂肪酸 3.83 ± 1.05 3.31 ± 0.89

(a) (b)

圖 2. 生乳中 C18:2n6c 含量與（a）血鉛濃度和（b）血清谷胱甘肽水平之間的關(guān)系。

非污染區(qū)域， 污染區(qū)域。

█ MRT 2022 年度報告

﹣200﹣

3 結(jié)論

皮革工業(yè)對附近牧場奶牛的血 Pb 和 As 水平產(chǎn)生了重大影響。

在污染區(qū)域觀察到奶牛血清 GST、GPX 和 GSH 活性顯著降低。污染

區(qū)生乳中亞油酸（C18:2n6c）發(fā)生了顯著變化。重金屬暴露會引起奶

牛氧化應(yīng)激，導(dǎo)致生乳中不飽和脂肪酸的改變。

研究成果已于 2022 年 7 月發(fā)表在《Animals》雜志。該成果由生

乳中環(huán)境污染物風(fēng)險評估項目、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程和現(xiàn)代

農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項資金資助，第一作者蘇傳友、屈雪寅，通訊作

者鄭楠研究員。

（撰稿人：蘇傳友）

——SU CHUANYOU, QU XUEYIN, GAO YANAN, ZHOU

XUEWEI, YANG XUE, ZHENG NAN. Effects of Heavy Metal Exposure

from Leather Processing Plants on Serum Oxidative Stress and the Milk

Fatty Acid Composition of Dairy Cows: A Preliminary Study.

Animals, 2022,12, 1900.

二、研究進展 █

﹣201﹣

11. 牧場環(huán)境和生鮮乳中蠟樣芽孢桿菌的腐敗研究

1.研究背景

蠟樣芽孢桿菌是一類環(huán)境中常見的細菌，在歐盟，每年可引起500

多例食源性疾病確診病例。蠟樣芽孢桿菌可誘發(fā)兩種類型的食物中毒：

嘔吐和腹瀉，其中腹瀉型是由腸毒素引起，而腸毒素總是與奶及奶制

品有關(guān)。

蠟樣芽孢桿菌污染不僅會威脅人類健康，還會導(dǎo)致奶制品變質(zhì)，

是奶制品和工廠環(huán)境中的主要監(jiān)控微生物。作為一種孢子形成菌群，

蠟樣芽孢桿菌耐熱，可在巴氏殺菌奶和超高溫滅菌（UHT）奶中存活。

此外，它可以在乳品廠的奶罐和管道系統(tǒng)上形成生物被膜，從而增加

耐熱性和 CIP 清洗程序。蠟樣芽孢桿菌會影響奶及奶制品的感官質(zhì)

量，因為它會產(chǎn)生細胞外蛋白酶。蛋白酶的產(chǎn)生會引起結(jié)構(gòu)和風(fēng)味的

變化，例如“甜凝固”缺陷。

蠟樣芽孢桿菌孢子在擠奶過程中污染生鮮乳，并已被確定為乳制

品工業(yè)中的主要腐敗細菌。因此，本研究旨在調(diào)查中國天津某牧場環(huán)

境和生鮮乳中蠟樣芽孢桿菌的腐敗和產(chǎn)毒潛力。不同蠟樣芽孢桿菌多

位點序列分型（MLST）分離株的蛋白水解活性和產(chǎn)毒潛力的組合將

有助于評估中國奶牛場蠟樣芽孢桿菌的種群動態(tài)。

█ MRT 2022 年度報告

﹣202﹣

2.試驗方法

2.1 樣品收集和蠟樣芽孢桿菌鑒定

2019 年 9 月至 11 月間，從中國天津某牧場采集了 100 份樣本。

其中包括 82 個環(huán)境樣本（9 個糞便樣本、3 個墊料樣本、3 個空氣樣

本、9 個飲用水樣本、9 個乳頭皮膚樣本、9 個乳頭杯樣品、9 個前藥

浴溶液樣品、9 個后藥浴溶液樣品、9 個前藥浴杯樣品、9 個后藥浴杯

樣品、3 個飼料樣品、1 個噴淋水樣品）和 18 個生鮮乳樣品。

所有樣品均按照《食品安全國家標準食品微生物檢驗方法》（GB

4789.40-2010）分離蠟樣芽孢桿菌，通過 16S rRNA 和 panC 鑒定，對

擴增片段進行測序后，使用 BLAST 與 NCBI 數(shù)據(jù)庫進行比對，同源

性程度高于 98％則認為是蠟樣芽孢桿菌。最后通過七個管家基因

（glpF、gmk、ilvD、pta、pur、pycA 和 tpi）進行多位點序列分型（MLST）

分析，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2.2 蛋白水解活性

將 100 μL 的分離株菌液涂布于含有 UHT 牛奶（10%）的營養(yǎng)瓊

脂培養(yǎng)基平板上，分別在 7℃、25℃和 37℃下培養(yǎng) 7 天，每天觀察。

若產(chǎn)生蛋白水解圈則判為陽性。

2.3 蛋白水解活性定量

將蠟樣芽孢桿菌分離株在 7℃、25℃和 37℃下在 5mL UHT 牛奶

中培養(yǎng) 5 天后，在 4℃下以 4000×g 轉(zhuǎn)速離心 20 分鐘。將上清液（1

mL）加入到 9 mL 新鮮的 UHT 牛奶中，并在 37℃下培養(yǎng) 14 天。

二、研究進展 █

﹣203﹣

三硝基苯磺酸（TNBS）法用于測定可以表明蛋白質(zhì)水解的游離

α-氨基。將釋放的α-氨基與 TNBS 試劑在 pH9.2 避光條件下反應(yīng) 100

分鐘后檢測。從吸收率確定生奶中的蛋白水解酶水平。

2.4 蛋白酶的耐熱性

將 2 mL 蛋白酶上清液加入玻璃管中，并在 55℃加熱 5 分鐘、95℃

加熱 5 分鐘、121℃加熱 10 秒或 135℃加熱 5 秒。然后用 9 mL 脫脂

UHT 牛奶稀釋，并分別在 7℃、25℃和 37℃下培養(yǎng) 14 天。

3.結(jié)果與討論

在 82 個牧場環(huán)境樣品和 18 個生鮮乳樣品中共分離得到 47 株蠟

樣芽孢桿菌，可分為 14 種序列分型（ST），占主導(dǎo)地位的是 ST1150，

可以從生鮮乳、糞便、空氣、飲用水、乳頭皮膚、乳頭杯、前藥浴液、

后藥浴液、前藥浴杯和后藥浴杯等十種不同類型的樣品中檢出。此外，

此次檢出還包含了 5 種新的 ST 分型（ST2749、ST2750、ST2751、

ST2752 和 ST2753）。

在 25℃和 37℃時，共有 42 株分離株（89.36%）在含有 UHT 奶

的瓊脂上產(chǎn)生蛋白水解圈，而在 7℃條件下時沒有產(chǎn)生蛋白水解圈。

所有分離株的總蛋白水解活性亦被定量（圖 1）。當(dāng)?shù)鞍姿饣钚愿?/p>

于 2 μmol/mL 甘氨酸等量時，菌株的蛋白水解能力被認為是具有活性

的。42 株蠟樣芽孢桿菌分離株產(chǎn)生的蛋白酶中發(fā)現(xiàn)了蛋白水解活性

的差異。在 37℃時，分離株的蛋白水解活性（21.43±2.89 μmol/mL 甘

█ MRT 2022 年度報告

﹣204﹣

氨酸當(dāng)量）顯著高于 25℃（17.25±3.56 μmol/mL 甘氨酸當(dāng)量）和 7℃

（14.32±1.96 μmol/mL 甘氨酸當(dāng)量）（p < 0.001）。

圖 1. 42 株蠟樣芽孢桿菌菌株在 7℃、25℃和 37℃下的蛋白水解活性。數(shù)據(jù)代表蛋白水

解活性的平均值±SEM (****:p＜0.0001)。

圖 2. 42 株蠟樣芽孢桿菌在 7℃、25℃和 37℃產(chǎn)生的蛋白酶經(jīng)不同溫度和時間處理后殘

留蛋白水解活性百分比

將 42 株蠟樣芽孢桿菌分離株在 7℃、25℃和 37℃下產(chǎn)生的所有

蛋白酶加熱，以研究 55℃ 5min、95℃ 5min、121℃ 10s 和 135℃ 5s

條件下的耐熱性。不同溫度熱處理后蛋白水解活性均顯著降低

二、研究進展 █

﹣205﹣

（p<0.05）。但是，121℃ 10 s 和 135℃ 5s 熱處理后，7℃產(chǎn)生的蛋

白酶的殘留活性顯著高于 25℃和 37℃產(chǎn)生的蛋白酶（p<0.01），表明

蠟樣芽孢桿菌在低溫下產(chǎn)生的蛋白水解酶的耐熱能力更強（圖 2）。

4.結(jié)論與展望

本研究揭示了牧場環(huán)境及生鮮乳中蠟樣芽孢桿菌的多樣性。當(dāng)生

鮮乳在低溫存儲（7℃）時，蛋白水解活性較低，但是其對 UHT 處理

具有更高的抗性。該研究結(jié)果強調(diào)了應(yīng)監(jiān)測 UHT 產(chǎn)品的生乳中的蠟

樣芽孢桿菌污染，并應(yīng)實施嚴格的清潔管理來控制蠟樣芽孢桿菌以確

保高品質(zhì)的奶制品。

該研究成果已于 2022 年在《Frontiers in Microbiology》雜志上發(fā)

表。該研究得到國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估項目（GJFP20220304）、

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-IAS12）、國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)

技術(shù)體系（CARS36）等項目支持，孟璐助理研究員和碩士研究生張

瑞瑞為第一作者，王加啟研究員為通訊作者。

（撰稿人：孟璐，校稿人：許文君）

——MENG LU, ZHANG RUIRUI, DONG LEI, HU HAIYAN, LIU

HUIMIN, ZHENG NAN, WANG JIAQI, CHENG JIANBO.

Characterization and spoilage potential of Bacillus cereus isolated from

farm environment and raw milk.

Frontiers in Microbiology. 2022, 13:940611.

█ MRT 2022 年度報告

﹣206﹣

12. 頭孢菌素類抗生素對奶牛糞便中菌群和耐藥基因的影響

奶牛乳房炎被認為是奶牛最常見的疾病之一。奶牛乳房炎會對牛

奶衛(wèi)生質(zhì)量產(chǎn)生影響，并可導(dǎo)致牛奶產(chǎn)量的損失。乳房炎也是導(dǎo)致牛

場抗生素使用比例較高的疾病。在荷蘭，乳業(yè)中約 24%的抗生素用于

乳房炎治療，約 44%用于乳房炎預(yù)防。如今，抗生素的濫用已成為公

共衛(wèi)生的一大問題，抗生素的使用（包括口服和注射）對動物糞便的

微生物組有著深遠的影響，可能會導(dǎo)致抗生素耐藥基因的相對豐度增

加。持續(xù)使用抗生素來預(yù)防或治療乳房炎，抗生素耐藥性將大大增加

治療的難度和成本?？股啬退幓颍ˋntibiotic resistance genes, ARGs）

可以從糞便中轉(zhuǎn)移到環(huán)境中，并對土壤生態(tài)和公共健康構(gòu)成高風(fēng)險。

頭孢菌素在獸醫(yī)學(xué)中常被用來治療細菌感染。頭孢噻呋是一種第

三代頭孢菌素，被批準用于治療各種革蘭氏陰性細菌感染的疾病。頭

孢噻呋也是在奶牛上使用最多的抗生素之一，用于治療乳房炎、甲狀

腺炎和呼吸道疾病等，是美國唯一批準用于獸用的第三代頭孢類藥物。

頭孢喹肟是一種第四代頭孢菌素，只用于獸醫(yī)用途。目前，很少有報

道通過 16S rDNA 測序研究治療性使用頭孢噻呋和頭孢喹肟對奶牛

糞便中微生物群和耐藥基因的影響。因此，本研究的目的是研究頭孢

菌素治療后奶牛糞便微生物群和耐藥基因的變化，評價抗生素的使用

造成的影響，對合理使用抗生素具有重要意義。

二、研究進展 █

﹣207﹣

1 試驗方法

1.1 樣品采集

在本試驗采樣前，奶牛未使用抗生素?？偣策x擇了 8 頭患乳房炎

的奶牛。確診后，通過直腸取糞的方式將這些奶牛的糞便收集到 200

mL 無菌塑料瓶中，然后將頭孢噻呋注射到肌肉中，濃度為 2 mg/kg/

天，頭孢喹肟按 0.75 ng/kg/天的量進行乳房注射，兩種抗生素持續(xù)使

用 3 天。在第 1、2、3、4、6、8、9、11、13 和 15 天對所有奶牛進

行糞便取樣。牛奶中的體細胞計數(shù)在第 4 天恢復(fù)到正常值，奶牛停止

接受抗生素治療。第 9 天檢測牛奶中無抗生素殘留。因此，本試驗將

周期劃分為：第 0 天為用藥前；第 1 天至第 3 天為用藥期；第 4 天至

第 8 天為休藥期；第 9 天至第 15 天為恢復(fù)期（圖 1）。

圖 1 糞便樣品采集時間表，X0、X、Y 和 Z 分別表示第 0 天、用藥期、休藥期和恢復(fù)期

█ MRT 2022 年度報告

﹣208﹣

1.2 PCR 擴增

16S rDNA 的 V3-V4 區(qū)（94℃ 3min，然后 94℃ 30 s，45℃ 20 s，

65℃ 30 s， 35 個循環(huán)）使用引物： 341F： CCTACGGGNGGCWGCAG；

805R：GACTACHVGGGTATCTAATCC。

用 30 μL 混合物進行三次重復(fù) PCR 反應(yīng)，該混合物含有 15 μL

2×Hieff? Robust PCR Master Mix、1 μL 上下游引物（10 μM）、10-

20 ng 模板 DNA，其余用水補足。

1.3 耐藥基因的定量檢測

使用 qPCR 評估了 20 個抗生素耐藥基因的數(shù)量，包括 β-內(nèi)酰

胺類（cfxA、blaROB、blaCMY、mecA、blaCTX-M、bla1 和 blaTEM）、

氨基糖苷類（strA 和 strB）、大環(huán)內(nèi)酯類 [erm（A） 和 erm（B）]、

磺胺類（sul1 和 sul2）、四環(huán)素類 [tet（A）、tet （B）、tet（C）、

tet（Q） 和 tet（H）] 和萬古霉素類（vanC 和 vanG）。這些基因轉(zhuǎn)

換為 16S rRNA 基因的比例，也可以通過 qPCR 進行量化。使用 357-

F: 5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3' 和 518-R: 5'-

ATTACCGCGGCTGCCTGG-3' 引物擴增 16S rRNA 基因，這些引物

也用于生成 16s rRNA 基因庫。

2 試驗結(jié)果

α-多樣性通過豐富度（Chao 1）和多樣性指數(shù)（Shannon 和

Simpson）來衡量。在糞便中，頭孢菌素處理顯著降低了 Shannon 指

數(shù)和 Chao 1 指數(shù)所代表的微生物多樣性和豐富度（p<0.05）（圖 2）。

糞便樣本中最豐富的種類在科水平上的分布如圖 3 所示。從科水平上

二、研究進展 █

﹣209﹣

看，糞便中總共檢測到 50 個分類群。瘤胃球菌科、毛螺旋菌科、雙

歧桿菌科和卟啉單胞菌科是四個最豐富的科（圖 3），在休藥期后瘤

胃球菌科和毛螺旋菌科豐度有所增加。

圖 2 不同時期的α多樣性

圖 3 不同時期糞便樣品科水平上微生物群的組成

為了獲得進一步的了解，使用 Vegan R 軟件包分析了糞便樣本中

屬水平的統(tǒng)計差異。在屬水平上，雙歧桿菌、孢子桿菌、擬桿菌、梭

菌屬、羅姆布茨菌屬和瘤胃球菌屬是糞便樣本的主要細菌屬（圖 4a）。

雙歧桿菌屬屬于放線桿菌門；孢子桿菌、梭菌屬、羅姆布茨菌屬和瘤

胃球菌屬于厚壁菌門；擬桿菌屬于擬桿菌門（圖 4a）。當(dāng)使用抗生素

時，羅氏菌屬更為豐富。擬桿菌屬、擬桿菌科、擬桿菌目和擬桿菌綱

的相對豐度隨著頭孢菌素的使用而增加，梭菌屬、梭菌目、產(chǎn)乙醇桿

菌屬和梭狀芽孢桿菌Ⅳ的相對豐度降低（圖 4b）。在休藥期，糞便中

█ MRT 2022 年度報告

﹣210﹣

的梭狀芽孢桿菌 XI、消化鏈球菌科、疣微菌目、疣微菌屬、疣微菌門、

阿克曼氏菌、疣毛菌科的相對豐度在糞便樣品中增加（圖 4b）。

圖 4 不同時期糞便中細菌屬豐度的變化

二、研究進展 █

﹣211﹣

對來自四個不同采樣周期的糞便樣品中的 20 個抗生素耐藥基因

的比例進行定量檢測，頭孢噻呋和頭孢喹肟在休藥期顯著增加了 β-內(nèi)

酰胺耐藥基因（blaTEM 和 cfxA）的相對豐度（p<0.05）（圖 5）。其

他耐藥基因不受抗生素治療的影響（數(shù)據(jù)未顯示）。

圖 5 糞便中耐藥基因的變化

這項研究提供了受頭孢菌素影響的奶牛糞便微生物群和耐藥基

因的概況。隨著頭孢菌素的使用，細菌群落的豐富度和多樣性顯著降

低。然而，β-內(nèi)酰胺基因 blaTEM 和 cfxA 的相對豐度在休藥期有所提

高。

研究成果已發(fā)表在《Antibiotics》雜志。董蕾和孟璐為共同第一作

者，王加啟研究員和鄭楠研究員為通訊作者。

（撰稿人：孟璐）

——DONG LEI, MENG LU, LIU HUIMIN, WU HAOMING,

SCHROYEN MARTINE, ZHENG NAN, WANG JIAQI. Effect of

Cephalosporin Treatment on the Microbiota and Antibiotic Resistance

Genes in Feces of Dairy Cows with Clinical Mastitis.

Antibiotics. 2022, 11(1):117.

█ MRT 2022 年度報告

﹣212﹣

13. 從中國不同地區(qū)的生乳中分離出的金黃色葡萄球菌的耐

藥性和分子特征

1 研究背景

金黃色葡萄球菌（S. aureus）是奶牛乳腺炎的主要病原菌之一，

會使產(chǎn)奶量減少并降低生乳品質(zhì)而導(dǎo)致經(jīng)濟損失。在中國，被金黃色

葡萄球菌污染的生乳具有很高的潛在危害，應(yīng)對不同生乳樣品中的金

黃色葡萄球菌進行風(fēng)險評估。金黃色葡萄球菌感染與毒力因子的表達

有關(guān)。許多潛在的毒力因子，例如酶和外毒素，是金黃色葡萄球菌相

關(guān)疾病的主要原因之一。金黃色葡萄球菌可以攜帶編碼腸毒素、腸毒

素樣剝脫性毒素、中毒性休克綜合征毒素-1 (TSST-1) 和殺白細胞素

(PVL) 的不同毒力基因。耐熱葡萄球菌腸毒素通常在巴氏殺菌處理后

保留其生物活性。所以也有必要進行有效的篩選以檢測不同生乳中的

毒力基因。

此外，金黃色葡萄球菌經(jīng)常對抗生素產(chǎn)生耐藥性，因為它會產(chǎn)生

胞外多糖，從而對幾種抗生素的細菌細胞滲透形成屏障。并且可以在

質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子上攜帶各種耐藥基因，對許多其他抗生素產(chǎn)生獲得性耐

藥。所以，監(jiān)測來自不同生乳中的金黃色葡萄球菌的抗生素耐藥性，

以預(yù)測金黃色葡萄球菌的抗生素耐藥性風(fēng)險變得尤為重要。因此，本

二、研究進展 █

﹣213﹣

工作旨在確定在中國山羊、水牛、駱駝和牦牛奶樣品中分離出的金黃

色葡萄球菌的流行率、耐藥特性和關(guān)鍵毒力基因。

2 試驗方法

a) 樣品采集

2016 年 4 月至 6 月，從中國 125 個牧場共采集 125 個生乳樣品，

其中陜西省 25 個羊奶樣品、山東省 25 個羊奶樣品、新疆維吾爾自治

區(qū) 25 個駱駝奶樣品、廣西壯族自治區(qū) 25 個水牛奶樣品和四川省 25

個牦牛奶樣品。所有樣品均從健康奶牛身上通過機械擠奶方式采集。

生乳樣品轉(zhuǎn)移到無菌瓶中，立即在 4℃條件下運送到實驗室進行細菌

學(xué)分析。

b) 金黃色葡萄球菌的分離和鑒定

將每個樣品在無菌蛋白胨水中稀釋 10 倍并均質(zhì)化。將等分試樣

（1 mL）置于添加了 5%蛋黃和亞碲酸鹽的 Baird-Parker 瓊脂上。將

培養(yǎng)皿在 37℃下培養(yǎng) 24-48 小時。具有典型黑色外觀并被清晰區(qū)域包

圍的菌落被鑒定為金黃色葡萄球菌。

通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測金黃色葡萄球菌特異性基因 nuc，

使用 InstaGene Matrix DNA 提取試劑盒提取菌株的 DNA。所有 PCR

分析都包括陰性對照（無 DNA 模板）和陽性對照（金黃色葡萄球菌

ATCC 6538）。鑒定后，每個樣品隨機選擇一到三個菌落進行后續(xù)分

析。所有菌株在-80℃下與無菌磁珠一起儲存，直到進一步分析。

█ MRT 2022 年度報告

﹣214﹣

c) 抗生素耐藥性篩查

根據(jù)臨床和實驗室標準協(xié)會（CLSI）規(guī)定，采用紙片擴散法測定

金黃色葡萄球菌的抗生素耐藥性。根據(jù)我國奶牛乳房炎抗生素治療頻

率，藥敏試驗使用的抗生素藥品包括 13 種：青霉素 G（10 U）、阿

莫西林-克拉維酸（20/10 μg）、四環(huán)素（30 μg）、慶大霉素（10 μg)、

苯唑西林(1 μg)、鏈霉素(10 μg)、頭孢西丁(30 μg)、紅霉素(15 μg)、氨

芐青霉素(10 μg)、氯霉素(30 μg)、卡那霉素(30 μg)、克林霉素(2 μg)和

甲氧芐啶-磺胺甲惡唑（1.25/23.75 μg）。金黃色葡萄球菌 ATCC 6538

和大腸桿菌 ATCC 25922 用作質(zhì)量控制。所有試驗重復(fù)兩次。

d) 抗生素耐藥基因檢測

通過 PCR 擴增篩選所有耐藥菌株的抗生素耐藥基因。包括青霉

素（blaZ 和 mecA）、頭孢西丁（cfxA 和 mecA）、氨基糖苷類 [aac6'-

aph2\"、ant(6)-Ia、ant(4')-Ia]、氯霉素（fexA 和 catA）、四環(huán)素 [ tet(K)、

tet(L)、tet(M)和 tet(O)]、紅霉素 [erm(A)、erm(B)、erm(C)、msr(A)和

msr(B)]、鏈霉素[ant(6)-Ia]和苯唑西林(mecA)耐藥基因通過 PCR 檢

測。PCR 產(chǎn)物在 1.5% (m/v) 瓊脂糖凝膠 (Hydragene)中用 SYBR Safe

DNA Stain (Invitrogen) 進行電泳。

e) 毒力基因檢測

用 PCR 方法檢測編碼葡萄球菌腸毒素（sea、seb、sec、sed、see、

seg、seh、sei、sek、sel、ser、ses、sej 和 set）、類腸毒素（selm、selo、

二、研究進展 █

﹣215﹣

selp 和 selu）的基因、中毒性休克綜合征毒素 (tst-1)、剝脫性毒素基

因 (eta 和 etb) 和 Panton-Valentine 殺白細胞素 (pvl)。

3 結(jié)果

通過紙片擴散法測試了 36 株金黃色葡萄球菌對 13 種抗生素的

耐藥性。共有 26 株(26/36, 72.2%)對抗生素產(chǎn)生耐藥性。19 株(19/36,

52.8%) 對至少三種抗生素表現(xiàn)出耐藥性。此外，4 株（4/36, 11.1%）

對 7 種抗生素耐藥，1 株（1/36, 2.8%）對 9 種抗生素耐藥（圖 1）。

圖 1 26 株金黃色葡萄球菌的耐藥性特征，菌株表現(xiàn)出耐藥性的抗生素數(shù)量分布

最常見的耐藥性是青霉素 G (18/36, 50%)，其次是四環(huán)素 (15/36,

41.7%)、慶大霉素(13/36, 36.1%)、氨芐青霉素(12/36, 33.3%)、紅霉素

(9/36, 25%)、頭孢西丁(8/36, 22.2%)、鏈霉素(8/36, 22.2%)、卡那霉素

(7/36, 19.4%)、氯霉素(6/36, 16.7%)、苯唑西林(6/36, 16.7%)、磺胺甲

惡唑-甲氧芐啶 (3/36, 8.3%)、克林霉素 (1/36, 2.8%)和阿莫西林-克拉

█ MRT 2022 年度報告

﹣216﹣

維酸 (0/36, 0)（表 1）。此外，從山羊中分離出的六株菌株被鑒定為

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）。只有一株從山羊奶中分離出

來的金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出對克林霉素的耐藥性。牦牛奶樣品中未分

離出耐磺胺甲惡唑、甲氧芐啶、卡那霉素和鏈霉素耐藥菌株，牦牛和

駱駝奶樣品中未分離出耐氯霉素菌株。26 株耐藥菌株中，96.2%的菌

株（25/26）攜帶至少 1 個耐藥基因（圖 2）。

表 1 從不同生乳中分離出的金黃色葡萄球菌菌株的抗生素耐藥性

圖 2 26 株金黃色葡萄球菌菌株所攜帶的抗生素耐藥基因數(shù)量的分布

二、研究進展 █

﹣217﹣

最主要的耐藥基因是 blaZ (18/26, 69.2%), aac6′-aph2″ (13/26,

50.0%), tet(M) (10/26, 38.5%), tet(L) (7/ 26, 26.9%), mecA (6/26, 23.1%),

erm(C) (6/26, 23.1%), ant(4')-Ia (6/26, 23.1%), cfxA (6/26 , 23.1%), msr(B)

(4/26, 15.4%), erm(B) (3/26, 11.5%), tet(K) (2/26, 7.7%), fexA (2/26,

7.7%), tet(O) (1/26, 3.9%)和 ant(6)-Ia (1/26, 3.9%)。在金黃色葡萄球菌

中未檢測到 catA, erm(A)和 msr(A)基因（表 2）。

表 2 在來自不同生乳中的金黃色葡萄球菌中鑒定出的抗生素耐藥基因

此外，所有耐青霉素 G 的金黃色葡萄球菌均攜帶 blaZ 基因，所

有耐苯唑西林的金黃色葡萄球菌均攜帶 mecA 基因。氨基糖苷類耐藥

菌株（n = 17）含有一個或多個耐藥基因，四環(huán)素耐藥菌株（n = 15）

含有一種或多種耐藥基因，紅霉素耐藥菌株 (n = 9) 含有一個或多個

基因，在紅霉素耐藥菌株中未檢測到 erm(A)基因。msr(B)基因與 erm(B)

和 erm(C)一起在同一菌株中被檢測到（表 3）。

█ MRT 2022 年度報告

﹣218﹣

表 3 耐藥金黃色葡萄球菌耐藥基因的分布

主要檢出的毒力因子是 sec（8/26, 30.8%），42.3%的菌株（11/26）

攜帶至少一種毒力基因。26 株金黃色葡萄球菌中，羊奶中 6 株攜帶

17 個毒力基因，水牛奶中 1 株攜帶 1 個，駱駝奶 2 株攜帶 3 個，牦

牛奶 2 株攜帶 2 個（表 4）。

表 4 從不同生乳樣品中分離出的金黃色葡萄球菌菌株中鑒定出的毒力基因 (n = 26)

二、研究進展 █

﹣219﹣

4 結(jié)論

本研究對中國山羊、水牛、駱駝和牦牛奶中金黃色葡萄球菌的抗

生素耐藥性和毒力基因進行了評估。我們的數(shù)據(jù)表明，在不同的生乳

中，尤其是山羊奶，金黃色葡萄球菌具有很高的抗生素耐藥性并攜帶

多種毒力基因。盡管來自中國的生乳中 MRSA 的流行率很低，但

MRSA 可能對生乳或用生乳制成的乳制品的消費者以及與動物密切

接觸或工作的人構(gòu)成潛在威脅。因此，監(jiān)測抗生素藥物的使用和山羊

奶中抗生素藥物耐藥基因的潛在轉(zhuǎn)移非常重要。

研究成果已在《Frontiers in Microbiology》雜志上發(fā)表。劉慧敏博

士、董蕾和趙艷坤博士為共同第一作者，鄭楠研究員為通訊作者。該

研究為中國不同地區(qū)的生乳中的金黃色葡萄球菌的耐藥性研究提供

了很好的理論依據(jù)。

（撰稿人：劉慧敏，校稿人：董蕾）

——LIU HUIMIN, DONG LEI, ZHAO YANKUN, MENG LU,

WANG JIAQI, WANG CHENG, ZHENG NAN. Antimicrobial

Susceptibility, and Molecular Characterization of Staphylococcus

aureus Isolated From Different Raw Milk Samples in China.

Frontiers in Microbiology. 2022,13;13:840670.

█ MRT 2022 年度報告

﹣220﹣

14. 牧場墊料材料對生乳微生物結(jié)構(gòu)與耐藥基因的影響

家畜糞便是致病微生物和抗生素耐藥基因（ARG）的重要污染源，

有研究發(fā)現(xiàn)，在糞便中能夠檢測到多種耐藥基因，包括四環(huán)素、磺酰

胺、泰樂菌素、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類、萬古霉素和大環(huán)內(nèi)酯-林可

霉素-鏈霉素 B 等耐藥基因。有氧堆肥可以控制糞便中的致病微生物

和耐藥微生物污染。盡管有氧堆肥是降低動物糞便中抗生素和耐藥基

因含量的有效方法，但堆肥糞便中耐藥基因的風(fēng)險仍然存在。牧場墊

料中的微生物對生乳中細菌和耐藥的影響尚不清楚。

隨著奶牛場數(shù)量的增加，大型牧場和奶牛養(yǎng)殖合作社的數(shù)量也在

增加，因此，糞便產(chǎn)生的污染也大大增加。糞便污染不僅為蚊蟲繁殖

和傳播疾病提供了條件，同時還會污染空氣、土壤和水源。合理地處

理牛糞，保護環(huán)境已成為畜牧業(yè)研究的重要課題。其中，牛糞中大量

存在的微生物對原料奶微生物的影響是牛糞墊料加工技術(shù)推廣和應(yīng)

用的主要限制因素。亟待研究牛糞墊料對原料奶微生物群落結(jié)構(gòu)和安

全性的影響。本研究旨在分析不同墊料材料對牛奶微生物多樣性的影

響，以及原料奶中的致病微生物和 ARG 的含量。

表 1 總結(jié)了不同樣本中相對豐度高于 1%的細菌菌科。由表 1 可

知，使用不同墊料的牧場牛奶微生物群存在顯著差異。牛糞墊料牧場

牛奶組和沙土墊料牧場牛奶組的 Firmicutes 比例顯著高于稻殼墊料牧

二、研究進展 █

﹣221﹣

場牛奶組（ P=0.001 ）。在這些細菌中， Streptococcaceae 和

Staphylococcaceae 在牛糞墊料牧場牛奶和沙土墊料牧場牛奶中的比

例較高（>10%），Enterococcaceae 在牛糞墊料牧場牛奶組中的比例

較高（>10%）。相反，稻殼墊料牧場牛奶組的 Proteobacteria（>80%）

和 Enterobacteriaceae（>80%）比例最高，遠高于牛糞墊料牧場牛奶

組和沙土墊料牧場牛奶組（P<0.001）。雖然單因素方差分析結(jié)果的 P

值為 0.052，但牛糞墊料牧場牛奶組和沙土墊料牧場牛奶組的

Moraxellaceae 平均比例分別高達 35.0%和 34.2%，而稻殼墊料牧場牛

奶組的平均比例僅為 3.5%。沙土墊料牧場牛奶組 Pseudomonadaceae

平均含量為 16.0%，稻殼墊料牧場牛奶組為 4.9%，牛糞墊料牧場牛奶

組為 1.0%。

表 1. 牛奶與墊料樣本中門和科水平上不同細菌群落結(jié)構(gòu)的相對讀豐度

牛糞(%) 稻殼 (%) 沙土 (%) P-value

牛奶 墊料 牛奶 墊料 牛奶 墊料 牛奶 墊料

p__Firmicutes 53.6 ± 13.1 3.5 ± 2.3 3.1 ± 2.9 13.2 ± 8.2 48.2 ± 10.6 15.6 ± 8.3 0.001 0.155

f__Streptococcaceae 20.9 ± 34.1 0.0 ± 0.0 2.1 ± 3.1 0.2 ± 0.3 35.8 ± 8.1 0.0 ± 0.0 0.207 0.336

f__Enterococcaceae 14.4 ± 24.9 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.8 ± 0.1 0.1 ± 0.0 0.44 0.199

f__Staphylococcaceae 14.4 ± 21.9 0.1 ± 0.1 0.4 ± 0.2 2.8 ± 0.3 11.1 ± 2.9 2.3 ± 2.5 0.43 0.129

f__Clostridiaceae 1.2 ± 1.0 0.6 ± 0.7 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.056 0.165

f__Leuconostocaceae 0.7 ± 0.5 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.061 ND

f__Planococcaceae 0.2 ± 0.2 1.7 ± 1.1 0.2 ± 0.1 1.4 ± 0.8 0.3 ± 0.3 7.9 ± 4.6 0.825 0.048

f__Bacillaceae 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.2 ± 0.0 8.3 ± 7.8 0.1 ± 0.1 4.9 ± 2.3 0.168 0.174

p__Proteobacteria 39.7 ± 14.6 51.6 ± 6.2 95.9 ± 2.8 72.6 ± 9.0 51.2 ± 11.0 74.5 ± 4.7 0.002 0.011

f__Moraxellaceae 35.0 ± 14 16.6 ± 18.5 3.5 ± 2.4 61.9 ± 9 34.2 ± 19.2 66.5 ± 7.6 0.052 0.005

f__Enterobacteriaceae 1.4 ± 1.3 0.0 ± 0.0 86.8 ± 6.5 2.6 ± 0.4 0.9 ± 0.2 6.6 ± 4.8 <0.001 0.073

f__Brucellaceae 1.0 ± 1.7 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.1 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.397 <0.001

f__Pseudomonadaceae 1.0 ± 0.8 4.2 ± 1.1 4.9 ± 7.3 0.6 ± 0.1 16 ± 25.1 0.1 ± 0.0 0.491 <0.001

f__Halomonadaceae 0.5 ± 0.4 0.5 ± 0.8 0.1 ± 0.2 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.151 0.356

f__Hyphomicrobiaceae 0.1 ± 0.1 1.9 ± 1.2 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.110 0.024

f__Rhizobiaceae 0.1 ± 0.1 0.9 ± 0.3 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.118 <0.001

f__Xanthomonadaceae 0.1 ± 0.1 7.1 ± 1.4 0.1 ± 0 1.6 ± 0.4 0.1 ± 0.1 0.0 ± 0.0 0.837 <0.001

f__Phyllobacteriaceae 0.0 ± 0.1 5.0 ± 3.1 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.1 ± 0.0 0.422 0.024

f__Comamonadaceae 0.0 ± 0.0 0.2 ± 0.4 0.0 ± 0.0 3.4 ± 0.6 0.0 ± 0.0 0.8 ± 1.1 0.132 0.005

f__Alteromonadaceae 0.0 ± 0.0 3.3 ± 2.5 0.0 ± 0.0 0.1 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.623 0.048

█ MRT 2022 年度報告

﹣222﹣

f__Erythrobacteraceae 0.0 ± 0.0 2.5 ± 0.5 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 ND <0.001

f__Alcaligenaceae 0.0 ± 0.0 2.6 ± 1.8 0.0 ± 0.0 1.4 ± 1.4 0.0 ± 0.0 0.2 ± 0.4 ND 0.17

p__Actinobacteria 1.8 ± 2.3 5.7 ± 1.4 0.4 ± 0.7 8.3 ± 1.7 0.0 ± 0.0 9.3 ± 4.1 0.318 0.316

f__Corynebacteriaceae 1.2 ± 1.8 0.3 ± 0.3 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.349 0.064

f__Micrococcaceae 0.2 ± 0.4 0.2 ± 0.1 0.0 ± 0.0 7.4 ± 1.5 0.0 ± 0.0 9.1 ± 4.1 0.427 0.011

f__Intrasporangiaceae 0.1 ± 0.1 1.9 ± 0.8 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.245 0.003

p__Bacteroidetes 1.3 ± 1.4 28.5 ± 2.7 0.2 ± 0.2 5.8 ± 3.0 0.4 ± 0.3 0.4 ± 0.6 0.285 <0.001

f__Flavobacteriaceae 0.8 ± 1.1 11.0 ± 8.2 0.1 ± 0.1 2.4 ± 1.4 0.0 ± 0.0 0.2 ± 0.2 0.356 0.072

f__Porphyromonadaceae 0.2 ± 0.3 1.5 ± 1.9 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.286 0.21

f__Weeksellaceae 0.2 ± 0.1 1.9 ± 0.5 0.0 ± 0.0 0.4 ± 0.5 0.3 ± 0.3 0.0 ± 0.0 0.242 0.003

f__Saprospiraceae 0.1 ± 0.1 3.0 ± 1.3 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.239 0.004

f__Marinilabiaceae 0.1 ± 0.1 1.0 ± 1.4 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.422 0.309

f__Cyclobacteriaceae 0.0 ± 0.0 1.5 ± 0.7 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.422 0.007

f__Flammeovirgaceae 0.0 ± 0.0 1.1 ± 0.7 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.422 0.024

f__Sphingobacteriaceae 0.0 ± 0.0 3.6 ± 2.0 0.0 ± 0.0 3.0 ± 1.2 0.0 ± 0.0 0.2 ± 0.3 0.422 0.044

f__Chitinophagaceae 0.0 ± 0.0 1.1 ± 0.8 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 ND 0.049

p__Cyanobacteria 2.0 ± 1.5 0.1 ± 0.1 0.1 ± 0.1 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.053 0.150

p__Tenericutes 1.2 ± 1.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.079 ND

f__Mycoplasmataceae 1.2 ± 1.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.079 ND

p__Verrucomicrobia 0.0 ± 0.0 0.7 ± 0.5 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.819 0.041

f__Verrucomicrobiaceae 0.0 ± 0.0 0.6 ± 0.5 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.722 0.076

p__Thermi 0.0 ± 0.0 0.9 ± 0.6 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.080 0.024

f__Trueperaceae 0.0 ± 0.0 0.9 ± 0.6 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.080 0.024

p__Planctomycetes 0.0 ± 0.0 2.4 ± 1.3 0.2 ± 0.2 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.1 0.500 0.011

f__Planctomycetaceae 0.0 ± 0.0 0.8 ± 0.5 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.407 0.032

f__Pirellulaceae 0.0 ± 0.0 1.5 ± 0.7 0.1 ± 0.2 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.516 0.004

p__Chloroflexi 0.0 ± 0.0 3.3 ± 2.5 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.1 0.195 0.055

f__SHA 0.0 ± 0.0 0.8 ± 0.6 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 ND 5.693

p__Gemmatimonadetes 0.0 ± 0.0 2.1 ± 0.6 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.111 0.001

表 2 總結(jié)了牛奶中致病微生物的 qPCR 結(jié)果。采集使用不同墊料

牧場的原料奶，連續(xù) 3 天分別采集早、中、晚奶罐原料奶，并將同一

天的原料奶樣本混合在一起。在環(huán)境致病微生物方面，發(fā)現(xiàn) 1/3 的牛

糞墊料牧場牛奶樣本的 Enterococcus spp（+++）強陽性結(jié)果、

Streptococcus dysgalatiae（+++）陽性結(jié)果和 yeast（+）弱陽性結(jié)果。

在 1/3 的 RH-M 樣本中檢測到 Escherichia coli 弱陽性結(jié)果（+）。接

觸性致病微生物的 qPCR 顯示，所有牛糞墊料牧場牛奶樣本中均發(fā)現(xiàn)

Staphylococcus spp.，而 Mycoplasma bovis 在 2/3 牛糞墊料牧場牛奶樣

本中呈弱陽性（+）。在 1/3 的 RH-M 樣本中檢測到 Mycoplasma spp.

二、研究進展 █

﹣223﹣

和 Mycoplasma bovis 陽性（+）。在所有牛奶樣本中檢測到β-內(nèi)酰胺

酶基因呈弱陽性（+）。在 S-M 樣本中未檢測到環(huán)境致病微生物或接

觸性致病微生物。

表 2 QPCR 檢測牛奶樣品中的乳房炎致病微生物

Target Bacteria gene

牛糞墊料 稻殼墊料 沙土墊料

M1 M2 M3 M1 M2 M3 M1 M2 M3

環(huán)境致病微生物

Enterococcus spp. (Ensp) +++ - - - - - - - -

Escherichia coli (Ec) - - - - + - - - -

Klebsiella spp (klsp) - - - - - - - - -

Prototheca spp (Psp) - - - - - - - - -

Streptococcus uberis (Sub) - - - - - - - - -

Serratia marcescens (Sm) - - - - - - - - -

Streptococcus dysgalactiae (Sdy) ++ - - - - - - - -

Trueperella pyogenes (Tpy) - - - - - - - - -

Yeast (Yea) + - - - - - - - -

接觸性致病微生物

Mycoplasma spp. (Mysp) - - - - - ++ - - -

Mycoplasma bovis (Myb) - + + - - ++ - - -

Corynebacterium bovis (Cb) - - - - - - - - -

Staphylococcus spp (Stsp) + + + - - - - - -

Staphylococcus aureus (Sau) - - - - - - - - -

Streptococcus agalactiae (Sag) - - - - - - - - -

其它致病微生物

β-lactamase resistance gene (Lac) + + + + + + + + +

檢測并分析了針對七種藥物的 33 個 ARG（圖 1）。所有牛奶樣

本中針對氨基糖苷類的 ARG 比例均低于 0.5%且組間無顯著差異

（P>0.05）。牛奶樣品中靶向多粘菌素的 mcr-1 基因的含量也低于

0.5%，但沙土墊料牧場牛奶組的比例高于牛糞墊料牧場牛奶組

（P<0.05）。同樣，沙土墊料牧場牛奶組靶向β-內(nèi)酰胺酶、MLSB、

磺胺類、四環(huán)素類和萬古霉素的 ARGs 基因比例高于牛糞墊料牧場牛

█ MRT 2022 年度報告

﹣224﹣

奶組（P<0.05）。沙土墊料牧場牛奶也有 ARG，包括靶向β-內(nèi)酰胺

酶（mecA 和 blaRoB）、MLSB（emrA-2 和 emrB-1）、磺胺類藥物

（sul2）、四環(huán)素類藥物（tetW-1 和 tetW-2）和萬古霉素（vanC-2）

的 ARG，沙土墊料牧場牛奶的 ARG 多于稻殼墊料牧場牛奶組

（P<0.05）。稻殼墊料牧場牛奶組的 mlsb（ermB-2）和四環(huán)素（tetB2 和 tetW-1）的比例也顯著高于牛糞墊料牧場牛奶組（P<0.05）。

圖 1 不同墊料材料牧場生乳中耐藥基因比例。數(shù)據(jù)描述使用 mean ± SD. * P < 0.05; **

P < 0.01; ***P ≤ 0.001。

本文通過 Spearman 分析總結(jié)了牛奶和墊料材料中微生物的比例

的相關(guān)性，并將其轉(zhuǎn)化為熱圖（圖 2）。牛奶樣本中的 Streptococcaceae、

Staphylococcaceae 、 Enterococcaceae 、 Enterobacteriaceae 和

Moraxellaceae 含量較高（比例>0.05%），但與其與墊料材料樣本中的

二、研究進展 █

﹣225﹣

含量無顯著相關(guān)性。僅在牛糞墊料牧場牛奶組和牛糞墊料組（比

例>0.05%）中發(fā)現(xiàn) Tenericutes 和 Thermophiles，牛奶與墊料材料樣

品中的相同菌門呈正相關(guān)（P<0.05）。Clostridiaceae、Halomonadaceae、

Intraporangiaceae 、 Porphyromonadaceae 、 Saprospiraceae 、

Marinilabiaceae 和 Trueperaceae 僅見于牛糞墊料牧場牛奶和牛糞墊

料組（比例>0.05%），且這些科在墊料材料樣品中的比例與牛奶中相

同菌科呈正相關(guān)（P<0.05）。此外，Bacillaceae 僅在稻殼墊料（8.3%

±7.8%）和沙土墊料組（4.9%±2.3%）中檢測到，并且在同一牧場的

牛奶樣本中檢測到。牛奶樣本和墊料材料樣本中的 Bacillaceae 存在

呈正相關(guān)（P<0.05）。

圖 2 墊料和生乳細菌在門和科水平的 Spearman 相關(guān)分析；紅色方塊：正相關(guān)；藍色

方塊：負相關(guān)；* P < 0.05; ** P < 0.01; ***P ≤ 0.001。

█ MRT 2022 年度報告

﹣226﹣

接下來，本文通過典型對應(yīng)分析（CCA）分析了不同墊料材料環(huán)

境下牛奶中主要微生物群之間的聚類關(guān)系。同時，通過 Spearman 相

關(guān)分析分析了牛奶中主要微生物群與 ARGs 含量之間的關(guān)系（圖 3）。

CCA 結(jié)果表明，由于 Enterobacteriaceae 的比例較高，稻殼墊料牧場

牛奶組的微生物群與其他兩組的相似性較低。從相關(guān)分析的熱圖可以

看出，牛奶樣本中的 Enterococcaceae 與針對 MLSB 的 ARG（ermb1）呈正相關(guān)（P<0.05）。此外，Pseudomonadaceae 的比例與靶向內(nèi)

酰胺酶和萬古霉素（vanc-3）的 ARGs（cfxa）呈正相關(guān)（P<0.05），

Staphylococcaceae 的存在與靶向四環(huán)素的 ARGs 呈正相關(guān)（P<0.01）。

Cyanobacteria 和 Tenericutes 與多種耐藥基因呈顯著負相關(guān)。

Cyanobacteria 和 Tenericutes僅在牛糞墊料材料中檢測到（比例>1%），

這些菌門在墊料材料中的比例與牛奶中的比例呈正相關(guān)。

二、研究進展 █

﹣227﹣

圖 3 牛奶中耐藥基因和菌群的聯(lián)合分析。a 牛奶中耐藥基因和細菌菌科多樣性的典型

對應(yīng)分析（CCA）；b ARGs 與乳細菌在門和科水平上的 Spearman 相關(guān)分析。紅色方塊：

正相關(guān)；藍色方塊：負相關(guān)。

本研究比較了牛糞墊料、沙土墊料和稻殼墊料對生乳微生物組成

的影響，發(fā)現(xiàn)不同墊料材料環(huán)境下的牛奶微生物組成存在顯著差異。

在牛糞墊料材料和稻殼墊料材料上飼養(yǎng)的奶牛的牛奶中發(fā)現(xiàn)了與乳

房炎有關(guān)的病原菌，但牛糞墊料材料上飼養(yǎng)的奶牛的牛奶中的 ARG

顯著低于沙土墊料組。這些發(fā)現(xiàn)表明，盡管牛糞墊料材料可能會導(dǎo)致

牛奶中的致病微生物受到污染，但它們可能在減少牛奶中 ARG 的存

在方面發(fā)揮積極作用，從而保護消費者的健康。

研究成果已于 2022 年 2 月發(fā)表在《Frontiers in microbiology》雜

志。該成果由中國博士后特別資助項目、國家重點研發(fā)計劃、中國農(nóng)

業(yè)科學(xué)院重大任務(wù)和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系等項目資助，吳浩銘為文

章第一作者，王加啟與鄭楠為文章通訊作者。

（撰稿人：吳浩銘，校稿人：姚倩倩）

— — WU HAOMING, WANG YANG, DU BINGYAO, LI

HUIYING, DONG LEI, HU HAIYAN, MENG LU, ZHENG NAN,

WANG JIAQI. Influence of dairy cows bedding material on the microbial

structure and antibiotic resistance genes of milk.

Frontiers in microbiology. 2022, 25;13:830333.

█ MRT 2022 年度報告

﹣228﹣

二、研究進展 █

﹣229﹣

15. 基于 16S rDNA 基因測序的 Source Tracker 模型評估巴

氏殺菌乳中微生物風(fēng)險關(guān)鍵點分析

牛奶富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，比如脂肪、蛋白質(zhì)和生物活性物質(zhì)等，

對人體健康發(fā)揮著重要的作用，但也是微生物良好的培養(yǎng)基，微生物

可能會從生產(chǎn)到消費過程的任何階段污染牛奶。機體攝入被致病微生

物污染的牛奶后可能會引發(fā)腹瀉、嘔吐、惡心、發(fā)燒等癥狀，嚴重的

會出現(xiàn)敗血癥和腦膜炎等，甚至死亡。

溯源分析或確定產(chǎn)業(yè)鏈中特定物質(zhì)的來源已廣泛應(yīng)用于微生物

研究。因此本研究的目的是利用基于 16S rDNA 基因測序的 Source

Tracker 模型評估巴氏殺菌乳中微生物的來源，并分析不同的巴氏殺

菌溫度和各加工階段對生乳中微生物的影響。

微生物組成分析表明運輸車生乳、儲存罐生乳、投料罐生乳、平

衡缸生乳、待裝罐樣品和巴氏殺菌乳成品樣品中門水平上主要是厚壁

菌門和變形菌門，設(shè)備沖洗水和空氣樣品中存在的 OTU 數(shù)量最多，

其中擬桿菌門，厚壁菌門和變形菌門是門水平上主要的微生物。

與生乳樣品相比，巴氏殺菌乳樣品中厚壁菌門的相對豐度逐漸下

降，而擬桿菌門幾乎消失，但厚壁菌門和變形菌門仍是門水平上主要

的微生物。此外，設(shè)備沖洗水和空氣樣品中擬桿菌門的相對豐度顯著

高于其他樣品（圖 1A）。在屬水平上不動桿菌、巨球菌、假單胞菌

和乳球菌是運輸車生乳、儲存罐生乳、投料罐生乳和平衡缸生乳樣品

█ MRT 2022 年度報告

﹣230﹣

中主要的微生物，不動桿菌是巴氏殺菌乳樣品中含量最高的微生物，

寡養(yǎng)假單胞菌和不動桿菌分別是設(shè)備沖洗水和空氣樣品中最豐富的

微生物，在設(shè)備沖洗水樣品中寡養(yǎng)假單胞菌的相對豐度顯著高于其他

微生物，但不動桿菌的相對豐度較低（圖 1B）。

圖 1 不同樣品在（A）門和（B）屬水平上的相對豐度。M1：加工廠罐車（生乳），

M2：儲奶罐（生乳），M3：投料罐（生乳），M4：平衡缸生乳（72 /15 ℃ 秒），M5：平

衡缸生乳（75 / 15 s ℃ ），M6：平衡缸生乳（80 /15 ℃ 秒），M7：待裝罐樣品（72 /15 ℃

s），M8：待裝罐樣品（75 /15 s ℃ ），M9：待裝罐樣品（80 /15 s ℃ ），M10：巴氏殺菌乳

（72 /15 s ℃ ），M11：巴氏殺菌乳（75 /15 s ℃ ），M12：巴氏殺菌乳（80 /15s ℃ ），W：設(shè)

備沖洗水，A：乳品加工廠空氣。

主坐標典型相關(guān)性分析揭示了微生物（相對豐度排名前 10）與運

輸車生乳、儲存罐生乳、投料罐生乳、平衡缸生乳、待裝罐樣品、巴

氏殺菌乳成品、設(shè)備沖洗水和乳品加工廠空氣的關(guān)系（圖 2），皮爾

遜相關(guān)性系數(shù)> 0.7 的分類單元作為向量覆蓋在圖上，被灰線包圍的

二、研究進展 █

﹣231﹣

樣品被認為在同一組中（相似度為 70%），結(jié)果顯示設(shè)備沖洗水與寡

養(yǎng)假單胞菌的相關(guān)性較高。

圖 2 主坐標典型相關(guān)性分析（CAP）說明了不同樣品中 10 個主要的屬與樣品的相關(guān)

性。縮寫參考圖 1。

Source Tracker 模型用于識別巴氏殺菌乳樣品中微生物的可能來

源，將每個單獨的樣品（運輸車生乳、儲存罐生乳、投料罐生乳、平

衡缸生乳、待裝罐樣品、設(shè)備沖洗水和乳品加工廠空氣）視為其他已

知或未知的環(huán)境來源（圖 3），分析發(fā)現(xiàn)巴氏殺菌乳樣品中的微生物

與待裝罐樣品顯著相關(guān)。

圖 3 Source Tracker 模型結(jié)果顯示了巴氏殺菌乳樣品中推斷的各微生物污染源的百分

比。縮寫參考圖 1。

█ MRT 2022 年度報告

﹣232﹣

在這項研究中，利用基于 16S rDNA 基因測序的 Source Tracker

模型評估巴氏殺菌乳中微生物的來源，并分析不同的巴氏殺菌溫度和

各加工階段對生乳微生物的影響。盡管生乳和巴氏殺菌乳樣品中微生

物多樣性的均勻度和覆蓋率相似，但我們觀察到生乳與空氣和設(shè)備沖

洗水樣品中微生物的豐度存在顯著差異。Source Tracker 模型分析表

明，巴氏殺菌乳中的微生物與待裝罐有顯著相關(guān)性。正常的巴氏殺菌

工藝雖然可以殺死致病微生物，但仍不能滿足商業(yè)無菌的要求，因此

存在一定的風(fēng)險。我們的分析可以幫助定位微生物污染的潛在來源，

并為質(zhì)量控制提供指導(dǎo)，以避免食品質(zhì)量問題。

研究成果發(fā)表在《Frontiers in Nutrition》雜志。該研究得到了農(nóng)業(yè)

科技創(chuàng)新項目(ASTIP-IAS12) 和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-36)的

支持。研究生杜兵耀為第一作者，王加啟研究員為通訊作者。

（撰稿人：杜兵耀，校稿人：許文君）

— — DU BINGYAO, MENG LU, WU HAOMING, YANG

HUAIGU, LIU HUIMIN, ZHENG NAN, ZHANG YANGDONG, ZHAO

SHENGGUO, WANG JIAQI. Source Tracker Modeling Based on 16S

rDNA Sequencing and Analysis of Microbial Contamination Sources for

Pasteurized Milk.

Frontiers in Nutrition, 2022(9).

二、研究進展 █

﹣233﹣

16. 我國不同地區(qū)生乳中嗜冷菌的多樣性分析

生乳在擠奶、儲存、運輸和加工過程中可能被微生物污染，由于

生乳中含有豐富的脂肪、蛋白質(zhì)等多種營養(yǎng)成分，會促進微生物快速

生長繁殖。雖然快速冷卻設(shè)備和冷鏈系統(tǒng)在乳品行業(yè)中得到了廣泛的

應(yīng)用，使得生乳在擠出后迅速降溫到 6℃以下，并且在貯存和運輸過

程中保持在 6℃以下，但仍難以防止嗜冷菌的快速生長繁殖。同時，

在大多數(shù)國家和地區(qū)，生乳被運輸?shù)饺槠芳庸S后，在質(zhì)量和安全指

標檢測結(jié)果出來之前會冷藏儲存一段時間再進行加工，這也會引起嗜

冷菌的生長。

嗜冷菌在自然界中分布廣泛，主要分布在空氣、水、土壤、奶牛

乳房、受污染的擠奶設(shè)備和儲奶罐等。低溫儲存為嗜冷菌的生長提供

了理想的條件，嗜冷菌會不斷分泌耐熱蛋白酶和脂肪酶，脂肪酶會引

起牛奶中脂肪的水解，導(dǎo)致酸敗等。蛋白酶引起酪蛋白的水解，產(chǎn)生

異味和凝膠等，從而縮短保質(zhì)期，嚴重影響乳制品的質(zhì)量。

但是，目前中國不同地區(qū)生乳中嗜冷菌的多樣性并不十分清楚，

因此本研究旨在通過傳統(tǒng)培養(yǎng)和 PacBio 單分子實時測序相結(jié)合的方

法分析中國不同地區(qū)生乳中嗜冷菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性，為生乳中的嗜

冷菌的防控提供建議。

█ MRT 2022 年度報告

﹣234﹣

我們通過培養(yǎng)的方法從 8 個省份采集的 25 個生乳樣品中分離出

248 株不同的嗜冷菌菌落，使用 16S rRNA 基因測序鑒定為 21 個屬和

59 個種（表 1），在屬水平上占比較高的是假單胞菌屬、寡養(yǎng)單胞菌

屬（Stenotrophomonas）、腸球菌屬、金黃桿菌屬和沙雷氏菌屬，其中

假單胞菌屬占比高達 58.9% ，在種水平上占比較高的是 P.

azotoformans、P. paralactis、P. lactis、P. marginalis 和 P. helmanticensis，

其中 P. azotoformans 占比高達 16.9%。

表 1 中國不同地區(qū)生乳樣品中嗜冷菌的鑒定及分布

屬（總數(shù)量）

Genera（Total number）

種（數(shù)量）

Specie（Number）

屬（總數(shù)量）

Genera（Total number）

種（數(shù)量）

Specie（Number）

Pseudomonas（146） azotoformans（42） Chryseobacterium（12） hominis（8）

paralactis（19） lactis（2）

lactis（13） cucumeris（1）

marginalis（10） haifense（1）

helmanticensis（9） Serratia（9） marcescens（7）

hibiscicola（8） surfactantfaciens（2）

gessardii（7） Bacillus（8） galactosidilyticus（6）

oryzihabitans（5） licheniformis（1）

mucidolens（4） kochii（1）

lundensis（3） Moraxella（8） osloensis（8）

fluorescens（3） Lactococcus（5） raffinolactis（2）

reinekei（3） lactis（2）

koreensis（3） garvieae（1）

canadensis（3） Rothia（5） endophytica（5）

lurida（3） Comamonas（3） testosteroni（3）

weihenstephanensis（2） Citrobacter（3） freundii（3）

rhodesiae（1） Staphylococcus（3） xylosus（2）

synxantha（1） gallinarum（1）

kilonensis（1） Macrococcus（3） goetzii（2）

coleopterorum（1） caseolyticus（1）

poae（1） Acinetobacter（2） baumannii（2）

fildesensis（1） Enterobacter（1） bugandensis（1）

tolaasii（1） Psychrobacter（1） faecalis（1）

baetica（1） Sporosarcina（1） luteola（1）

orientalis（1） Streptococcus（1） suis（1）

二、研究進展 █

﹣235﹣

Stenotrophomonas（18） maltophilia（9） Kocuria（1） arsenatis（1）

pavanii（6） Galactobacter（1） valiniphilus（1）

rhizophila（3） Pantoea（1） agglomerans（1）

Enterococcus（16） faecalis（12）

pseudoavium（3）

hirae（1）

我們利用構(gòu)建的生乳嗜冷菌菌株數(shù)據(jù)庫與 PacBio 單分子實時測

序結(jié)果結(jié)合，進行生乳中嗜冷菌的多樣性分析，分析表明腸球菌、

Kaistella、Comamonas、假單胞菌、Sporosarcina、Epilithonimonas、

Rothia、寡養(yǎng)單胞菌、Cytobacillus、金黃桿菌、Macrococcus、鏈球菌、

乳球菌、腸桿菌、芽孢桿菌、沙雷氏菌、不動桿菌、莫拉氏菌、

Psychrobacter 和葡萄球菌是樣品中屬水平上排名前 20 的微生物（圖

1），其中 Sporosarcina 是黑龍江生乳中相對豐度最高的嗜冷菌

（23.8%），Comamonas 是湖南生乳樣品中相對豐度最高的嗜冷菌

（18.8%），假單胞菌屬是安徽生乳樣品中相對豐度最高的嗜冷菌

（20.6%），另外假單胞菌屬在黑龍江生乳樣品、內(nèi)蒙古生乳樣品、

甘肅生乳樣品、河南生乳樣品、安徽生乳樣品、江蘇生乳樣品、湖南

生乳樣品和重慶生乳樣品嗜冷菌中的相對豐度分別占 9.0%、3.1%、

7.4%、11.4%、20.6%、11.9%、6.3%和 5.7%。Chryseobacterium haifense、

Comamonas testosteroni 、 Sporosarcina luteola 、屎腸球菌、

Epilithonimonas hominis、Rothia endophytica、Cytobacillus kochii、

Chryseobacterium cucumeris、Enterococcus pseudoavium、Macrococcus

goetzii、豬鏈球菌、Stenotrophomonas maltophilia、Stenotrophomonas

rhizophila 、隆德假單胞菌、 Enterobacter bugandensis 、 Bacillus

licheniformis、粘質(zhì)沙雷氏菌、鮑曼不動桿菌、P. azotoformans 和

█ MRT 2022 年度報告

﹣236﹣

Moraxella osloensis 是樣品中種水平上排名前 20 的微生物（圖 1B），

其中 Sporosarcina luteola 是黑龍江生乳樣品中占比最高的嗜冷菌

（23.8%），Comamonas testosteroni 是河南生乳樣品中相對豐度最高

的嗜冷菌（17.2%），隆德假單胞菌是安徽生乳樣品中相對豐度最高

的嗜冷菌（14.5%）。

圖 1 不同地區(qū)生乳樣品在屬和種水平上的相對豐度。

A：黑龍江生乳樣品，B：內(nèi)蒙古生乳樣品，C：甘肅生乳樣品，D：河南生乳樣品，

E：安徽生乳樣品，F(xiàn)：江蘇生乳樣品，G：重慶生乳樣品，H：湖南生乳樣品。

二、研究進展 █

﹣237﹣

圖 2 不同地區(qū)生乳樣品的主坐標分析（PCoA）?？s寫參考圖 1

我們通過主坐標分析探討了不同地區(qū)生乳樣品中嗜冷菌群落結(jié)

構(gòu)的相關(guān)性（圖 2）。不同地區(qū)生乳樣品中嗜冷菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著

（P =0.001），而黑龍江生乳樣品和內(nèi)蒙古生乳樣品聚集在一起，說

明兩地區(qū)的生乳樣品的嗜冷菌群落結(jié)構(gòu)相似，但黑龍江生乳樣品和內(nèi)

蒙古生乳樣品與其他地區(qū)的生乳樣品明顯分開，說明黑龍江生乳樣品

和內(nèi)蒙古生乳樣品與其他地區(qū)生乳樣品的嗜冷菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著

差異。

█ MRT 2022 年度報告

﹣238﹣

圖 3 不同地區(qū)生乳樣品的聚類熱圖分析?？s寫參考圖 1

我們使用聚類熱圖分析進一步探討了不同地區(qū)生乳樣品中嗜冷

菌在種水平上群落結(jié)構(gòu)（相對豐度排名前 50）的差異（圖 3），樣品

按照微生物組成數(shù)據(jù)的歐式距離進行聚類，物種按照組成數(shù)據(jù)的

Pearson 相關(guān)性系數(shù)矩陣進行聚類。結(jié)果發(fā)現(xiàn)黑龍江生乳樣品和內(nèi)蒙

古生乳樣品中 Sporosarcina luteola、Cytobacillus kochii 和 Enterococcus

faecalismin 明顯聚集在一起，但和其他地區(qū)的生乳顯著分開，河南生

乳樣品、安徽生乳樣品和江蘇生乳樣品中淺黃色假單胞菌（P. lurida）、

P. gessardii、Lederbergia galactosidilyticus、Galactobacter valiniphilus

二、研究進展 █

﹣239﹣

和 Citrobacter freundii 含量較高而聚集在一起，且不同取樣日期的差

異明顯。

圖 4 不同地區(qū)生乳樣品的韋恩分析。

圖 5 不同地區(qū)生乳樣品的線性判別分析（LDA）。縮寫參考圖 1

█ MRT 2022 年度報告

﹣240﹣

我們使用韋恩分析和線性判別分析對不同地區(qū)生乳中的差異物

種進行了分析（圖 4 和圖 5），我們發(fā)現(xiàn)屎腸球菌和 Rothia endophytica

是所有地區(qū)生乳樣品中的共有物種，而江蘇地區(qū)生乳樣品中芽孢桿菌

（Bacillus）的相對豐度顯著高于其他地區(qū)生乳，湖南地區(qū)生乳樣品中

鏈球菌和 Comamonas 顯著高于其他地區(qū)生乳。

本研究通過傳統(tǒng)培養(yǎng)和 PacBio 單分子實時測序相結(jié)合的方法分

析中國黑龍江、內(nèi)蒙古、甘肅、河南、安徽、江蘇、湖南和重慶等 8

個省份采集的 25 個生乳樣品中嗜冷菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性，通過傳

統(tǒng)培養(yǎng)方法從樣品分離出 248 個不同的嗜冷菌菌落，使用 16S rDNA

基因測序鑒定為 21 個屬和 59 個種，在屬水平上占比較高的是假單胞

菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、腸球菌屬、金黃桿菌屬和沙雷氏菌屬，其中假

單胞菌屬占比高達 58.9%，在種水平上占比較高的是 P. azotoformans、

P. paralactis、P. lactis、P. marginalis 和 P. helmanticensis，其中 P.

azotoformans 占比高達 16.9%。同時，我們發(fā)現(xiàn)生乳中嗜冷菌的群落

結(jié)構(gòu)因地區(qū)而異，黑龍江和內(nèi)蒙古地區(qū)生乳中嗜冷菌的群落結(jié)構(gòu)和多

樣性相似，但與其他地區(qū)差異顯著，同時不同取樣日期的河南生乳樣

品、安徽生乳樣品和江蘇生乳樣品存在顯著差異，這可能與牧場管理

或者牧場消毒管理程序不穩(wěn)定有關(guān)，比如牧場擠奶設(shè)備的消毒程序中

酸消毒或堿消毒通常是隔天進行。由于中國幅員遼闊，生乳中嗜冷菌

的群落結(jié)構(gòu)千差萬別，因此必須針對不同地區(qū)的牛場進行不同的嗜冷

菌控制策略。

二、研究進展 █

﹣241﹣

研究成果發(fā)表在《Frontiers in Microbiology》雜志。該研究得到了

農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項目(ASTIP-IAS12)和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS36)的支持。研究生杜兵耀為第一作者，王加啟研究員為通訊作者。

（撰稿人：杜兵耀，校稿人：許文君和吳杰）

——DU BINGYAO, MENG LU, LIU HUIMIN, ZHENG NAN,

ZHANG YANGDONG, ZHAO SHENGGUO, WANG JIAQI. Single

Molecule Real-Time Sequencing and Traditional Cultivation Techniques

Reveal Complex Community Structures and Regional Variations of

Psychrotrophic Bacteria in Raw Milk.

Frontiers in Microbiology, 2022(13).

█ MRT 2022 年度報告

﹣242﹣

17. 生乳中假單胞桿菌的種類及其蛋白酶活力的分析

全球牛奶消費市場巨大，由于牛奶營養(yǎng)物質(zhì)豐富，也是有利于微

生物生長的基質(zhì)。牛奶被微生物污染后，微生物會在牛奶中大量繁殖。

牛奶在乳房中的時候通常是無菌的，微生物的污染可能是通過受感染

乳房的直接排泄或者在擠奶、運輸、儲存和加工過程中被環(huán)境中的微

生物污染引起的。飼料、水、空氣、臥床墊料、乳房、糞便、擠奶設(shè)

備、貯存設(shè)備和加工設(shè)備等環(huán)境因素都有可能成為潛在的污染源。

此外，近年來隨著乳品工業(yè)技術(shù)的不斷發(fā)展，擠奶流程規(guī)范性操

作得到了不斷的完善，快速冷卻系統(tǒng)和低溫貯存系統(tǒng)得到了廣泛的推

廣，有效地抑制了乳制品中微生物的繁殖，但這也為嗜冷菌提供了良

好的生長環(huán)境，研究發(fā)現(xiàn)假單胞菌是冷藏生乳中的主要微生物，并產(chǎn)

生大量的脂肪酶和蛋白酶，盡管巴氏殺菌或者超高溫滅菌工藝都能殺

死假單胞菌，但是假單胞菌產(chǎn)生的脂肪酶和蛋白酶特別耐熱，在巴氏

殺菌或者超高溫滅菌工藝加工后還具有活性，會引起奶制品中脂肪和

蛋白的水解，造成酸敗，凝膠化等問題，為乳制品的安全帶來了隱患。

但是中國不同地區(qū)生乳中嗜冷菌的蛋白水解活性還不清楚，因此，我

們分析了內(nèi)蒙古、黑龍江、甘肅、河南、安徽、江蘇、重慶和湖南地