█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣144﹣

villus height crypt depth

0

100

200

300

400

500

length (μm)

Control

DMSO

LF

AFM1

LF+AFM1

ns** ***

***

***

***

ns****** *

*** ***

Control DMSO LF AFM1 LF+AFM1

0

1

2

3

4

5

villus height/crypt depth

ns

*** *** ***

***

***

(F) (G)

圖 2 LF 和 AFM1 對(duì)小鼠回腸組織學(xué)的影響?；啬c組織學(xué)通過(guò)蘇木精-伊紅染色（HE，

200×）進(jìn)行評(píng)估。

圖 3 通過(guò)免疫熒光染色（200×）測(cè)定 LF 和 AFM1 對(duì) occludin、claudin-3 和 ZO-1 在回

腸中的表達(dá)和分布的影響

通過(guò)測(cè)量跨上皮電阻值和細(xì)胞旁通透性進(jìn)一步研究 LF 在體外對(duì)

AFM1 誘導(dǎo)的受損腸道屏障的保護(hù)作用。選擇分化的 Caco-2 細(xì)胞作

為體外試驗(yàn)?zāi)Ｐ?。如圖 4 所示，LF 處理部分逆轉(zhuǎn) AFM1 降低的分化

二、研究進(jìn)展 █

﹣145﹣

Caco-2 細(xì)胞中的 TEER 值，逆轉(zhuǎn) AFM1 誘導(dǎo)的腸道通透性增加。該

結(jié)果與體內(nèi)研究結(jié)果一致。

圖 4 LF 和 AFM1 對(duì)分化 Caco-2 細(xì)胞腸道通透性的影響。（A）TEER 分析，（B）細(xì)

胞旁通透性。

轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的聯(lián)合組學(xué)數(shù)據(jù)闡明了 LF 保護(hù)作用的潛在機(jī)制。

首先是在分化的 Caco-2 細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。與對(duì)照組相比，

AFM1 處理組有 4993 個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs），其中 1898 個(gè)上調(diào)，

3095 個(gè)下調(diào)；LF 處理組有 280 個(gè) DEGs，其中 88 個(gè)上調(diào)，192 個(gè)下

調(diào)；LF+AFM1 處理組有 4193 個(gè) DEGs，其中 1854 個(gè)上調(diào)，2339 個(gè)

下調(diào)（圖 5A）。主成分分析（PCA）表明，對(duì)照組和 LF 處理組之間，

或 AFM1 和 LF+AFM1 處理組之間沒(méi)有差異。這表明 LF 似乎對(duì)分化

的 Caco-2 細(xì)胞有輕微影響，AFM1 在 LF+AFM1 處理組中起決定性

作用（圖 5B）。與單獨(dú)的 AFM1 和 LF 處理組相比，LF 和 AFM1 聯(lián)

合處理組中有 562 個(gè)特有的 DEGs（圖 5C）。KEGG 結(jié)果顯示，單獨(dú)

或聯(lián)合的 AFM1 和 LF 不同程度地影響腸道細(xì)胞相關(guān)的信號(hào)通路，如

凋亡、細(xì)胞周期、MAPK 和 Wnt 信號(hào)通路，以及腸道完整性相關(guān)通

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣146﹣

路，包括肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架、粘著斑、粘附連接、縫隙連接和緊密連

接（圖 5D）。qRT-PCR 結(jié)果證實(shí)了轉(zhuǎn)錄組的可靠性（圖 5E）。

二、研究進(jìn)展 █

﹣147﹣

圖 5 LF 和 AFM1 誘導(dǎo)分化的 Caco-2 細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組分析。

為了評(píng)估 LF 對(duì) AFM1 誘導(dǎo)的分化 Caco-2 細(xì)胞在蛋白質(zhì)水平的

影響，進(jìn)行了蛋白質(zhì)組分析。AFM1 處理組的差異表達(dá)蛋白（DEPs）

數(shù)量為 471 個(gè)，其中 166 個(gè)上調(diào)，305 個(gè)下調(diào)；LF 處理組有 76 個(gè)，

其中 16 個(gè)上調(diào)，60 個(gè)下調(diào)；LF+AFM1 處理組有 406 個(gè)，其中 136

個(gè)上調(diào)，270 個(gè)下調(diào)（圖 6A）。蛋白質(zhì)組的 PCA 分析與轉(zhuǎn)錄組的 PCA

分析一致，表明 AFM1 的作用比 LF 更明顯。蛋白質(zhì)組學(xué) Venn 結(jié)果

顯示，與單獨(dú)的 AFM1 和 LF 處理相比，LF 和 AFM1 聯(lián)合處理產(chǎn)生

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣148﹣

了 228 個(gè)特有的 DEPs（圖 6B）。AFM1、LF 和 LF+AFM1 處理對(duì)腸

道屏障相關(guān)通路有不同程度地影響，包括凋亡、p53和Wnt信號(hào)通路；

腸道完整性相關(guān)通路，如肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架、粘附連接、縫隙連接、

緊密連接和粘著斑（圖 6 C）。對(duì)于這些受影響的通路，LF 單獨(dú)處理

組和聯(lián)合處理組的影響最小，而 AFM1 處理組的影響最大。炎癥相關(guān)

通路，包括 IL-17 信號(hào)通路和炎癥性腸?。↖BD），僅在 AFM1 處理

組中得到富集。Western blotting 檢測(cè) CYP1A1 和 PCK1 的蛋白表達(dá)結(jié)

果與蛋白質(zhì)組的結(jié)果一致（圖 6 D）。

二、研究進(jìn)展 █

﹣149﹣

Control

AFM1

LF

LF+AFM1

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Relative expression of

CYP1A1

*** ***

Control

AFM1

LF

LF+AFM1

0.0

0.5

1.0

1.5

Relative expression of

PCK1

*** **

圖 6 LF 和 AFM1 誘導(dǎo)分化 Caco-2 細(xì)胞的蛋白質(zhì)組分析。

圖 7 分化 Caco-2 細(xì)胞中已鑒定轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)之間的相關(guān)性。

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣150﹣

為了進(jìn)一步了解鑒定到的基因和蛋白之間的功能相關(guān)性，進(jìn)行了

聯(lián)合組學(xué)分析。本研究集中于分析象限 c 和 g，即 mRNA 和蛋白質(zhì)水

平的顯著一致性變化。LF 處理組在象限 c 和 g 中有 23 種蛋白質(zhì)作為

紅點(diǎn)和灰點(diǎn)的總和，但它們都與腸道完整性無(wú)關(guān)（圖7A）。對(duì)于AFM1，

象限 c 和 g 分別包括 207 個(gè)標(biāo)記為紅點(diǎn)的蛋白質(zhì)，其中 38 個(gè)與腸道

完整性相關(guān)，包括屬于凋亡的 ENDOG、MYH14、GSK3B、SMAD3

和 MYLK，分別調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架、粘著斑、粘附連接和緊密連

接（圖 7B）。此外，在象限 c 和 g 中，AFM1 處理的 333 個(gè)灰點(diǎn)中

有 52 個(gè)與腸道完整性相關(guān)（圖 7B）。對(duì)于 LF 和 AFM1 的聯(lián)合處理

組，在象限 c 和 g 中有 179 個(gè)蛋白質(zhì)作為紅點(diǎn)，其中 48 個(gè)蛋白質(zhì)與

肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架、p53 信號(hào)通路、補(bǔ)體和凝血因子以及緊密連接的

調(diào)節(jié)有關(guān)，如 RRM2、ITGAE、CLU 和 CLDN3（圖 7C）。在象限 c

和 g 中，LF+AFM1 處理的 298 個(gè)灰點(diǎn)中有 42 個(gè)也與腸道完整性有

關(guān)（圖 7C）。表１顯示 AFM1 和 LF+AFM1 共同處理之間有 16 種與

腸道完整性相關(guān)的蛋白質(zhì)。與 AFM1 相比，LF 和 AFM1 聯(lián)合處理組

的 INSR、CYFIP2 和 DOCK1 的表達(dá)更高，屬于肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架、

粘著斑和粘附連接的調(diào)節(jié)，而 p53 信號(hào)通路中 RRM2 的表達(dá)較低。

本研究首次在體內(nèi)和體外證明了 LF 干預(yù)可以緩解 AFM1 誘導(dǎo)的

腸屏障功能障礙。LF 對(duì) AFM1 的保護(hù)作用與腸上皮細(xì)胞和腸上皮相

關(guān)途徑有關(guān)。更具體地說(shuō)，INSR、CYFIP2、DOCK1 和 RRM2 參與

了 LF 的保護(hù)作用。這些發(fā)現(xiàn)為 LF 的潛在有益特性提供了新的見(jiàn)解，

可作為一種功能性食品用于修復(fù)腸上皮損傷。

二、研究進(jìn)展█

表１AFM1和 LF+AFM1處理的分化 Caco-2細(xì)胞中 DEGs和 DEPs之間的相關(guān)性。

Description Symbol

Log2FC

（AFM1/Control）

Log2FC

（LM/Control）

p Value

（AFM1/Control）

p Value

（LM/Control） KEGG Pathway

Protein mRNA Protein mRNA Protein mRNA Protein mRNA

clusterin CLU 0.67 1.32 0.77 1.14 0.0001 8.68 × 10?53 8.13 × 10?5 3.47 × 10?33 Complement and coagulation cascades

G protein subunit alpha i1 GNAI1 1.19 0.85 1.65 0.99 0.97 0.0001 0.65 0.0003 Rap1 signaling pathway, Chemokine signaling pathway

agrin AGRN ?1.15 ?0.88 ?0.96 ?0.82 1.03 × 10?12 9.12 × 10?14 9.06 × 10?8 7.15 × 10?13 ECM-receptor interaction

ribonucleotide reductase

regulatory subunit M2 RRM2 ?1.53 ?0.99 ?1.81 ?1.39 8.86 × 10?10 0.01 5.59 × 10?7 0.0002 p53 signaling pathway

hepatocyte nuclear factor 4

alpha HNF4A ?1.09 ?1.57 ?1.11 ?1.44 1.27 × 10?9 7.36 × 10?37 2.98 × 10?8 1.45 × 10?19 AMPK signaling pathway

PVR cell adhesion molecule PVR ?0.88 ?0.91 ?0.71 ?0.96 3.14 × 10?5 9.28 × 10?12 0.001 3.77 × 10?14 Cell adhesion molecules （CAMs）

JunD proto-oncogene JUND ?1.74 ?1.71 ?0.77 ?1.12 0.18 1.34 × 10?43 0.017 5.00 × 10?21 MAPK signaling pathway, IL- 17 signaling pathway

phosphoenolpyruvate

PCK1194314084068000310510?16 00226710?37 FoxOsignalingpathway,PI3K-

﹣151﹣

phosphoenolpyruvate

carboxykinase 1 PCK1 ?1.94 ?3.14 ?0.84 ?0.68 0.003 1.05 × 10?16 0.02 2.67 × 10?37 FoxO signaling pathway, PI3K Akt signaling pathway

erb-b2 receptor tyrosine

kinase 3 ERBB3 ?1.59 ?0.90 ?0.83 ?0.68 0.007 1.74 × 10?14 0.03 1.50 × 10?9 ErbB signaling pathway, Calcium signaling pathway

insulin receptor INSR ?1.29 ?1.69 ?1.23 ?1.15 0.10 1.76 × 10?42 0.07 1.78 × 10?18 Adherens junction, HIF-1 signaling pathway

Amphiregulin AREG ?1.08 ?1.26 ?1.89 ?1.02 0.08 9.20 × 10?18 0.13 6.49 × 10?12 PI3K-Akt signaling pathway, MAPK signaling pathway

exocyst complex component

2 EXOC2 ?0.85 ?1.38 ?1.19 ?1.11 0.37 2.72 × 10?23 0.15 5.13 × 10?14 Ras signaling pathway

E1A binding protein p300 EP300 ?1.11 ?0.97 ?0.93 ?0.76 0.25 7.10 × 10?11 0.33 1.55 × 10?6 HIF-1 signaling pathway, Wnt signaling pathway

cytoplasmic FMR1

interacting protein 2 CYFIP2 ?1.41 ?1.64 ?1.16 ?1.31 0.02 4.49 × 10?22 0.39 9.66 × 10?14 Regulation of actin cytoskeleton

nuclear receptor corepressor 2 NCOR2 ?1.31 ?1.78 ?2.94 ?1.46 0.41 4.33 × 10?33 0.61 4.30 × 10?18 Notch signaling pathway

dedicator of cytokinesis 1 DOCK1 ?1.28 ?2.01 ?1.19 ?2.12 0.16 1.98 × 10?41 0.92 7.24 × 10?61 Focal adhesion, Regulation of actin cytoskeleton

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣152﹣

研究成果已于 2022 年 1 月發(fā)表在《International Journal of

Molecular Sciences》雜志。該成果由國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目、國(guó)

家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程和中國(guó)農(nóng)業(yè)

科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程重大產(chǎn)出科研選題等項(xiàng)目資助，第一作者高

亞男，通訊作者鄭楠。

（撰稿人：高亞男）

——GAO YANAN, LI SONGLI, YANG XUE, WANG JIAQI,

ZHENG NAN. The Protective Effects of Lactoferrin on Aflatoxin M1-

Induced Compromised Intestinal Integrity.

International Journal of Molecular Sciences. 2022, 23(1):289.

二、研究進(jìn)展 █

﹣153﹣

5. 乙酸、丙酸和丁酸對(duì)離體培養(yǎng)的胎鼠空腸和未成熟小腸

細(xì)胞的抗炎作用

壞死性小腸結(jié)腸炎（NEC）是一種常見(jiàn)于早產(chǎn)兒的腸道疾病。由

于 NEC 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚無(wú)治療 NEC 的有效方法。因此，盡

早采取有效的干預(yù)措施是降低 NEC 發(fā)病率的關(guān)鍵。短鏈脂肪酸

（SCFAs）是腸桿菌發(fā)酵的主要終產(chǎn)物，其中乙酸、丙酸和丁酸的含

量高達(dá) 95%。SCFAs 已被證明可以促進(jìn)腸道完整性，調(diào)節(jié)代謝紊亂，

并調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。在目前的研究中，SCFAs 對(duì)腸道炎癥的保護(hù)作用研

究主要集中在成熟的小鼠結(jié)腸或人類結(jié)腸細(xì)胞系。然而，很少有研究

關(guān)注它們?cè)谖闯墒煨∧c中的作用。為了驗(yàn)證 SCFAs 對(duì)未成熟小腸炎

癥是否具有保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制，該研究通過(guò) IL-1β 誘導(dǎo)的 ICR 胎鼠

空腸離體培養(yǎng)物炎癥模型評(píng)估乙酸、丙酸和丁酸的抗炎作用，并通過(guò)

轉(zhuǎn)錄組學(xué)探索潛在的抗炎調(diào)節(jié)通路，然后用人類胎兒小腸上皮 FHs 74

Int 細(xì)胞進(jìn)行體外驗(yàn)證。

試驗(yàn)首先進(jìn)行了離體試驗(yàn)。將懷孕的 ICR 小鼠在特定的無(wú)病原

體環(huán)境中飼養(yǎng)，并自由進(jìn)食和飲水。在懷孕 18.5 天時(shí)處死，通過(guò)剖腹

產(chǎn)取出胎鼠。然后解剖胎鼠，取出胎鼠空腸，切割成 3 mm 片段并保

存在 37?C 的器官培養(yǎng)基中。胎鼠空腸培養(yǎng)物用或不用 20-40 mM 乙

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣154﹣

酸、丙酸或丁酸預(yù)處理 1h，然后與 IL-1β（1ng/mL）共同培養(yǎng) 24h。

將胎鼠空腸培養(yǎng)上清液通過(guò) ELISA 法測(cè)定 CXCL2 濃度，并提取胎鼠

空腸 RNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。離體試驗(yàn)完成后，進(jìn)行體外試驗(yàn)。將

FHs 74 Int 細(xì)胞用或不用乙酸、丙酸或丁酸（5-30mM）預(yù)處理 1h，然

后與 IL-1β（0.5ng/mL）共同孵育 24h。然后，通過(guò) ELISA 和 qRT PCR

測(cè)定細(xì)胞中 IL-8 和 IL-6 的表達(dá)，并通過(guò) Western Blot 測(cè)定炎癥相關(guān)

信號(hào)通路表達(dá)。

為了建立胎鼠空腸炎癥模型，不同濃度的 IL-1β 用于處理胎鼠空

腸培養(yǎng)物。如圖 1A 所示，經(jīng) 1 ng/mL IL-1β 處理的胎鼠空腸培養(yǎng)物中

CXCL2 的產(chǎn)生顯著增加，表明胎鼠空腸炎癥模型構(gòu)建成功。乙酸、

丙酸和丁酸在所有試驗(yàn)濃度（20-40 mM）下處理均顯著降低 IL-1β 誘

導(dǎo)的胎鼠空腸培養(yǎng)物中 CXCL2 的表達(dá)（圖 1B、C 和 D）。

圖 1 IL-1β 和 SCFAs 對(duì)胎鼠空腸培養(yǎng)物中 CXCL2 表達(dá)水平的影響

二、研究進(jìn)展 █

﹣155﹣

基于基因表達(dá)量信息，對(duì)各個(gè)處理組組內(nèi)的 3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)樣品

開(kāi)展主成分分析（PCA，Principal Component Analysis），以了解重復(fù)

樣本間的重復(fù)性與組間樣本的差異性。從圖 2 可以看出各個(gè)處理組組

內(nèi)樣品都有較好的重復(fù)性，對(duì)照組、IL-1β 單獨(dú)處理組和 SCFAs 與 IL1β 共同處理組樣品能夠很好的分離。

圖 2 各組樣品主成分分析（PCA）

通過(guò) Pathway 顯著性富集能確定基因參與的最主要生化代謝途

徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。當(dāng)校正的 p 值(Qvalue) ≤ 0.05 時(shí)，認(rèn)為 KEGG 通

路存在顯著富集情況。如圖 3 所示，乙酸+IL-1β 組和 IL-1β 組之間的

KEGG 富集分析顯示 11 條顯著富集途徑與炎癥相關(guān)，如細(xì)胞因子-細(xì)

胞因子受體相互作用、NF-κB 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路和 TNF

信號(hào)通路等（圖 3A）。丙酸+IL-1β 組和 IL-1β 組之間的 KEGG 富集

分析顯示 13 條顯著富集途徑與炎癥相關(guān)，如細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體

相互作用、PI3K-Akt 信號(hào)通路、JAK-STAT 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣156﹣

路、NF-κB 信號(hào)通路和 TNF 信號(hào)通路等（圖 3B）。丁酸+IL-1β 組和

IL-1β 組之間的 KEGG 富集分析顯示 14 條顯著富集途徑與炎癥相關(guān)，

包括細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、PI3K-Akt 信號(hào)通路、NF-κB

信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、JAK-STAT 信號(hào)通路和 Wnt 信號(hào)通路

等（圖 3C）。

圖 3 與炎癥相關(guān)的 KEGG 通路富集圖。（A）IL-vs-乙酸+IL-1β 組，（B）IL-vs-丙酸

+IL-1β 組，（C）IL-vs-丁酸+IL-1β 組。

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果的可靠性，研究人員通過(guò) qRT PCR 檢測(cè)

丙酸+IL-1β 組和 IL-1β 組之間與炎癥相關(guān)的 10 個(gè)差異表達(dá)基因的

mRNA 表達(dá)，包括胸腺瘤病毒原癌基因 1（AKT1）、趨化因子（C-C

基序）配體 2（CCL2）、趨化因子（C-C 基序）配體 11（CCL11）、

核因子 κB 亞基 1（NFKB1）、組蛋白去乙?；?7（HDAC7）、信

號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子 1（SATA1）、基質(zhì)金屬肽酶 10（MMP10）、

白細(xì)胞介素 11（IL11），干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白 3（IFITM3）和趨化

因子（C-X-C 基序）配體 2（CXCL2）。結(jié)果表明，丙酸+IL-1β 組 10

二、研究進(jìn)展 █

﹣157﹣

個(gè)基因的 mRNA 水平均低于 IL-1β 組。qRT PCR 結(jié)果和轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)

果的類似趨勢(shì)表明轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序數(shù)據(jù)是可靠的。（圖 4）

圖 4 轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)可靠性驗(yàn)證

為了進(jìn)一步研究 SCFA 抗炎作用的潛在機(jī)制，驗(yàn)證離體試驗(yàn)的結(jié)

果。研究人員用 IL-1β 處理 FHs 74 Int 細(xì)胞，結(jié)果如圖 5 所示，IL-8

和 IL-6 的表達(dá)水平顯著升高，對(duì) FHs 74 Int 細(xì)胞的活力沒(méi)有顯著影

響，也對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性，表明 FHs 74 Int 細(xì)胞炎癥模型構(gòu)建成功。

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣158﹣

圖 5 IL-1β 對(duì) FHs 74 細(xì)胞中 IL-8 和 IL-6 表達(dá)水平、細(xì)胞活力和細(xì)胞毒性的影響

如圖 6 所示，乙酸、丙酸和丁酸均顯著抑制細(xì)胞炎癥。乙酸、丙

酸和丁酸均顯著抑制 IL-1β 誘導(dǎo)的 IL-8 的蛋白和 mRNA 的表達(dá)，對(duì)

IL-6 的蛋白和 mRNA 的表達(dá)也有同樣的抑制作用。同時(shí)，三種 SCFAs

對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性作用，也不影響細(xì)胞的活力。

二、研究進(jìn)展 █

﹣159﹣

圖 6 乙酸、丙酸和丁酸對(duì) IL-1β 誘導(dǎo)的 FHs 74 細(xì)胞中 IL-8 和 IL-6 表達(dá)水平的影響

基于 KEGG 富集分析結(jié)果（圖 3），研究人員通過(guò) western blot

試驗(yàn)檢測(cè)了 IL-1β 誘導(dǎo)的 FHs 74 Int 細(xì)胞中 AKT、JAK1、STAT1、

NF-κB p65、JNK1/2 和 ERK 1/2 的磷酸化水平。如圖 7 所示，與對(duì)照

組相比，IL-1β 顯著上調(diào) NF-κB p65、JNK1/2 和 ERK1/2 磷酸化水平。

然而，AKT、JAK1 和 STAT1 的磷酸化水平?jīng)]有顯著變化（數(shù)據(jù)未顯

示）。在 IL-1β 誘導(dǎo)的 FHs 74 Int 細(xì)胞中，乙酸鹽僅顯著抑制 ERK1/2

磷酸化，丙酸顯著抑制 NF-κB p65、JNK1/2 和 ERK1/2 的磷酸化水平，

丁酸顯著抑制 NF-κB p65 和 ERK1/2 的磷酸化水平，但對(duì) JNK1/2 磷

酸化的抑制作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣160﹣

圖 7 乙酸、丙酸和丁酸對(duì) IL-1β 誘導(dǎo)的 FHs 74 Int 細(xì)胞中 NF-κB p65、JNK1/2 和

ERK1/2 磷酸化水平的影響。

為了進(jìn)一步證實(shí)乙酸、丙酸和丁酸通過(guò)抑制 NF-κB p65、JNK1/2

和 ERK1/2 的磷酸化來(lái)調(diào)節(jié) IL-1β 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，BAY 11-7085、

SP600125 和 U0126（分別為 NF-κB p65、JNK1/2 和 ERK1/2 的抑制

劑）被作用于 FHs 74 Int 細(xì)胞炎癥模型。如圖 8 示，三種抑制劑均顯

著下調(diào) IL-1β 誘導(dǎo)的 FHs 74 Int 細(xì)胞中 IL-8 和 IL-6 的 mRNA 水平。

圖 8 NF-κB p65、JNK1/2 和 ERK1/2 的抑制劑對(duì) FHs 74 Int 細(xì)胞中 IL-1β 誘導(dǎo)的 IL-8 和

IL-6 mRNA 水平的影響

結(jié)論：乙酸、丙酸和丁酸對(duì) ICR 胎鼠空腸炎癥和人胎兒小腸上皮

FHs Int 74 細(xì)胞炎癥具有抑制作用，但其作用機(jī)制有所不同。乙酸通

過(guò)降低 ERK1/2 的磷酸化水平抑制炎癥，丙酸通過(guò)降低 NF-κB p65、

二、研究進(jìn)展 █

﹣161﹣

JNK1/2 和 ERK1/2 的磷酸化水平抑制炎癥，丁酸通過(guò)降低 NF-κB p65

和 ERK1/2 的磷酸化水平抑制炎癥。該研究成果對(duì)于乙酸、丙酸和丁

酸在未成熟小腸炎癥領(lǐng)域的應(yīng)用研究至關(guān)重要，也為預(yù)防早產(chǎn)兒壞死

性小腸結(jié)腸炎的發(fā)生提供了一種新的方法。

該研究已發(fā)表在《Food Science & Nutrition》雜志。該成果得到中

國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程重大產(chǎn)出科研選題、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院

科技創(chuàng)新工程和現(xiàn)代農(nóng)產(chǎn)工業(yè)技術(shù)研究體系項(xiàng)目資助。黃勝楠為第一

作者，高亞男為共同第一作者，鄭楠研究員為通訊作者。

（撰稿人：黃勝楠）

——HUANG SHENGNAN, GAO YANAN, WANG ZIWEI, YANG

XUE, WANG JIAQI, ZHENG NAN.Anti-inflammatory actions of acetate,

propionate, and butyrate in fetal mouse jejunum cultures ex vivo and

immature small intestinal cells in vitro.

Food Science & Nutrition. 2022, 10(2):564-576.

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣162﹣

二、研究進(jìn)展 █

﹣163﹣

6. 全轉(zhuǎn)錄組分析揭示黃曲霉毒素 M1 和赭曲霉毒素 A 發(fā)揮

腸道免疫抑制的 ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

黃曲霉毒素 M1（Aflatoxin M1, AFM1）是牛奶中唯一具有最大限

量的霉菌毒素，歐盟對(duì) AFM1 的限量為 0.05 μg/kg，中國(guó)及美國(guó)的限

量為 0.5 μg/kg。2002 年國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）將 AFM1 從 2 類

致癌物更改為 1 類致癌物。赭曲霉毒素 A（Ochratoxin A，OTA）主

要存在于不同的生食品中，包括谷物、咖啡和葡萄酒。據(jù)報(bào)道，OTA

在 9627 份谷物食品樣品的污染率中排名第一。IARC 將 OTA 分類為

2B 類致癌物，是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題。腸道屏障是接觸食物污

染物的第一道屏障，腸道在人體免疫中具有重要作用。因此，闡明霉

菌毒素對(duì)腸道免疫毒性（免疫抑制或免疫刺激）的作用并分析其潛在

機(jī)制非常重要。

近年來(lái)，全轉(zhuǎn)錄組分析逐漸成為研究霉菌毒素毒性作用機(jī)制的趨

勢(shì)。基于 mRNA 測(cè)序，全轉(zhuǎn)錄組構(gòu)建了兩種類型的文庫(kù)，可以同時(shí)

分析四種不同 RNA 的數(shù)據(jù)：長(zhǎng)鏈非編碼（lnc）RNA、環(huán)狀（circ）

RNA、?。╩i）RNA 和 mRNA。通過(guò) miRNA 和三種 RNA（lncRNA、

circRNA 和 mRNA）的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，可以建立競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源 RNA

（competing endogenous RNA，ceRNA）網(wǎng)絡(luò)，從而能夠更準(zhǔn)確地找

到影響生物過(guò)程的關(guān)鍵 RNA。目前，利用全轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行霉菌毒素腸

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣164﹣

道毒性分析主要集中于物理屏障，且大多僅止于生信分析上，對(duì)于霉

菌毒素的腸道免疫毒性仍缺乏相關(guān)研究。因此，本試驗(yàn)對(duì)暴露于單獨(dú)

和組合 AFM1 和 OTA 的 BALB/c 小鼠的空腸進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，

并在分化的 Caco-2 細(xì)胞模型中進(jìn)行了功能驗(yàn)證研究，從分子水平上

揭示了 AFM1 和 OTA 的共同暴露風(fēng)險(xiǎn)以及相關(guān)的健康危害。

BALB/c 小鼠經(jīng) 3 mg/kg b.w. AFM1 和 3 mg/kg b.w. OTA 灌胃 28

天后，取其血清和空腸組織，血清用于測(cè)定血液生化指標(biāo)；空腸一方

面用于染色觀察、杯狀細(xì)胞計(jì)數(shù)、炎癥因子表達(dá)水平的測(cè)定；另一方

面用于全轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。體外分化 Caco-2 細(xì)胞通過(guò)暴露于關(guān)鍵蛋白

抑制劑，用于全轉(zhuǎn)錄組學(xué)的體外驗(yàn)證。

與對(duì)照組相比，AFM1 組沒(méi)有顯著改變小鼠體重，OTA 和 AFM1

+ OTA 組顯著降低小鼠體重（p<0.05）（圖 1A）。血液生化指標(biāo)結(jié)果

顯示，AFM1 和 OTA 損傷腸道完整性（圖 1B）。單獨(dú)及混合毒素處

理后導(dǎo)致小鼠空腸絨毛高度與隱窩深度的比值顯著低于對(duì)照組

（p<0.05）（圖 1C, D）。PAS 染色結(jié)果表明，OTA 和 AFM1 + OTA

處理組中空腸杯狀細(xì)胞數(shù)明顯低于對(duì)照組（p<0.05）（圖 1E）。RTqPCR結(jié)果顯示，在單獨(dú)AFM1和OTA以及聯(lián)合處理組中，IL-6 mRNA

表達(dá)水平顯著降低（p<0.05），而毒素有降低 TNF-α 和 IFN-γ 表達(dá)的

趨勢(shì)（圖 1F）。

二、研究進(jìn)展 █

﹣165﹣

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣166﹣

圖 1. AFM1 和 OTA 對(duì) BALB/c 小鼠空腸的影響。（A）BALB/c 小鼠體重的變化。（B）腸

道完整性相關(guān)的血清指標(biāo)。（C）空腸組織絨毛形態(tài)。（D）空腸上皮絨毛高度和隱窩深度。

（E）空腸杯狀細(xì)胞數(shù)量。（F）促炎因子 mRNA 表達(dá)量。不同的字母代表顯著差異。

基于 FC>1.5 和 p<0.05，將篩選得到的差異表達(dá)（Differential

expression）mRNA 進(jìn)行 KEGG 富集分析。對(duì)于腸道免疫毒性相關(guān)的

KEGG 分析，不同毒素處理組表現(xiàn)出相似性和差異性。PI3K-Akt 和

NF-κB 信號(hào)通路是 AFM1、OTA 和 AFM1 + OTA 中 DEmRNAs 富集

的共同通路。原發(fā)性免疫缺陷、IgA 產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)和 B 細(xì)胞受

體信號(hào)通路是 AFM1 和 OTA 處理組之間的共同途徑。鈣、TNF 和 IL17 信號(hào)通路是 AFM1 和 AFM1 + OTA 處理組之間的共同通路。OTA

二、研究進(jìn)展 █

﹣167﹣

和 AFM1 + OTA 處理組之間共同的是 MAPK、AMPK 信號(hào)通路和細(xì)

胞因子-細(xì)胞因子-受體相互作用通路（圖 2A）。這些結(jié)果部分解釋了

單獨(dú)和組合毒素誘導(dǎo)的不同腸道免疫抑制作用。

隨后，使用 STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)不同毒素處理組的腸道免疫抑制

相關(guān) DEmRNA PPI 圖。結(jié)果表明，處于中心位置的 DEmRNA，包括

Il4、Cxcl10、Csf1r、C1qa、Csf1、Cd14、Cx3cr1、Plg、Ccl20、Cxcr3、

Nos2、Irf1、Socs3、C1qb、Nfkb2、Fcer1g、Wnt5a、Cd209a、Ccl12、

Kng1 和 Fga，是腸道免疫毒性調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因（圖 2B）。

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣168﹣

二、研究進(jìn)展 █

﹣169﹣

圖 2.AFM1 和 OTA 誘導(dǎo)的 DEmRNA 的分析。（A）Top10 與炎癥和炎癥反應(yīng)相關(guān)的

KEGG 富集分析。（B）與腸道免疫毒性相關(guān)的 DEmRNAs 的 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析。

根據(jù)關(guān)鍵基因的功能預(yù)測(cè)和靶向性分析，Sankey 圖分析表明，

miR-1943-5p（靶向 Csf1、Csf1r、Cxcl10、Nos2 和 Wnt5a）、miR-124-

（靶向 y Csf1r、Cx3cr1 和 Cxcl1）、miR-199b-5p（靶向 Csf1 和 Cx3cr1）、

miR-107-y（靶向 Csf1、Csf1r 和 Irf1）和 miR-146b-5p（靶向 Csf1 和

Wnt5a）是參與 AFM1 和 OTA 誘導(dǎo)的腸道免疫抑制的關(guān)鍵 DEmiRNA

（圖 3A）。

Sankey 圖顯示，Gpb3（靶向 Csf1、Cxcl10、Irf1、Nfkb2、Nos2 和

Wnt5a）、Phf20（靶向 Csf1、Cxcl10、Nfkn2 和 Nos2）、Axin2（靶向

Cf1、Csf1r、Cx3cr1、Cx10、Irf2、Nfkm2 和 Wnt2a）、Rian（靶向 Csf1、

Cxcl10、Nfkb2、Irf、Nos2 和 Wnt3a）和 Map1b（靶向 Csc1r、x3cr1

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣170﹣

和 Nfkb2）是參與 AFM1 和 OTA 誘導(dǎo)的腸道免疫抑制的關(guān)鍵

DElncRNA（圖 3B）。

根據(jù)暴露于 AFM1 和 OTA 的 BALB/c 小鼠中與腸道免疫相關(guān)的

miRNA-mRNA 和 miRNA-lncRNA 關(guān)系，構(gòu)建了 lncRNA-miRNAmRNA 的 ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖 3C）。該網(wǎng)絡(luò)包括 8 個(gè) DEmRNA、

21 個(gè) DEmiRNA 和 45 個(gè) DElncRNA。該 ceRNA 網(wǎng)絡(luò)證明：（i）與

細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程相關(guān)的 DEmRNA（Csf1r、Csf1、Cx3cr1、

Cxcl10 和 Irf1）受到毒素的影響，（ii）受毒素影響的 DEmRNA Nfkb2

屬于 NF-κB 通路，表明該通路可能在 AFM1 和 OTA 誘導(dǎo)的腸道免疫

抑制作用中起重要作用，（iii）幾個(gè)重要的上游調(diào)節(jié)靶點(diǎn) DEmiRNA

和 DElncRNA 參與腸道免疫抑制，包括 miR-124-y、miR-107-y、miR106-x 和 lncRNA Rian。

二、研究進(jìn)展 █

﹣171﹣

圖 3. 關(guān)鍵差異表達(dá) miRNA 和 lncRNA 互作分析。（A）DEmiRNA-DEmRNA 互作網(wǎng)

絡(luò)。（B）DElncRNA-DEmRNA 互作網(wǎng)絡(luò)。（C）lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)表明，NF-κB 信號(hào)通路在 AFM1 和 OTA 發(fā)揮免

疫抑制中發(fā)揮了重要作用。為了闡明這些機(jī)制，我們使用了體外分化

Caco-2 細(xì)胞模型和 TAK1 抑制劑 5Z-7-oxozeaenol。Western blotting 印

跡顯示，與 LPS 組相比，LPS+AFM1、LPS+OTA 和 LPS+AFM1 + OTA

組的 p-TAK1、p-IKK、p-IκBα 和 p-p65 NF-κB 蛋白表達(dá)受到顯著抑

制（p<0.05），這與 5Z-7-oxozeaenol 處理結(jié)果一致，表明 AFM1 和

OTA 抑制了 TAK1/IKK/IκB/p65 NF-κB 通路（圖 4A）。此外，AFM1

和 OTA 逆轉(zhuǎn)了 LPS 誘導(dǎo)的 IL-6、TNF-α 和 IFN-γ mRNA 表達(dá)水平的

增加，這與 5Z-7-oxozeaenol 處理的結(jié)果相似（圖 4B）。這些結(jié)果表

明，單獨(dú)及混合的 AFM1 和 OTA 通過(guò)抑制 TAK1/IKK/IκBα/p65 NFκB 信號(hào)通路而發(fā)揮腸道免疫抑制作用。

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣172﹣

圖 4. 單獨(dú)及混合的 AFM1 和 OTA 通過(guò)抑制分化的 Caco-2 細(xì)胞中

TAK1/IKK/IκBα/p65 NF-κB 信號(hào)通路的磷酸化來(lái)緩解 LPS 誘導(dǎo)的腸道炎癥。（A）

TAK1/IKK/IκB/p65 NF-κB 通路蛋白表達(dá)量。（B）促炎因子 mRNA 表達(dá)量。

結(jié)論：基于體內(nèi)全轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)合體外細(xì)胞驗(yàn)證表明，如圖 5 所

示，（i）AFM1 和 OTA 對(duì)細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程（Csf1、Csf1r、

二、研究進(jìn)展 █

﹣173﹣

Cxcl10、Cx3cr1 和 Irf1）產(chǎn)生了負(fù)面影響，這些細(xì)胞由幾個(gè)關(guān)鍵的

DEmiRNA 和 DElncRNA 調(diào)節(jié)，以誘導(dǎo)腸道免疫抑制。（ii）AFM1 和

OTA通過(guò)抑制TAK1/IKK/IκBα/p65 NF-κB磷酸化發(fā)揮腸道免疫抑制。

（iii）混合毒素的腸道免疫毒性略高于單個(gè)毒素，單獨(dú)毒素之間沒(méi)有

顯著差異。該研究成果為解析 AFM1 和 OTA 聯(lián)合作用的腸道毒性機(jī)

制，挖掘毒性作用靶標(biāo)提供了重要指導(dǎo)。

圖 5. 單獨(dú)及混合的 AFM1 和 OTA 發(fā)揮免疫抑制的作用機(jī)制。

研究成果已于 2022 年 9 月發(fā)表在《Science of The Total

Environment》雜志。該研究得到國(guó)家自然科學(xué)基金、中國(guó)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)

業(yè)技術(shù)研究體系、農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新重大成果科研項(xiàng)目和農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新計(jì)

劃項(xiàng)目資助。文章第一作者高亞男，通訊作者為鄭楠研究員。

（撰稿人：高亞男，校稿人：席雪瑤）

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣174﹣

——GAO YANAN, WANG ZIWEI, YANG XUE, WANG JIAQI,

ZHENG NAN. Aflatoxin M1 and ochratoxin A induce a competitive

endogenous RNA regulatory network of intestinal immunosuppression by

whole-transcriptome analysis.

Science of The Total Environment. 2022, 854: 15877.

二、研究進(jìn)展 █

﹣175﹣

7. 代謝組學(xué)分析揭示黃曲霉毒素 M1 和赭曲霉毒素 A 聯(lián)合

處理致小鼠肝臟損傷機(jī)制

黃曲霉毒素M1（Aflatoxin M1, AFM1）是牛奶中唯一具有最大限

量的霉菌毒素，歐盟對(duì)AFM1的限量為0.05 μg/kg，中國(guó)及美國(guó)的限量

為0.5 μg/kg。2002年國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）將AFM1從2類致癌物

更改為1類致癌物。赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）主要存在于

不同的生食品中，包括谷物、咖啡和葡萄酒。據(jù)報(bào)道，OTA在9627份

谷物食品樣品的污染率中排名第一。IARC將OTA分類為2B類致癌物，

是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題。AFM1和OTA共存可能會(huì)導(dǎo)致加和或協(xié)

同效應(yīng)，為公眾健康帶來(lái)更大的風(fēng)險(xiǎn)。然而，AFM1 + OTA誘導(dǎo)的肝

臟毒性及其機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。本研究采用3.5 mg/kg b.w. AFM1、

OTA和AFM1 + OTA處理CD-1小鼠35天，采用LC-MS代謝組學(xué)方法構(gòu)

建小鼠肝臟和血清代謝物圖譜，以找出差異代謝物和腎毒性之間的關(guān)

系。

在35天內(nèi)記錄小鼠的體重（圖1A）。與對(duì)照組相比，DMSO對(duì)照

組的最終體重沒(méi)有顯著差異（p>0.05），而單獨(dú)的AFM1和OTA及其

聯(lián)合處理組顯著降低了小鼠體重（p<0.05，圖1B）。相比于對(duì)照組，

AFM1 + OTA組的肝臟重量顯著降低（p<0.05，圖1C），而肝臟指數(shù)

在毒素處理組中無(wú)顯著差異（p>0.05，圖1D）。評(píng)估與肝臟損傷相關(guān)

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣176﹣

的血清指標(biāo)（ALT、AST、TBIL和GCT）（圖1E-H）。與對(duì)照組相比，

AFM1 + OTA組顯著增加肝臟損傷相關(guān)的血清指標(biāo)（p<0.05）。

圖 1 單獨(dú)及聯(lián)合的 AFM1 和 OTA 對(duì)小鼠體重、肝臟指數(shù)和血清生化參數(shù)的影響。

二、研究進(jìn)展 █

﹣177﹣

首先通過(guò)二維主成分（PCA）分析來(lái)觀察代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的樣本方

差和組內(nèi)及組間的分布。PCA評(píng)分圖顯示各組均無(wú)分離樣本，因此后

續(xù)分析均未移除樣本（圖3A，C）。使用OPLS-DA分析進(jìn)一步對(duì)樣本

進(jìn)行分組和分類。如圖3B所示，DMSO組未顯著改變小鼠腎臟主要代

謝物的總體組成（對(duì)照組），而毒素單獨(dú)或聯(lián)合處理組對(duì)代謝物圖譜

有影響（如樣本與對(duì)照組和DMSO組的距離偏差所示）。OTA組和

AFM1 + OTA組代謝組改變程度更明顯，說(shuō)明OTA對(duì)小鼠肝組織的毒

性較AFM1強(qiáng)。血清代謝物中也顯示了類似的結(jié)果（圖3D）。

圖 2. AFM1 和 OTA 誘導(dǎo)的小鼠肝臟（A、B）和血清（C、D）代謝組 PCA 分析與

OPLS-DA 分析

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣178﹣

通過(guò)UPLC-MS分析，分別在小鼠肝臟和血清中鑒定了142和169

種代謝物。圖4和圖5顯示了DMSO對(duì)照組、單獨(dú)毒素組和聯(lián)合毒素組

中肝臟和血清中所有已鑒定代謝物的完整代謝網(wǎng)絡(luò)。對(duì)于肝臟，與

DMSO對(duì)照物組相比，AFM1 + OTA組的變化代謝物數(shù)量最多（10個(gè)

上調(diào)，37個(gè)下調(diào)），其次是AFM1組（13個(gè)上調(diào)，9個(gè)下調(diào)）和OTA組

（9個(gè)上調(diào)，11個(gè)下調(diào)）（圖4）。對(duì)于血清，AFM1 + OTA處理組（20

個(gè)上調(diào)，28個(gè)下調(diào)）中變化代謝物的數(shù)量最高，其次是OTA處理（29

個(gè)上調(diào)，14個(gè)下調(diào)）和AFM1處理（5個(gè)上調(diào)，27個(gè)下調(diào)）（圖5）。

這些結(jié)果表明，AFM1和OTA組合顯示出協(xié)同作用，OTA可能是發(fā)揮

主要毒性作用。

圖 3. AFM1 和 OTA 誘導(dǎo)的小鼠肝臟差異代謝網(wǎng)絡(luò)分析

二、研究進(jìn)展 █

﹣179﹣

圖 4. AFM1 和 OTA 誘導(dǎo)的小鼠血清差異代謝網(wǎng)絡(luò)分析

熱圖分析用于直觀地比較樣品和處理之間的代謝組水平（圖5）。

熱圖中的代謝物根據(jù)其表達(dá)水平進(jìn)行聚類，這些結(jié)果表明對(duì)照組、

DMSO和AFM1處理之間的代謝模式相似，與OTA和AFM1 + OTA處

理顯著不同。這些結(jié)果與圖3、圖4結(jié)果一致，表明OTA可能在AFM1

和OTA混合中發(fā)揮主要毒性。此外，如圖5所示，在肝臟和血清中20

種顯著改變的代謝物中，LysoPC是受AFM1和OTA影響的主要類型代

謝物。更特別的是，我們發(fā)現(xiàn)sn-1 LysoPC（16:1）是AFM1和OTA聯(lián)

合誘導(dǎo)的肝毒性中最關(guān)鍵的LysoPC。

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣180﹣

圖 5. AFM1 和 OTA 誘導(dǎo)的小鼠肝臟（A）和血清（B）差異物熱圖分析

結(jié)論：本研究首次評(píng)估了OTA和AFM1聯(lián)合處理導(dǎo)致的肝臟毒性，

結(jié)果顯示，與AFM1相比，OTA對(duì)肝臟的毒性更為明顯；LysoPC（16:1）

是聯(lián)合毒素處理引起肝損傷的關(guān)鍵代謝產(chǎn)物，可能是敏感而特異的肝

毒性生物標(biāo)志物。

二、研究進(jìn)展 █

﹣181﹣

研究成果已于2022年2月發(fā)表在《Toxins》雜志。該成果由國(guó)家自

然科學(xué)基金（31972190）、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CALS-36）、農(nóng)

業(yè)科技創(chuàng)新計(jì)劃（ASTIPS-IAS12）、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院重大任務(wù)（CAASZDXT201900）項(xiàng)目資助，高亞男為文章第一作者，鄭楠研究員為文

章通訊作者。

（撰稿人：高亞男，校稿人：黃胥萊）

——GAO YANAN, WU CHENQING, WANG JIAQI, ZHENG

NAN. Metabolomic Analysis Reveals the Mechanisms of Hepatotoxicity

Induced by Aflatoxin M1 and Ochratoxin A.

Toxins, 2022, 14, 141.

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣182﹣

8. 2'-巖藻糖基乳糖通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群和促進(jìn) MUC2 表

達(dá)改善炎癥性腸病

腸道是人體的消化吸收器官，也是接觸外來(lái)物質(zhì)的第一道屏障，

可防止異質(zhì)抗原和有害病原體的侵入。腸道微生物可將飲食營(yíng)養(yǎng)素代

謝成短鏈脂肪酸（SCFAs）、氨基酸、維生素及吲哚衍生物等，為腸

上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)及免疫系統(tǒng)的成熟提供能量底物、抵抗致病菌定植。

母乳作為新生兒最初的食物，其對(duì)嬰兒的發(fā)育有重要的作用。雖然母

乳和嬰幼兒配方奶粉的主要成分相似，但功能卻有很大差異。研究顯

示，母乳喂養(yǎng)的嬰兒具有較低的中耳炎率、腹瀉率以及輪狀病毒感染

率，這主要是因?yàn)槟溉橹泻写罅坎煌L(zhǎng)度的結(jié)構(gòu)寡糖——人乳寡糖

（HMOs）。由于羥化自由基和唾液化自由基，HMO 不能被胃腸道消

化酶消化，而是由結(jié)腸中腸道微生物群發(fā)酵。2'-巖藻糖基乳糖（2'-FL）

是人乳中最豐富的 HMO，約占 HMOs 總量的 30%。近年來(lái)，生物技

術(shù)和發(fā)酵工程的快速發(fā)展使 2'-FL 逐步工業(yè)化，并于 2015、2016 年分

別獲美國(guó)食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)作為膳食補(bǔ)充劑和營(yíng)養(yǎng)保健產(chǎn)

品。2'-FL 具有眾多的生物活性功能，對(duì)于嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)至關(guān)重要，開(kāi)

發(fā)新型添加巖藻糖基乳糖的嬰幼兒配方奶粉具有重要的社會(huì)意義。但

目前國(guó)內(nèi)關(guān)于巖藻糖基乳糖的研究處于起步階段，其對(duì)腸道健康的作

用研究較少，亟待開(kāi)展 2'-FL 的營(yíng)養(yǎng)功能評(píng)價(jià)，為 2'-FL 在奶粉中的

添加提供科學(xué)依據(jù)。

二、研究進(jìn)展 █

﹣183﹣

1 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)采用 6~8 周齡 C57BL/6J 小鼠（18?22 g 左右），隨機(jī)分為 3

組：對(duì)照組、DSS 組（腸炎模型組）、DSS+2'-FL 組，試驗(yàn)期共 21 d。

第 14～21 天，采用 5% DSS 水誘導(dǎo)小鼠腸炎； DSS+2'-FL 組小鼠全

程灌胃 2'-FL。在試驗(yàn)第 21 天處死小鼠，采集結(jié)腸內(nèi)容物、結(jié)腸組織

和血液樣本。

選擇 18 只 6~8 周齡 C57BL/6J 小鼠，采用抗生素法去除小鼠腸

道內(nèi)細(xì)菌（0～5 d），然后將小鼠隨機(jī)分為 3 組，將第一批各組小鼠

糞便菌群移植到無(wú)菌小鼠體內(nèi)（5～10 d），產(chǎn)生新的分組為：FM

（control）、FM（DSS）組、FM（DSS+2'-FL）組，適應(yīng)期 3 d，之

后采用 5% DSS 誘導(dǎo)小鼠腸炎。試驗(yàn)期間每天稱量小鼠體重，觀察小

鼠糞便狀態(tài)及顏色；試驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠，采集結(jié)腸內(nèi)容物、結(jié)腸組

織和血液樣本。

測(cè)定病理相關(guān)指標(biāo)：疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）、腸組織病理、炎癥

因子表達(dá)量（TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-17 及 IL-10）；菌群相關(guān)指標(biāo)：

結(jié)腸內(nèi)容物進(jìn)行 16S 全長(zhǎng)測(cè)序，分析 2'-FL 對(duì)腸道微生物的影響。

2 試驗(yàn)結(jié)果

DSS 處理 7 天后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，DSS 組小鼠體重顯著降

低，結(jié)腸長(zhǎng)度顯著縮短，DAI 評(píng)分顯著升高（P<0.05；圖 1A、1B、

1D），表明 DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎造模成功。H&E 染色顯示，DSS 組小鼠

黏膜和腸腺萎縮，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，上皮細(xì)胞腫脹，粘膜下層結(jié)締組織

增生（圖 1C）。相比之下，DSS+2'-FL 組小鼠給予 2'-FL 口服 21 后

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣184﹣

顯著減緩了小鼠體重下降速度，結(jié)腸長(zhǎng)度增加。此外，DSS+2'-FL 組

黏膜和腸腺炎癥程度較低，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少，表明 2'-FL 具有緩解

結(jié)腸炎作用。糞便菌群移植組表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，表明腸道微生物參

與了 2'-FL 減輕結(jié)腸炎癥的過(guò)程。

圖 1 2'-FL 緩解 DSS 誘導(dǎo)的 C57BL/6J 小鼠結(jié)腸炎癥。A，小鼠體重變化；B，結(jié)腸長(zhǎng)

度；C，H&E 染色（100×）；D，疾病活動(dòng)指數(shù)；E，血清炎癥因子

二、研究進(jìn)展 █

﹣185﹣

圖 2 糞便菌群移植證實(shí)腸道微生物參與 2'-FL 結(jié)腸炎緩解過(guò)程。 A，小鼠體重變化；

B，結(jié)腸長(zhǎng)度；C，H&E 染色（100×）；D，疾病活動(dòng)指數(shù)；E，血清炎癥因子

PCoA 結(jié)果顯示，3 組樣品間存在明顯的聚類分離，表明 3 組間

菌群組成差異顯著（圖 3B）。與對(duì)照組相比，DSS 組 alpha 多樣性顯

著下降（ACE 和 Chao 1） （P<0.05）。從門(mén)水平上看，DSS 組中優(yōu)

勢(shì)門(mén)為 Firmicutes，而對(duì)照組和 DSS+2'-FL 組中優(yōu)勢(shì)門(mén)為 Bacteroidetes，

同時(shí) DSS 組 F/B 比值顯著高于對(duì)照組和 DSS+2'-FL 組（P<0.01）。

從總體上看，在種水平，DSS+2'-FL 組腸道菌群與對(duì)照組和 DSS 組具

有顯著差異，Lachnospiraceae NK4A136、Rumincoccaceae_UCG-014、

Iiebacterium valens 和 Lactobacillus reuteri 在 DSS 小鼠豐度最高

（P<0.05），而 Faecalibaculum rodentium、Bifidobacterium animalis 和

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣186﹣

Bacteroides caecimuris 在對(duì)照組和 DSS+2'-FL 組中相對(duì)富集（P<0.05，

圖 4B）。

圖 3 結(jié)腸炎和 2'-FL 處理后腸道菌群組成的變化。A，測(cè)序深度；B，利用 β 多樣性的

Bray-Curtis 度量距離的 PCoA 分析；C，α 多樣性分析；D，物種分布直方圖（門(mén)、科、

種）；E，在門(mén)、科、種水平分析各組間差異菌種

PAS 結(jié)果顯示，2'-FL 可緩解 DSS 引起的杯狀細(xì)胞損耗；細(xì)胞免

疫熒光以及結(jié)腸組織 qPCR 結(jié)果表明，2'-FL 可在蛋白水平和 mRNA

水平上促進(jìn) MUC2 和 NLRP6 表達(dá)。

二、研究進(jìn)展 █

﹣187﹣

圖 4 2'-FL 促進(jìn)粘蛋白的表達(dá)。A，PAS 染色結(jié)果；B，杯狀細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)；C，細(xì)胞

免疫熒光；D，回腸組織 MUC2、TFF3、RETNLB、NLRP6 mRNA 水平表達(dá)量

圖 5 小鼠結(jié)腸組織中 TLR4 相關(guān)通路蛋白表達(dá)水平

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣188﹣

為進(jìn)一步探討 2'-FL 緩解炎癥的機(jī)制，本試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)腸組織中

TLR4、MyD88、NF-kB 和 NLRP6 的表達(dá)，結(jié)果顯示 DSS 組 TLR4、

MyD88、NF-kB、TNF-a 顯著上調(diào)，而 NLRP6 水平顯著下調(diào)（P <0.05）

（圖 5）。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，2'-FL 改善結(jié)腸炎的過(guò)程由腸道微生物介導(dǎo)，

其保護(hù)機(jī)制與杯狀細(xì)胞數(shù)量的恢復(fù)以及促進(jìn) MUC2 的分泌有關(guān)，提

示 2'-FL 具有抑制腸道病變，保護(hù)腸道健康的潛力，是一種極具開(kāi)發(fā)

潛能的功能營(yíng)養(yǎng)因子。

研究成果已發(fā)表在《Frontiers in Nutrition》雜志，該成果由中國(guó)

農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新 工程重大產(chǎn)出科研選題（ CAASZDXT2019004）、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金（CARS-36）和中

國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-IAS12）資助，姚倩倩和范琳琳

為文章第一作者，李慧穎和王加啟為文章通訊作者。

（撰稿人：姚倩倩）

——YAO QIANQIAN, FAN LINLIN, ZHENG NAN, BLECKER

CHRISTOPHE, DELCENSERIE VéRONIQUE, LI HUIYING, WANG

JIAQI. 2'-Fucosyllactose ameliorates inflammatory bowel disease by

modulating gut microbiota and promoting MUC2 expression.

Frontiers in Nutrition. 2022, 9: 822020.

二、研究進(jìn)展 █

﹣189﹣

9. 不同鐵飽和度重組乳鐵蛋白對(duì)幼鼠腸炎損傷的保護(hù)作用

腸道是人體最大的器官之一，有 60%到 70%的免疫細(xì)胞和高度

復(fù)雜的免疫屏障系統(tǒng)。腸上皮細(xì)胞不僅可以通過(guò)相應(yīng)的信號(hào)通路刺激

炎癥因子和趨化因子的表達(dá)，從而對(duì)外部刺激作出反應(yīng)，還可以招募

更多白細(xì)胞來(lái)殺死和清除受損細(xì)胞或外來(lái)病原體。由于嬰兒的腸道發(fā)

育不成熟，腸道免疫力弱，容易受到細(xì)菌和病毒感染，這可能會(huì)導(dǎo)致

腸道發(fā)育受損，甚至誘發(fā)急性腸炎。急性腸炎是五歲以下兒童發(fā)病和

死亡的第二大原因，每年造成 100 多萬(wàn)人死亡，約占所有嬰幼兒死亡

的 15%。研究發(fā)現(xiàn)，急性腸炎可損傷腸絨毛上皮細(xì)胞，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)吸收

不良，嚴(yán)重影響嬰兒的生長(zhǎng)發(fā)育。乳鐵蛋白（LF）具有多種生物活性，

包括參與鐵代謝、抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌和抗氧化功能，以及免

疫調(diào)節(jié)功能，因此，被認(rèn)為是一種具有巨大研發(fā)前景的乳蛋白。由于

LF 能夠穩(wěn)定可逆地結(jié)合兩種鐵離子（Fe3+），因此認(rèn)為 LF 具有兩種

不同的鐵結(jié)合狀態(tài)：缺鐵型乳鐵蛋白（apo-LF）和鐵飽和型乳鐵蛋白

（holo-LF）。研究發(fā)現(xiàn)，鐵飽和度不同會(huì)影響其活性功能。然而，LF

鐵飽和度在保護(hù)嬰兒腸道炎癥中的作用尚未明確。因此，本研究構(gòu)建

了脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的體內(nèi)腸道損傷模型和體外原代腸上皮細(xì)胞模

型，用不同鐵飽和度 LF 干預(yù)腸炎損傷，模擬研究 LF 對(duì)嬰幼兒腸炎

損傷的保護(hù)作用，篩選出最優(yōu)鐵飽和度的乳鐵蛋白，并解析 LF 發(fā)揮

作用的機(jī)理。

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣190﹣

1 試驗(yàn)方法

在本研究中，我們首先通過(guò)構(gòu)建 LPS 誘導(dǎo)幼鼠腸炎模型，用不同

鐵飽和度乳鐵蛋白干預(yù)，通過(guò)表型試驗(yàn)篩選出最優(yōu)類型的乳鐵蛋白為

缺鐵型乳鐵蛋白，即 apo-LF。因?yàn)槟c上皮細(xì)胞的狀態(tài)與腸道免疫能力

直接相關(guān)，所以繼續(xù)對(duì)幼鼠腸道進(jìn)行原代腸上皮細(xì)胞的分離和鑒定，

使用原代腸上皮細(xì)胞的目的是更好的模擬腸道環(huán)境，構(gòu)建 LPS 誘導(dǎo)

的腸上皮細(xì)胞炎癥模型，選用模型中篩選的最優(yōu)飽和度的 LF，即 apoLF 進(jìn)行細(xì)胞試驗(yàn)驗(yàn)證，用不同濃度 LF 干預(yù)細(xì)胞炎癥模型，篩選出最

合適的 LF 的濃度，并利用 Q-PCR 及 Western blot 試驗(yàn)驗(yàn)證出 LF 作

用的通路，解析相關(guān)的機(jī)理。

重組乳鐵蛋白（holo-LF）購(gòu)自 SIGMA（L1294-1G，純度：≥ 90%，

中國(guó)上海）。以 holo-LF 為基礎(chǔ)，根據(jù)專利“制備具有所需鐵飽和度的

乳鐵蛋白的方法”制備 apo-LF。將 pH 值為 2 的檸檬酸鹽緩沖液（0.5

M）加入 holo-LF 溶液（0.1 M），并將檸檬酸鹽緩沖液與 holo-LF 的

摩爾體積比提高至 3:1，然后將溶液 pH 值調(diào)節(jié)至 5，然后將乳鐵蛋白

溶液制成鐵飽和度為 4.1%的樣品，在本研究中被視為 apo-LF。LPS

（L8880-10 mg）的純度≥ 99%和炎性細(xì)胞因子試劑盒（幼鼠 IL1βELISA 試劑盒、幼鼠 IL-6 ELISA 試劑盒、幼鼠 TNF-αELISA 試劑

盒和幼鼠 IFNγELISA 試劑盒）購(gòu)自北京 Solarbio 科技有限公司（中

國(guó)北京）。蘇木精-伊紅（HE）和 3,3'-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色試

劑盒來(lái)自武漢塞維利亞生物技術(shù)有限公司（中國(guó)武漢）。

48 只體重約 13 克的兩周齡雄性 C57BL/6J 幼鼠購(gòu)自北京維通利

華試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（中國(guó)北京；許可證號(hào) scxk 2012-0001）。

二、研究進(jìn)展 █

﹣191﹣

將幼鼠隨機(jī)分為 6 組：apo-LF 組、holo-LF 組、LPS 組、apo-LF+LPS

組、holo-LF+LPS 組和對(duì)照組，每組 8 只（n=8）。在 14 天的試驗(yàn)期

間，apo-LF 組和 holo-LF 組的幼鼠每天灌胃 LF（100 mg/kg 體重）。

LPS 治療組幼鼠在第 10-14 天每天腹腔注射 LPS（10 mg/kg 體重）。

Apo-LF+LPS 治療組和 holo-LF+LPS 治療組幼鼠每天灌胃 LF（100

mg/kg 體重），持續(xù) 1-14 天，這些幼鼠也在第 10-14 天每天腹腔注射

LPS（10 mg/kg）。對(duì)照組幼鼠正常喂養(yǎng)。第 15 天，將幼鼠處死，收

集其結(jié)腸和腸組織。在正式試驗(yàn)之前，這些幼鼠通常適應(yīng)飼養(yǎng) 3 天。

本研究中的方案是中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)（中國(guó)北京；

許可號(hào)：IAS202104）批準(zhǔn)的方案，符合國(guó)際公認(rèn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和

使用原則（NRC，2011）。外科手術(shù)在乙醚吸入麻醉下進(jìn)行，并盡一

切努力將幼鼠的痛苦降至最低。

2 試驗(yàn)結(jié)果

在動(dòng)物模型中，通過(guò)幼鼠的 DAI 評(píng)分、結(jié)腸長(zhǎng)度、結(jié)腸炎癥因子

的檢測(cè)、腸道中 LPS 濃度檢測(cè)等指標(biāo)，研究結(jié)果表明，holo-LF 及 apoLF 組與 LPS 組相比，幼鼠的疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）升高、結(jié)腸組織

長(zhǎng)度增長(zhǎng)和組織病理學(xué)評(píng)分顯著降低。與 LPS 組相比，幼鼠腸道內(nèi)

LPS 濃度和革蘭氏陰性菌菌落數(shù)量顯著降低，結(jié)腸組織中促炎因子的

表達(dá)水平下調(diào)。HE 染色的試驗(yàn)結(jié)果也證明 LF 干預(yù)幼鼠腸道炎癥后，

其炎性浸潤(rùn)顯著減少。并且 apo-LF 與 holo-LF 相比，apo-LF 緩解腸

炎損傷的效果最優(yōu)。用 DAB 染色試驗(yàn)初步驗(yàn)證了 apo-LF 的保護(hù)腸道

炎癥損傷的作用，并初步確定了 LF 發(fā)揮作用的機(jī)制。

█ MRT 2022 年度報(bào)告

﹣192﹣

圖 A1：幼鼠結(jié)腸長(zhǎng)度比較；A2：幼鼠結(jié)腸 HE 染色分析；B：幼鼠結(jié)腸組織中炎癥因

子水平；C：幼鼠結(jié)腸 DAB 染色分析