83

區(qū)、內(nèi)含子和非編碼區(qū)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，由圖 3 可

知，荔枝 LcALMTs 外顯子數(shù)目在 3~10 個(gè)，其中

LcALMT12 外顯子數(shù)目最多（10 個(gè)）；LcALMT1、

LcALMT3、LcALMT4、LcALMT5、LcALMT6、LcALMT8

和 LcALMT15 均 含 有 6 個(gè) 外 顯 子，LcALMT7、

表 3 LcALMTs 蛋白二級結(jié)構(gòu)

Table 3 Secondary structure of LcALMT proteins

蛋白

Protein

氨基酸數(shù)量 / 占比 Amino acid number/Proportion

α- 螺旋

Alpha helix

延伸鏈

Extended strand

無規(guī)則卷曲

Random coil

β 轉(zhuǎn)角

Beta bridge

LcALMT1 276/65.25% 51/12.06% 83/19.62% 13/3.07%

LcALMT2 80/50.31% 31/19.50% 37/23.27% 11/6.92%

LcALMT3 292 /59.47% 50/10.18% 134/27.29% 15/3.05%

LcALMT4 315/58.99% 61/11.42% 146/27.34% 12/2.25%

LcALMT5 330/57.29% 58/10.07% 176/30.56% 12/2.08%

LcALMT6 299/55.68% 63/11.73% 161/29.98% 14/2.61%

LcALMT7 266/67.86% 38/9.69% 77/19.64% 11/2.81%

LcALMT8 305/60.52% 57/11.31% 129/25.60% 13/2.58%

LcALMT9 309/64.24% 54/11.23% 103/21.41% 15/3.12%

LcALMT10 267/59.60% 60/13.39% 97/21.65% 24/5.36%

LcALMT11 75/63.56% 14/11.86% 22/18.64% 7/5.93%

LcALMT12 471/58.66% 89/11.08% 214/26.65% 29/3.61%

LcALMT13 186/59.62% 32/10.26% 84/26.92% 10/3.21%

LcALMT14 99/54.70% 24/13.26% 44/24.31% 14/7.73%

LcALMT15 345/60.85% 59/10.41% 152/26.81% 11/1.94%

LcALMT16 282/57.32% 50/10.16% 282/57.32% 15/3.05%

圖 2 LcALMTs 蛋白三級結(jié)構(gòu)

Fig. 2 Tertiary structure of LcALMT proteins

圖 3 荔枝 LcALMTs 基因結(jié)構(gòu)

Fig. 3 Gene structure of LcALMTs in litchi

LcALMT10、LcALMT11、LcALMT14 基因均不含有

非編碼區(qū)。

利用 MEME 在線網(wǎng)站分析保守基序，基序

數(shù)量上限設(shè)置為 12，其他參數(shù)不變，結(jié)果（圖

4A） 顯 示， 有 13 個(gè) LcALMTs 蛋 白 均 含 有 motif

1；除 LcALMT11 外，其他蛋白均含有 motif 4；

LcALMT11 和 LcALMT14 僅含有 2 個(gè)保守基序，

分 別 為 motif 11、motif 5 和 motif 6、motif 4。 由

NCBI 網(wǎng)站分析得知荔枝 ALMT 家族含有 ALMT

和 ALMT superfamily 兩 個(gè) 結(jié) 構(gòu) 域， 由 圖 4B 可

知，15 個(gè) LcALMTs 蛋白均只含有 1 個(gè)結(jié)構(gòu)域，

而 LcALMT12 包含上述 2 個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中 ALMT

superfamily 結(jié)構(gòu)域位于 N 端、ALMT 結(jié)構(gòu)域位于

C 端。由 SMART（http://smart.embl.de/）網(wǎng)站分析

可知，motif 1~motif 7 均屬于 ALMT 結(jié)構(gòu)域，motif

8~motif 12 未知。

2.4 荔枝 LcALMTs 的染色體定位分析

染色體定位分析結(jié)果（圖 5）表明，LcALMT

基因家族只定位在荔枝 15 條染色體中的 6 條染色

體上，其中 LcALMT1 和 LcALMT2 定位在 Chr3 上，

84

LcALMT3、LcALMT4和LcALMT5定位在 Chr10 上，

LcALMT6、LcALMT15 和 LcALMT16 分別定位在

Chr12、Chr14 和 Chr15 上，Chr13 上 LcALMT 蛋

白分布最多且緊密。

2.5 荔枝 LcALMTs 啟動子上順式作用元件分析

利用 Plantcare 在線網(wǎng)站對 LcALMTs 基因 5′

端上游 2 000 bp 的序列預(yù)測順式作用元件，除

去一般性調(diào)控轉(zhuǎn)錄元件（如 TATA-box、CAATbox）等未知功能元件外，共發(fā)現(xiàn) 536 個(gè)順式作

用元件，其中光響應(yīng)元件最多、共有 219 個(gè)（占

40.86%），荔枝 LcALMTs 基因均至少含有 5 個(gè)光

響應(yīng)元件，如 TCT-motiff、G-box、Box4 和 AT1-

motif 等（圖 6）。其次是激素響應(yīng)元件、共有

216 個(gè)（占 40.30%），主要包括脫落酸響應(yīng)元件

（ABRE）、水楊酸響應(yīng)元件（TCA-element）、

茉莉酸甲酯響應(yīng)元件、赤霉素響應(yīng)元件和生長素

響應(yīng)元件。其中 LcALMT7 含有的茉莉酸甲酯響

應(yīng)元件最多、有 94 個(gè)。整個(gè) LcALMT 家族成員中，

LcALMT4 不含脫落酸響應(yīng)元件。生長發(fā)育元件有

30 個(gè)（5.60%），主要包括胚乳表達(dá)元件、玉米

醇溶蛋白代謝調(diào)節(jié)相關(guān)元件、柵欄葉肉細(xì)胞分化

元件、種子特異性調(diào)控元件和參與細(xì)胞周期調(diào)控

元件。非生物脅迫元件有 44 個(gè)（8.21%），主要

包括防御應(yīng)激響應(yīng)元件 TC-rich repeats、無氧誘

導(dǎo)相關(guān)元件 ARE、低溫響應(yīng)元件 LTR 和誘導(dǎo)子激

活元件。其他元件有 27 個(gè)（5.04%），包括光響

應(yīng) MYB 結(jié)合位點(diǎn)、干旱脅迫誘導(dǎo) MYB 結(jié)合位點(diǎn)、

蛋白結(jié)合位點(diǎn)、ATBP-1 結(jié)合位點(diǎn)和 MYBHv1 結(jié)

合位點(diǎn)。以上結(jié)果表明，荔枝 LcALMTs 成員可能

具有差異化的生物學(xué)功能，參與荔枝的光響應(yīng)、

激素響應(yīng)、生長發(fā)育與脅迫響應(yīng)等相關(guān)過程。

2.6 荔枝 LcALMTs 的組織表達(dá)

從荔枝基因組數(shù)據(jù)庫中 LcALMT 家族成員

在不同組織中的表達(dá)量（圖 7）來看，LcALMT5

和 LcALMT15 在不同組織中都有表達(dá)且表達(dá)量均

較高，其中 LcALMT5 在雄花中的表達(dá)量最高，

LcALMT15 在假種皮中的表達(dá)量最高、是果皮中

的 16.9 倍。LcALMT10 和 LcALMT14 在荔枝的各

組織中均未檢測出表達(dá)。LcALMT3 只在雄蕊中

有表達(dá)，且表達(dá)量極低。LcALMT4 在種子中的

圖 4 荔枝 LcALMTs 蛋白保守結(jié)構(gòu)域

Fig. 4 Conservative domains of LcALMT proteins in Litchi

圖 5 荔枝 LcALMTs 基因染色體定位

Fig. 5 Chromosomal localization of LcALMT genes in Litchi

85

圖 6 荔枝 LcALMTs 啟動子上順式作用元件分析

Fig. 6 Analysis of cis-regulatory elements on LcALMTs promoter in Litchi

圖 7 荔枝 LcALMTs 基因表達(dá)模式分析

Fig. 7 Expression patterns analysis of LcALMT genes in Litchi

表達(dá)量最高、是葉中表達(dá)量的 13.6 倍，在不育

雄蕊中未檢測出表達(dá)。挑取 LcALMT 家族成員中

表達(dá)量較高的 3 個(gè)基因 LcALMT4、LcALMT5 和

LcALMT15 進(jìn)行熒光定量驗(yàn)證，分析妃子笑不同

組織（根、嫩葉、老葉、雄花、雌花、果皮、果

柄）中 LcALMTs 的表達(dá)情況，以根的表達(dá)量為

1、各基因在各部位下的表達(dá)量與其比較進(jìn)行定

量，結(jié)果（圖 8）顯示，LcALMT4、LcALMT5 和

86

LcALMT15 在不同組織中均有表達(dá)，但存在表達(dá)

量的差異。LcALMT4、LcALMT5 和 LcALMT15 均

在雄花中表達(dá)最高、其次為雌花。LcALMT5 的表

達(dá)水平與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果較為一致。

3 討論

本研究對荔枝 ALMT 基因的全基因組進(jìn)行鑒

定與表達(dá)分析，對其部分功能進(jìn)行預(yù)測，可為研

究荔枝生物學(xué)功能奠定一定基礎(chǔ)。ALMT 廣泛存

在于植物中，參與植物的生理過程，其功能也相

應(yīng)被探索，如植物耐鋁性［17-19］、礦質(zhì)營養(yǎng)［20-21］、

果實(shí)酸度［22-23］、氣孔運(yùn)動［24-27］、參與種子發(fā)

育［28-29］等。第 1 個(gè)植物基因 TaALMT1［6］被發(fā)現(xiàn)

后，越來越多的 ALMT 家族成員在不同植物中也

相應(yīng)被研究，但在荔枝中未見到 ALMT 基因家族

的報(bào)道。本研究從荔枝基因庫得到 ALMT 數(shù)據(jù)，

對其 ALMT 家族成員進(jìn)行鑒定，并系統(tǒng)分析該家

族成員的蛋白理化性質(zhì)、系統(tǒng)發(fā)育、基因結(jié)構(gòu)、

染色體定位、保守基序、順式作用元件、蛋白結(jié)

構(gòu)和表達(dá)模式等。

從荔枝基因組中鑒定出 16 個(gè)LcALMTs基因，

數(shù)量與草莓相同、多于擬南芥（14 個(gè)）［9］、少

于蘋果 ALMT 家族成員［14］。荔枝 ALMT 家族成

員均定位于質(zhì)膜上，與蘋果中 MdALMT13 在煙草

亞細(xì)胞定位結(jié)果［15］一致，均定位于質(zhì)膜上。荔

枝 ALMT 家族成員外顯子數(shù)目在 3~10 個(gè)，蘋果

中 ALMT 家族成員外顯子數(shù)量為 4~12 個(gè)［15］，則

兩者之間外顯子數(shù)量差距較大，這可能是荔枝在

進(jìn)化過程中發(fā)生了外顯子的缺失。染色體只定位

在荔枝 15 條染色體中的 6 條染色體上，Chr13 上

LcALMTs 分布最多且緊密，與蘿卜 ALMT 家族成

員定位在 9 條染色體上有差異［18］，具體原因還

需進(jìn)一步探究。荔枝 ALMT 基因家族成員含有多

種順式作用元件，均包含光響應(yīng)元件，激素響應(yīng)

元件生長發(fā)育元件，且光響應(yīng)元件數(shù)量最多，暗

示 LcALMTs 基因的表達(dá)可能受光照、激素調(diào)節(jié)和

生長發(fā)育條件的影響且受光照影響最大，這與前

人在其他物種中的研究結(jié)果一致。LcALMT7 基因

含茉莉酸響應(yīng)元件最多、達(dá) 94 個(gè)，表明該基因

的表達(dá)量可能主要受茉莉酸的調(diào)控，故不同基因

成員之間表達(dá)量不同主要與光照、激素調(diào)控，與

生長發(fā)育條件有著巨大關(guān)系。該家族成員蛋白結(jié)

構(gòu)中 α- 螺旋占比最高，位于同一亞族的 ALMT

蛋白一般結(jié)構(gòu)相似。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，荔枝

ALMTs 蛋白可以分為 5 個(gè)亞族，這與蘿卜 ALMT

家族分類［30］一致。荔枝 ALMT 家族成員在不同

組織中的表達(dá)量不同，LcALMT4 主要在種子中表

達(dá)，與 MdALMT13 主要在根中高度表達(dá)結(jié)果［31］

一 致。 采 用 qRT-PCR 對 LcALMT4、LcALMT5、

LcALMT15 在荔枝不同組織中的表達(dá)水平進(jìn)行檢

測， 結(jié) 果 表 明 LcALMT4、LcALMT5、LcALMT15

在各組織中均有表達(dá)，且在雄花中高度表達(dá)，推

測 LcALMT4、LcALMT5、LcALMT15 可能參與雄

花的調(diào)控，在雄花發(fā)育中起作用。綜上，不同物

種之間的基因在進(jìn)化過程中多數(shù)存在相同或相似

功能，表達(dá)量之間的差異不同，與生長環(huán)境和激

素調(diào)節(jié)相關(guān)聯(lián)。

4 結(jié)論

利用生物信息學(xué)方法從荔枝基因組中鑒定出

圖 8 荔枝 LcALMT4/5/15 相對表達(dá)水平

Fig. 8 Relative expression levels of LcALMT4/5/15 in Litchi

87

16 個(gè) ALMTs 成員，這些成員蛋白均定位于質(zhì)膜

上，染色體定位在荔枝 15 條染色體中的 6 條染色

體上，且在 Chr13 上 LcALMTs 分布最多且緊密。

荔枝 ALMT 基因家族成員啟動子含有多種順式

作用元件，光響應(yīng)元件含量最多；蛋白結(jié)構(gòu)中，

α- 螺旋占比最高；五個(gè)亞族中，位于同一亞族

的 ALMTs 蛋白一般結(jié)構(gòu)相似。其相對表達(dá)量來看

LcALMT4、LcALMT5 和 LcALMT15 在不同組織中

均有表達(dá)，且均在雄花中表達(dá)最高，其次為雌花。

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LI Y H. Study on the function of MdALMT13 in response to drought

and alkali stress in apple［D］. Yangling: Northwest A & F University,

2022.

（責(zé)任編輯 張輝玲）

董晨，碩士，副研究員，中國

熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究

所科研人員，主要從事荔枝資源收

集與評價(jià)、荔枝生理生化分子生物

學(xué)研究。主持海南省自然科學(xué)基金、

中央科研院所基本業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)等項(xiàng)

目，參與國家荔枝龍眼產(chǎn)業(yè)技術(shù)體

系專項(xiàng)、國家自然科學(xué)基金、國家

重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目、國家公益性行

業(yè)科技項(xiàng)目、廣東省自然科學(xué)基金、

廣東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃等項(xiàng)目多個(gè)。

近年來在《Plant Science》《Frontiers in Plant Science》 《BMC

Plant Biology》等期刊發(fā)表學(xué)術(shù)論文多篇。

李偉才，研究員，中國熱帶

農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所荔

枝龍眼研究中心主任及國家荔枝龍

眼產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系湛江綜合試驗(yàn)站站

長，主要從事荔枝龍眼栽培生理及

種質(zhì)資源研究。參與或主持科技部

成果轉(zhuǎn)化、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部跨越計(jì)劃、

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)、

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南亞熱作專項(xiàng)、農(nóng)業(yè)農(nóng)

村部教育部荔枝農(nóng)科教人才培養(yǎng)基

地、國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃和廣東省重

點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃等荔枝科研項(xiàng)目（平臺）20 多項(xiàng)。入選廣東省“揚(yáng)

帆計(jì)劃”培養(yǎng)高層次人才項(xiàng)目（2017）。以第一或通信作者

在《果樹學(xué)報(bào)》等期刊發(fā)表學(xué)術(shù)論文 30 多篇，其中 SCI 期

刊收錄 5 篇。獲海南省科技進(jìn)步三等獎(jiǎng) 1 項(xiàng)，神農(nóng)中華農(nóng)業(yè)

科技一等獎(jiǎng) 1 項(xiàng)，廣東省科技進(jìn)步一等獎(jiǎng) 1 項(xiàng)，廣東省農(nóng)業(yè)

技術(shù)推廣獎(jiǎng)一等獎(jiǎng) 2 項(xiàng)、二等獎(jiǎng) 1 項(xiàng)。以第一完成人獲授權(quán)

國家發(fā)明專利 2 件。

收稿日期：2023-08-18

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（32202465）；廣東省自然科學(xué)基金（2023A1515012687）；韶關(guān)學(xué)院博士科研啟

動項(xiàng)目（99000613）

作者簡介：朱云娜（1982—），女，博士，講師，研究方向?yàn)槭卟松砼c分子生物學(xué)，E-mail：zhuyn326@126.com

通信作者：劉建國（1981—），男，博士，助理實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)閳@藝作物生理生態(tài)，E-mail：jgliu@sgu.edu.cn

廣東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2023，50（9）：89-98

Guangdong Agricultural Sciences DOI:10.16768/j.issn.1004-874X.2023.09.009

朱云娜，楊景輝，王斌，王玉昆，周裕榮，盧威宇，劉建國 . 菜心 BcCIPK23 基因克隆及表達(dá)特性分析［J］. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，

2023，50（9）：89-98.

菜心 BcCIPK23 基因克隆及表達(dá)特性分析

朱云娜，楊景輝，王 斌，王玉昆，周裕榮，盧威宇，劉建國

（廣東省粵北食藥資源利用與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 韶關(guān)學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005）

摘 要：【目的】CIPK23 基 因 在 植 物 生 長 發(fā) 育 和 礦 質(zhì) 營 養(yǎng) 吸 收 中 具 有 重 要 作 用， 但 在 菜 心 中 關(guān) 于

BcCIPK23 基因及其功能的研究尚無報(bào)道，該研究可為探討 BcCIPK23 在菜心植株生長發(fā)育和氮代謝中的生物學(xué)

功能提供理論參考?！痉椒ā恳浴途G 501’菜心為材料，采用同源克隆法克隆到菜心 BcCIPK23 全長序列，

對其編碼蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探究其組織表達(dá)特性和對不同氮源的響應(yīng)?！窘Y(jié)果】菜心 BcCIPK23 基

因 CDS 全長為 1 450 bp，編碼 482 個(gè)氨基酸，分子量是 53.41 kD，理論等電點(diǎn)為 9.28，具有 CIPK 家族成員的

STKc-SnRK3 和 CIPK-C 保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，菜心 BcCIPK23 和白菜 BrCIPK23 進(jìn)化關(guān)系最近。

BcCIPK23 在菜心葉片、葉柄、薹莖、根系、花等組織中均有表達(dá)，但主要集中在葉片、葉柄、薹莖中表達(dá)；

BcCIPK23 表達(dá)也受氮源及其水平的影響，無論供 NO3

- 還是供 NH4

+

，其表達(dá)水平均隨氮濃度增加而降低。推測

該基因在葉片、薹莖發(fā)育和氮素吸收利用中發(fā)揮關(guān)鍵作用?！窘Y(jié)論】菜心 BcCIPK23 為 CIPK 基因家族成員，主

要在葉片等生長活躍的器官高表達(dá)，且可響應(yīng)氮源及氮濃度變化，參與植物生長發(fā)育和氮代謝過程。

關(guān)鍵詞：菜心；BcCIPK23；基因克??；生物信息學(xué)分析；表達(dá)特性

中圖分類號：S634.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1004-874X（2023）09-0089-10

Cloning and Expression Characteristics Analysis of

BcCIPK23 in Flowering Chinese Cabbage

ZHU Yunna, YANG Jinghui, WANG Bin, WANG Yukun, ZHOU Yurong, LU Weiyu, LIU Jianguo

（Guangdong Key Laboratory of Utilization and Conservation of Food and Medicinal Resources in

Northern Region/School of Biology and Agriculture, Shaoguan University, Shaoguan 512005, China）

Abstract: 【Objective】CIPK23 plays an important role in the development and mineral absorption in many plants,

however, there are no relevant reports on CIPK23 gene and its function in flowering Chinese cabbage. The research will

provide some theoretical references for further study of the function of BcCIPK23 in the growth and development and

nitrogen metabolism in flowering Chinese cabbage.【Method】The full-length cDNA sequence of BcCIPK23 was obtained

by homologous cloning method from flowering Chinese cabbage variety ‘Youlv 501’. The encoded BcCIPK23 protein were

analyzed by bioinformatics, and the expression characteristics of BcCIPK23 in different tissues and its response to different

nitrogen sources of flowering Chinese cabbage were analyzed. 【Result】The CDS full length of BcCIPK23 gene in flowering

Chinese cabbage was 1 450 bp, encoding 482 amino acids, with a molecular weight of 53.41 kD, and a theoretical isoelectric

point of 9.28. The BcCIPK23 sequence contained the domains of STKc-SnRK3 and CIPK-C, which were the conserved

domains of CIPK family. The phylogenetic analysis showed that BcCIPK23 from flowering Chinese cabbage was antigenically

closely related to BrCIPK23 from Brassica rapa. The qRT-PCR results showed that BcCIPK23 was expressed in leaves,

90

【研究意義】菜心（Brassica campestris L.

ssp. chinensis var. utilis Tsen et Lee）又名菜薹，

屬于十字花科蕓薹屬蕓薹種白菜亞種［1］，是我

國華南地區(qū)種植面積最大的一種薹莖類蔬菜。菜

心因其生長周期短、適應(yīng)能力強(qiáng)、復(fù)種指數(shù)高、

口感脆嫩、風(fēng)味獨(dú)具一格、營養(yǎng)豐富等眾多優(yōu)點(diǎn)，

受到消費(fèi)者喜愛［2］。然而，像其他綠葉蔬菜一樣，

菜心對氮肥需求量大，提高其氮利用率則對菜心

生產(chǎn)具有重要意義［1, 3］。已有研究表明，跨膜轉(zhuǎn)

運(yùn)蛋白受蛋白磷酸化調(diào)控，蛋白磷酸化在氮信號、

氮代謝等方面發(fā)揮重要作用［4-5］。因此，揭示蛋

白磷酸化機(jī)理對生產(chǎn)中調(diào)控菜心氮素吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、

代謝等過程具有重要的指導(dǎo)意義。CIPK23 激酶

已成為根系響應(yīng)各種環(huán)境脅迫的主要樞紐，在提

高作物產(chǎn)量和品質(zhì)方面具有巨大潛力［6-7］。【前

人研究進(jìn)展】鈣調(diào)磷酸酶 B 類似蛋白的互作蛋

白 激 酶 CIPK（CBL-interacting protein kinase）

是植物特有的一類絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶，含

有 N- 端激酶催化域和 NAF 結(jié)構(gòu)域兩個(gè)典型的

保守結(jié)構(gòu)域［8］。早在 1998 年，Zhu 等［9］采用

遺傳篩選和圖位克隆方法大規(guī)模篩選擬南芥鹽過

敏感（Salt overly sensitive）表型突變體時(shí)就發(fā)現(xiàn)

了 CBL-CIPK 信號系統(tǒng)的相關(guān)基因，并命名為

SOS1（Na+

/H+

antiporter）、SOS2（ CIPK24）和

SOS3（CBL4）， 三 者 形 成 SOS3-SOS2-SOS 復(fù)

合體，從而介導(dǎo)植物非生物脅迫應(yīng)答［9-11］。后

續(xù)研究證實(shí)了擬南芥中存在一種同源基因，與

動物與酵母中的 CNB（B subunit of calcineurin）

和 NCS（Neuronal calcium sensor）具有較高相似

性，且能夠通過介導(dǎo) Ca2+ 來應(yīng)答鹽等脅迫，因

此將該類基因命名為 CBL（Calcineurin B-like）

基因［12-13］。相關(guān)基因家族分析表明，擬南芥中

分別有 25 個(gè) CIPK 和 10 個(gè) CBL 成員［14］；水稻

中分別有 30 個(gè) CIPK 和 10 個(gè) CBL 成員［14-15］。

此后，在玉米、葡萄、大豆、高粱等物種中也報(bào)

道過不同數(shù)量的 CIPK 和 CBL 家族成員［16-19］ 。

除參與高鹽、低溫、干旱等逆境脅迫［20-21］，植

物 CIPK 成員在調(diào)控礦質(zhì)營養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)方面也具有重

要作用［6-7］。前人研究表明，擬南芥 CIPK23、

CBL1/9 受 低 濃 度 NO3

- 誘 導(dǎo) 表 達(dá)， 形 成 CBLCIPK 復(fù) 合 體 調(diào) 控 硝 轉(zhuǎn) 運(yùn) 蛋 白 NPF6.3/NRT1.1

（PTR family 6.3/Nitrate transporter 1.1） 磷 酸 化

水平，從而促進(jìn) NO3

- 的吸收與運(yùn)輸［5］；而在

高 NH4

+ 條件下，擬南芥 CBL1 與 CIPK23 形成復(fù)

合體，通過調(diào)控銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 AMT1.1 和 AMT1.2

（Ammonium transporter）磷酸化水平，從而影

響 植 株 根 系 對 NH4

+ 的吸收與運(yùn)輸［22］。外界

NH4

+ 濃度變化會引起胞漿游離 Ca2+ 含量變化，

影響 CBL 蛋白活性，激活的 CBL 與激酶 CIPK23

結(jié)合形成復(fù)合體，將 CIPK23 轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜上，從

而調(diào)控 AMT1 三聚體的磷酸化水平，進(jìn)一步調(diào)控

細(xì)胞對 NH4

+ 的吸收［23］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，

擬南芥 AtCIPK23 與菜心 BcAMT1.1、BcAMT1.2

存在互作［24］；且菜心 BcCBL1 和 BcCBL9 表達(dá)

受不同氮素形態(tài)響應(yīng)［25］。【本研究切入點(diǎn)】目前，

在菜心中關(guān)于 CIPK23 基因和其功能的研究尚未

有相關(guān)報(bào)道，且菜心 CIPK23 對不同氮素的響應(yīng)

也尚不清楚。【擬解決的關(guān)鍵問題】本文從菜心

中克隆 CIPK23，并對其編碼蛋白的生物學(xué)信息

進(jìn)行分析，研究其組織表達(dá)特性以及對氮源的響

應(yīng)，以期為研究菜心 CIPK23 的生物學(xué)功能以及

對氮素的吸收與運(yùn)輸?shù)忍峁┮欢ǖ睦碚撘罁?jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菜心品種為‘油綠 501’（來自廣州市

農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院），于 2021 年 3—5 月種植于韶

關(guān)學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院生態(tài)園玻璃溫室內(nèi)。

petioles, stalks, roots, flowers and other tissues of flowering Chinese cabbage, but was mainly expressed in leaves, petioles

and stalks. The expression level of BcCIPK23 was significantly affected by different sources and concentrations of nitrogen,

decreased significantly with the increase of NO3

-

or NH4

+

concentration. It was predicted that BcCIPK23 may play a key role in

the growth and development of leaves and stalks, and the absorption and utilization of nitrogen in flowering Chinese cabbage.

【Conclusion】BcCIPK23 is a member of the CIPK gene family, which is highly expressed in leaves and other active organs.

It can respond to changes in nitrogen sources and nitrogen concentrations, and is involved in plant growth and development and

nitrogen metabolic processes.

Key words: flowering Chinese cabbage; BcCIPK23; gene cloning; bioinformatics analysis; expression characteristics

91

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 組織特異性分析 菜心種子用 NaClO 消毒

后，用無菌水沖洗干凈，在育苗海綿塊中育苗，

待幼苗長至三葉一心時(shí)移栽，待植株種子結(jié)莢后，

分別取其根、莖、葉、葉柄、薹莖、花蕾、花、

莢果等組織［25］。每種組織均設(shè) 3 次重復(fù)，所有

樣品均用液氮速凍，放入 -80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 缺氮、供氮處理 菜心移苗后預(yù)培養(yǎng) 4 d，

用去離子水沖洗植株根系，分別對植株進(jìn)行缺氮、

供氮處理。缺氮處理：將植株移至不含任何氮

源的改良霍格蘭營養(yǎng)液［24］中培養(yǎng) 48 h；供氮處

理：缺氮處理后，再移栽到 0.1、1、4、8 mmol/L

NaNO3

/NH4

Cl 不同氮源營養(yǎng)液中處理 2 h 后，分

別取菜心葉片、根系。所有樣品均設(shè) 3 次重復(fù)，

每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取 4~6 株。樣品經(jīng)液氮速凍后，放

在 -80 ℃冰箱備用。

1.2.3 總 RNA 提取與 cDNA 合成 參考 Eastep?

Super 總 RNA 提取試劑盒的說明書提取樣品總

RNA。參考 PrimeScript ? RT reagent Kit with gDNA

Eraser 試劑說明書步驟合成 cDNA。

1.3 測試項(xiàng)目及方法

1.3.1 基因克隆 從 NCBI 數(shù) 據(jù) 庫 搜 索 擬 南 芥

AtCIPK23 基因序列，將該序列在白菜（Brassica

rapa）基因組進(jìn)行 blast 比對，獲得同源性最高

的 CIPK 基 因 BrCIPK23（XM_009104459.3）

序 列 設(shè) 計(jì) 引 物（CIPK23-F：ATGGCTTCTCGA

TCAACAC；CIPK23-R：TCAAGAAGCAGCCACTG

CACC）， 以 菜 心 cDNA 為 模 板 克 隆 BcCIPK23

的 CDS 全長序列。使用 TaKaRa 公司的高保真酶

Prime STAR Max Premix 克隆目的基因片段，PCR

反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性 3 min，98 ℃變性 30

s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，35 個(gè)循環(huán)，

72 ℃延伸 5 min?；厥諗U(kuò)增產(chǎn)物，與 pMD20-T 載

體連接，轉(zhuǎn)化 DH5α，挑選陽性克隆進(jìn)行測序。

1.3.2 生物信息學(xué)分析 利用 ExPASY（https://

web.expasy.org/）在線網(wǎng)站分析菜心 CIPK23 編碼

氨基酸的基本理化性質(zhì)，利用 SWISS-MODEL 分

析其蛋白三維結(jié)構(gòu)，利用 NCBI 網(wǎng)站上 CDD 在線

工具分析其保守結(jié)構(gòu)域，利用 STRING（https://

string-db.org/）分析其互作蛋白網(wǎng)絡(luò)。

1.3.3 qRT-PCR 檢測 將各組織或處理的 cDNA

用 RNase-Free ddH2

O 稀 釋 5 倍 作 為 模 板， 以 序

列（F: CGCAAGGGTCAGTTAGCAGTT，R: ATCA

AGAAGCAGCCACAGTA）為引物，參考 TB GreenR

Premix Ex TaqTM 說 明 書， 利 用 Bio-RAD 公 司 的

CFX connect TM 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀進(jìn)行 qRTPCR 檢測。以 GADPH 和 Actin2 作為內(nèi)參基因［25］，

使用 2-??Ct 方法計(jì)算基因相對表達(dá)量［26］。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜心 BcCIPK23 基因克隆

采用同源克隆方法，以菜心 cDNA 為模板，

以 CIPK23-F、CIPK23-R 為引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，

得到 CDS 片段長度為 1 450 bp 左右，電泳圖如

圖 1 所示。將回收的 PCR 產(chǎn)物與 T 載體連接進(jìn)行

測序，根據(jù)測序結(jié)果分析，所得到的片段長度為

1 449 bp。將該序列在 NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，發(fā)

現(xiàn)該 CDS 片段與擬南芥（NM_001332883）、甘

藍(lán)（XM_013743437）、白菜（XM_009104459）、

甘藍(lán)型油菜（NM_001315872.1）CIPK23 核苷酸序

列相似，相似率分別為 88.41%、96.84%、98.14%

和 96.82%，表明所克隆的基因?yàn)椴诵?CIPK23，

將其命名為 BcCIPK23。

2.2 菜心 BcCIPK23 編碼氨基酸的生物信息學(xué)分析

2.2.1 菜心 BcCIPK23 序列及蛋白理化性質(zhì)分析

對所克隆的菜心 BcCIPK23 序列進(jìn)行開放閱讀

框預(yù)測，結(jié)果表明該基因序列的最大開放閱讀

框 為 1 449 bp， 編 碼 482 個(gè) 氨 基 酸 序 列。 多 重

序列比對結(jié)果顯示，BcCIPK23 與白菜、甘藍(lán)型

油 菜 CIPK23 的 相 似 度 較 高， 分 別 為 98.55%、

98.76%，而與擬南芥 CIPK23 序列的相似性較低、

為 92.50%（圖 2）。

利用 Expasy 在線工具（http://web.expasy.org/）

分析結(jié)果表明，BcCIPK23 的分子量為 53.41 kD，

M：DNA marker；1：BcCIPK23 基因擴(kuò)增條帶

M: DNA marker; 1: BcCIPK23 gene amplification band

圖 1 PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

Fig. 1 Agarose gel electrophoretogram of PCR product

92

BrCIPK23：白菜；BnCIPK23：甘藍(lán)型油菜；AtCIPK23：擬南芥

BrCIPK23: Brassica rapa; BnCIPK23: Brassica napus; AtCIPK23: Arabidopsis thaliana

圖 2 BcCIPK23 編碼的氨基酸序列多重比對

Fig. 2 Multiple alignment of amino acids sequences encoded by BcCIPK23

原子組成為C2379H3824N642O717S16，理論等電點(diǎn)

（pI）為 9.28，脂肪酸系數(shù)為 80.91，不穩(wěn)定性

指數(shù)（Ⅱ）為 32.52，平均親水率為 -0.38。這表

明菜心 BcCIPK23 蛋白是穩(wěn)定的親水性蛋白。利

用 CELLO v.2.5 在線網(wǎng)站（http://cello.life.nctu.edu.

tw/）預(yù)測菜心 BcCIPK23 的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯

示，該蛋白可能定位于細(xì)胞質(zhì)中；通過 TMHMM

2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/ services/

TMHMM-2.0）對該蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)

該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)（圖 3）。

2.2.2 菜心 BcCIPK23 次級結(jié)構(gòu)、親疏水性與磷

圖 3 菜心 BcCIPK23 跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

Fig. 3 Prediction transmembrane domain of BcCIPK23

from flowering Chinese cabbage

93

酸化位點(diǎn)分析 利用 SOPMA 對 BcCIPK23 蛋白二

級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明該蛋白包含 α- 螺旋

（Alpha helix）、β- 折疊（Extended strand）、β轉(zhuǎn) 角（Beta turn） 和 隨 機(jī) 卷 曲（Random coil），

占比分別為 39.42%、15.15%、9.96% 和 35.48%（圖

4A）。該蛋白序列主要為 α- 螺旋和隨機(jī)卷曲，

β- 折疊、β- 轉(zhuǎn)角散布于蛋白結(jié)構(gòu)。使用 SWISSMODEL 在線軟件預(yù)測菜心 BcCIPK23 的三級結(jié)構(gòu)，

同源建模結(jié)果顯示如圖 4B，結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

類似。利用 Protscale 預(yù)測菜心 BcCIPK23 的親疏

水性，結(jié)果表明該蛋白為親水性蛋白（圖 4C）。

利用 SignalP 5.0 預(yù)測菜心 BcCIPK23 氨基酸序列，

結(jié)果表明該氨基酸序列無信號肽，為非分泌型蛋

白。利用 NetPhos 3.1 對 BcCIPK23 潛在磷酸化位

點(diǎn)進(jìn)行分析表明，該序列包含有多個(gè)潛在磷酸化

位點(diǎn)，最多的磷酸化位點(diǎn)為絲氨酸磷酸化位點(diǎn)

（Ser）、達(dá) 27 個(gè)，其次是蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)（Thr）、

為 19 個(gè)，而酪氨酸磷酸化位點(diǎn)（Tyr）為 5 個(gè)（圖

4D），這表明 BcCIPK23 能夠被絲氨酸、蘇氨酸、

酪氨酸激酶磷酸化，從而實(shí)現(xiàn)其功能調(diào)控。

A：蛋白二級結(jié)構(gòu)分析；B：蛋白三級結(jié)構(gòu)分析；C：親疏水性分析；D：蛋白磷酸化位點(diǎn)分析

A: Secondary structure analysis; B: Tertiary structure analysis; C: Analysis of hydrophilicity and hydrophobicity; D: Phosphorylation potential analysis

圖 4 菜心 BcCIPK23 的生物信息學(xué)分析

Fig. 4 Bioinformatic analysis of BcCIPK23 from flowering Chinese cabbage

2.2.3 菜 心 BcCIPK23 保守結(jié)構(gòu)域分析 利用

NCBI 網(wǎng)站 CCD 在線軟件（https://www.ncbi.nlm.nih.

gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）分析 BcCIPK23 蛋

白序列的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果（圖 5）顯示，在該

蛋白的 33~288 位氨基酸區(qū)域是蛋白激酶超家族的

STKc-SnRK3 保守結(jié)構(gòu)域；337~452 位氨基酸區(qū)

域是 CBL 互作蛋白激酶 CIPK-C 末端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域

〔C-terminal regulatory domain of calcineurin B-Like

(CBL)-interacting protein kinases〕，這個(gè)結(jié)構(gòu)域是

CIPK 家族蛋白與 CBL 蛋白相互作用的部位，屬

于腺苷酸激活蛋白激酶超基因家族成員。因此，

推測本研究克隆的菜心 BcCIPK23 所編碼蛋白具

有 CIPK 蛋白功能。

2.3 菜心 BcCIPK23 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將 菜 心 BcCIPK23 與 擬 南 芥、 白 菜、 水

稻等植物中的 CIPK 家族成員的蛋白序列進(jìn)行

Neighbor-Joining 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。結(jié)果（圖 6）

顯示，菜心 CIPK23 與擬南芥、白菜、水稻等物

94

種的 CIPK23 成員聚類在同一分支中，其中菜心

BcCIPK23 與白菜 BrCIPK23、擬南芥 AtCIPK23 的

遺傳距離較近，該分支不包含 CIPK 家族其他成員，

表明植物 CIPK23 成員間的進(jìn)化關(guān)系較近、保守

性較強(qiáng)。

2.4 BcCIPK23 在菜心不同組織器官的表達(dá)分析

由圖 7 可知，菜心 BcCIPK23 在菜心各器官

中均有表達(dá)，且在菜心葉、葉柄、薹莖等組織中

高表達(dá)，顯著高于在其他組織中的表達(dá)量，但 3

個(gè)組織間無明顯差異；該基因在菜心根、莖、花蕾、

花、莢果等組織器官中的表達(dá)量較低，僅為葉片

表達(dá)量的 18.95%~311.93%，菜心 BcCIPK23 在這

些組織中的表達(dá)量無明顯差別。

2.5 菜心 BcCIPK23 對不同氮源的響應(yīng)

由圖 8 可知，無論在菜心根系還是葉片，

BcCIPK23 表達(dá)量均受氮源種類及濃度的影響。

隨著 NO3

- 濃度的增加，BcCIPK23 在菜心根系中

的表達(dá)量呈明顯下降趨勢，與 0.1 mmol/L NO3

- 處

理相比，1~8 mmol/L NO3

- 處理顯著降低了菜心

BcCIPK23 表達(dá)量，僅為 0.1 mmol/L NO3

- 處理下

表 達(dá) 量 的 47.72%~87.43%， 但 4、8 mmol/L NO3

-

處 理 之 間 無 顯 著 差 異（ 圖 8A）； 菜 心 根 系 中

BcCIPK23 對不同濃度 NH4

+ 的響應(yīng)呈現(xiàn)出不同趨

圖 5 BcCIPK23 蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域分析

Fig. 5 Analysis of conserved domains of BcCIPK23 protein sequences

At: Arabidopsis thaliana，擬南芥；Bc: Brassica campestris, 菜心；

Br: Brassica rape，白菜；Os: Oryza sativa, 水稻

圖 6 菜心 BcCIPK23 和其他物種 CIPK 成員的

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

Fig. 6 Phylogenetic analysis of BcCIPK23 in flowering

Chinese cabbage and CIPKs in other species

以菜心根系中的 BcCIPK23 表達(dá)量為 1 計(jì)算各組織中的相對表達(dá)量；

柱上小寫英文字母不同者表示差異顯著（P<0.05）

Relative expression levels in different tissues of flowering Chinese cabbage

were calculated by the expression of BcCIPK23 in root as 1; Different lowercase

letters above the columns represent significant differences (P<0.05)

圖 7 BcCIPK23 在菜心不同組織器官的表達(dá)分析

Fig. 7 Expression analysis of BcCIPK23 in different tissues

of flowering Chinese cabbage

95

A：根；B：葉片；以 0.1 mmol/L NO3

-處理下菜心根系中的BcCIPK23表達(dá)量為 1 計(jì)算各處理中相對表達(dá)量；柱上小寫英文字母不同者表示差異顯著（P<0.05）

A: Root; B: Leaf; Relative expression levels in different treatments of flowering Chinese cabbage were calculated by the expression of BcCIPK23 in

root under 0.1 mmol/L NO3

-

as 1; Different lowercase letters above the columns represent significant differences (P<0.05)

圖 8 菜心 BcCIPK23 對不同氮源種類和濃度的響應(yīng)

Fig. 8 Response of BcCIPK23 in flowering Chinese cabbage to different nitrogen sources and concentrations

勢，與 0.1 mmol/L NH4

+ 處理相比，BcCIPK23 表

達(dá)水平隨 NH4

+ 濃度的增加呈現(xiàn)先增加后降低的變

化趨勢，其中 BcCIPK23 在 1 mmol/L NH4

+ 處理下

表達(dá)量最高、為 0.1 mmol/L NH4

+ 處理的 1.14 倍，

4、8 mmol/L NH4

+ 處理的菜心 BcCIPK23 表達(dá)量

分 別 為 0.1 mmol/L NH4

+ 處 理 的 75.26%、63.07%

（圖 8A）。

在菜心葉片中，BcCIPK23 表達(dá)量也明顯受

不同氮源水平的影響。與 0.1 mmol/L NO3

- 處理相

比，1~8 mmol/L NO3

- 處理可不同程度地降低菜心

BcCIPK23 的表達(dá)水平，降幅為 6.14%~28.40%，

其中 4 mmol/L NO3

- 處理與 0.1 mmol/L NO3

- 處理

之間差異不顯著（圖 8B）；隨著 NH4

+ 濃度的增加，

BcCIPK23在菜心葉片中的表達(dá)量呈現(xiàn)明顯下降趨

勢，1~8 mmol/L NO3

- 處理的菜心 BcCIPK23 表達(dá)

量僅為 0.1 mmol/L NO3

-處理的 39.32%~51.31%（圖

8B）。由此可見，菜心 BcCIPK23 表達(dá)受不同氮

水平及氮源種類的影響，暗示菜心 BcCIPK23 基

因可能與菜心氮素吸收利用相關(guān)。

2.6 菜心 BcCIPK23 互作蛋白網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

選 用 模 式 植 物 擬 南 芥 為 受 體 物 種， 利 用

STRING 在 線 軟 件 繪 制 了 菜 心 BcCIPK23 蛋 白

的互作蛋白網(wǎng)絡(luò)圖。結(jié)果（圖 9）表明，菜心

BcCIPK23 不僅可與植物類鈣調(diào)磷酸酶 B 亞基蛋白

（CBL1、CBL2、CBL3、CBL8、CBL9、CBL10）

存在互作，還可與鉀離子通道蛋白 AKT1、鉀轉(zhuǎn)

運(yùn)蛋白 POT5、硝轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 NPF6.3、銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

AMT1-1 等蛋白存在互作。

3 討論

本研究通過同源克隆從菜心獲得一個(gè)完整的

BcCIPK23 基因，其 CDS 序列全長為 1 450 bp，

編碼 482 個(gè)氨基酸殘基。菜心 BcCIPK23 具有 N端激酶催化域和 NAF 結(jié)構(gòu)域兩個(gè)典型的保守結(jié)

構(gòu)域，屬于 CIPK 基因家族成員。這與前人在甘

AMT1-1：銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 1-1；NPF6.3：硝轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 6.3；CBL1、CBL2、

CBL3、CBL8、CBL9、CBL10：類鈣調(diào)磷酸酶 B 亞基蛋白；

AKT1：鉀通道蛋白 1；POT5：鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 5

AMT1-1: Ammonium transporter 1-1; NPF6.3: Protein NRT1/PTR family 6.3;

CBL1, CBL2, CBL3, CBL9 and CBL10: Calcineurin B-like protein;

AKT1: Potassium channel 1; POT5: Potassium transporter 5

圖 9 菜心 BcCIPK23 的互作蛋白網(wǎng)絡(luò)

Fig. 9 Network for the interaction proteins with

BcCIPK23 in flowering Chinese cabbage

96

蔗、玉米、葡萄、大豆、高粱中報(bào)道的 CIPKs 基

因結(jié)果［16-19］一致。通過進(jìn)化樹分析，所有植物

CIPK23 成員均聚類在同一分支，且該分支不包

含 CIPK 家族的其他成員，表明植物 CIPK23 成

員具有較高的保守性，菜心 BcCIPK23 與擬南芥

AtCIPK23、白菜 BrCIPK23 親緣關(guān)系較近，同源

性均在 92.50% 以上。

前人研究表明，多數(shù) CIPKs 基因在植物不同

組織器官中表達(dá)水平不同，甘蔗 SsCIPK23 基因

在根系中表達(dá)量較高，在葉、莖中表達(dá)量較低［27］；

玉 米 ZmCIPK24-2 基 因 在 雄 蕊、 葉、 莖 中 高 表

達(dá)，而在玉米其他部位低表達(dá)［28］。本研究中，

BcCIPK23 在菜心根、莖、葉、葉柄、薹莖、花蕾、

花、莢果等組織中均有表達(dá)，但其在菜心葉片、

葉柄、薹莖等綠色組織中的表達(dá)量顯著高于根、

莖、花蕾、花、莢果等非綠色組織器官，暗示著

BcCIPK23 可能在菜心組織發(fā)育中發(fā)揮作用。

CIPK 是植物信號傳導(dǎo)中的關(guān)鍵蛋白激酶，

廣泛參與植物生長發(fā)育調(diào)控和干旱、鹽脅迫和營

養(yǎng)脅迫等逆境脅迫應(yīng)答［7, 20-21］。據(jù)研究，擬南芥

AtCIPK23 與 CBL1/9 形成 CBL-CIPK 復(fù)合體參與

擬南芥氮信號通路調(diào)控［22］。本研究結(jié)果表明，

菜心 BcCIPK23 基因表達(dá)水平明顯受 NO3

- 濃度影

響，總體表現(xiàn)為：在低氮（0.1~1 mmol/L）條件

下，無論根系還是葉片，菜心 BcCIPK23 基因表

達(dá)量均最高，隨著供氮水平的增加，其表達(dá)量呈

現(xiàn)出明顯下降趨勢，尤其是 8 mmol/L NO3

- 處理

的菜心根系中 BcCIPK23 表達(dá)量僅為 0.1 mmol/L

NO3

- 水平下的 47.76%。前人研究表明，在低氮條

件下，CIPK23 通過調(diào)控 NRT1.1/NPF6.3 蛋白 Thr101 磷酸化水平，將 NO3

- 由低親和性轉(zhuǎn)化為高親

和性，從而促進(jìn)植物根系對低氮的吸收［5, 7, 29］。

利用 STRING 在線網(wǎng)站預(yù)測，發(fā)現(xiàn)菜心 BcCIPK23

與 NRT1.1/NPF6.3 蛋白也存在互作關(guān)系，故而推

測 CIPK23 在菜心中也可能通過與 NRT1.1/NPF6.3

蛋白互作來調(diào)控 NO3

- 的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。

在植物中，CIPK23 表達(dá)水平除受外界 NO3

-

水平的影響外，還受 NH4

+ 水平的影響［22］。本研

究中，菜心 BcCIPK23 基因表達(dá)水平明顯受不同

濃度 NH4

+ 的影響，除 1 mmol/L NH4

+ 處理下菜心

根系 BcCIPK23 基因表達(dá)量高于 0.1 mmol/L NH4

+

處理外，無論在根系還是葉片中，BcCIPK23 基

因表達(dá)水平均隨著 NH4

+ 濃度的增加呈現(xiàn)出明顯

下降趨勢。在擬南芥中，向缺氮 4 d 的幼苗供 2

mmol/L NH4

+

，AtCIPK23 表達(dá)隨著供 NH4

+ 時(shí)間的

延長而上調(diào)表達(dá)，但在供 NH4

+ 2 h 時(shí)，其表達(dá)水

平才與缺氮 4 d 時(shí)的表達(dá)水平存在顯著差異［22］。

已有研究指出，蛋白激酶 CIPK23 本身不具

有活性，需要與 CBL 結(jié)合形成 CBL-CIPK 復(fù)合

體才具有活性，從而參與植物生長發(fā)育、逆境脅

迫、礦質(zhì)元素吸收等過程［30］。本研究結(jié)果表明，

菜 心 BcCIPK23 與 CBL1、CBL2、CBL3、CBL4、

CBL9、CBL10 等 CBL 基因家族成員存在互作。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)菜心 BcCBL1、BcCBL9

表 達(dá) 水 平 也 明 顯 受 不 同 氮 素 水 平 影 響， 其 中

BcCBL1 表達(dá)隨 NH4

+ 濃度的增加而下降，BcCBL9

隨 NH4

+ 濃度的增加而顯著增加［25］，這與擬南芥

AtCBL1、AtCBL9 的研究結(jié)果并不一致，在擬南

芥中，隨著 NH4

+ 處理時(shí)間延長，前者表達(dá)水平

急劇上調(diào)然后下降，后者表達(dá)水平僅呈現(xiàn)小幅增

加［22］，可能是由于本研究未考慮相同氮濃度處

理不同時(shí)間對其表達(dá)水平的影響。擬南芥突變體

cipk23 植株在供 NH4

+ 后仍能檢測到一定程度的蛋

白磷酸化水平，AMT 蛋白可能還受到其他激酶的

調(diào)控［22］。研究表明，除 CIPK23 外，CIPK15 也

可作為 NH4

+ 受體蛋白參與調(diào)控 AMT 蛋白的磷酸

化水平，從而影響 NH4

+ 的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，以避免高

NH4

+ 環(huán)境對植物所造成的毒害［31］。

由此可見，對 NH4

+

、NO3

- 兩種氮源而言，菜

心 BcCIPK23 表達(dá)均受氮素水平的明顯影響，可

能參與不同氮素條件下氮素吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)等過程，

但在高 NH4

+ 條件下，可能還存在其他 CIPK 蛋白

激酶調(diào)節(jié) AMT 復(fù)合體的磷酸化水平，從而影響根

系對 NH4

+ 的吸收。

4 結(jié)論

本研究從菜心中克隆得到 1 個(gè)新的全長基因

BcCIPK23，屬于 CIPK 基因家族成員，其表達(dá)量

在一定程度上與生長活躍的器官同步變化，暗示

菜心 BcCIPK23 可能在菜心不同組織發(fā)育過程中

發(fā)揮作用；菜心 BcCIPK23 表達(dá)受到不同氮源形

態(tài)及濃度的影響。菜心 BcCIPK23 基因在調(diào)控植

物生長發(fā)育和氮代謝過程中發(fā)揮重要作用，可為

揭示菜心 BcCIPK23 在菜心氮代謝途徑中的作用

提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

97

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（責(zé)任編輯 馬春敏）

朱云娜，博士，講師，農(nóng)藝師，

韶關(guān)學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院專任教師，

主要從事氮素營養(yǎng)對蔬菜生長發(fā)育與

品質(zhì)形成的調(diào)控機(jī)理與應(yīng)用研究。近

5 年主持和參與國家自然科學(xué)基金、

廣東省自然科學(xué)基金、廣東省教育廳

項(xiàng)目、韶關(guān)市科技項(xiàng)目等 12 項(xiàng)。以第

一或通信作者在國內(nèi)外期刊發(fā)表學(xué)術(shù)

論文 20 篇；授權(quán)實(shí)用新型專利 3 件、

外觀專利 2 件。

劉建國，博士，助理實(shí)驗(yàn)師，韶關(guān)

學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心副主任、廣

東綠鄉(xiāng)實(shí)業(yè)博士工作站站長，主要從事土

壤質(zhì)量提升與生物肥料利用研究。近 5 年

主持和參與廣東省自然科學(xué)基金、廣東省

教育廳項(xiàng)目、韶關(guān)市科技項(xiàng)目等 8 項(xiàng)。以

第一或通信作者在國內(nèi)外期刊發(fā)表學(xué)術(shù)

論文 11 篇，參編教材 1 部；獲授權(quán)國家

實(shí)用新型專利 3 件、外觀專利 2 件。

收稿日期：2023-07-09

基金項(xiàng)目：廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2023B03J1322）；國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2019YFD1001003）

作者簡介：周榮（1966—），女，碩士，教授，研究方向?yàn)閳@藝園林植物開發(fā)和利用，E-mail：602597936@qq.com

通信作者：楊鳳璽（1985—），女，博士，研究員，研究方向?yàn)樘m科植物遺傳育種，E-mail：yangfengxi@gdaas.cn

廣東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2023，50（9）：99-107

Guangdong Agricultural Sciences DOI:10.16768/j.issn.1004-874X.2023.09.010

周榮，劉嘉超，楊鳳璽 . 墨蘭 CsAP1-A 基因克隆及表達(dá)分析［J］. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2023，50（9）：99-107.

墨蘭 CsAP1-A 基因克隆及表達(dá)分析

周 榮 1

，劉嘉超 1,2，楊鳳璽 2

（1. 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 佛山 528000；2. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所 /

廣東省園林花卉種質(zhì)創(chuàng)新綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

摘 要：【目的】AP1 基因在植物的花器官發(fā)育和開花調(diào)控中發(fā)揮重要作用，對墨蘭 AP1 基因進(jìn)行克隆與

表達(dá)分析可為研究其在墨蘭花發(fā)育和開花調(diào)控中的作用提供前期基礎(chǔ)?！痉椒ā恳阅m品種‘小香’為材料，

克隆到 1 個(gè) AP1 基因，命名為 CsAP1-A。通過生物信息學(xué)分析其基因結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)域和進(jìn)化關(guān)系，利用 RTqPCR 方法分別檢測 CsAP1-A 在墨蘭不同器官、不同花發(fā)育階段和不同花組織部位的表達(dá)情況；通過轉(zhuǎn)錄組測

序分析 CsAP1-A 在 5 個(gè)不同花型墨蘭品種花組織部位的表達(dá)情況；通過蛋白互作預(yù)測軟件分析 CsAP1-A 與其他

蛋白的互作關(guān)系?！窘Y(jié)果】CsAP1-A 基因編碼區(qū)為 744 bp，編碼 248 個(gè)氨基酸，含有高度保守的 MADS-box 和

K-box 結(jié)構(gòu)域，符合 MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子家族特征。CsAP1-A 與其他蘭科植物 AP1 蛋白相似性較高，其中與春

蘭 AP1/FUL3（APY18447.1）和蕙蘭 MADS1（AGE15496.1）的同源性最高。RT-qPCR 分析結(jié)果表明，CsAP1-A

在墨蘭不同器官中均有表達(dá)，在花中表達(dá)量最高，且集中在花芽分化初期（S1）高表達(dá)。在不同花型的墨蘭品

種中，CsAP1-A 在 WT（普通型）、MPV（重瓣花型）、LaPV（花瓣唇瓣化花型）和 NLV（唇瓣萼片化花型）

4 種花型的合蕊柱中表達(dá)量均最高，而在萼片中表達(dá)量最低；在合蕊柱異常發(fā)育的 MPV 中，CsAP1-A 在合蕊柱

的表達(dá)量顯著提高，而在花瓣蕊柱化的梅瓣花型（GPV）中整體表達(dá)量最高，且表達(dá)區(qū)域從合蕊柱擴(kuò)展到花瓣。

蛋白互作預(yù)測 CsAP1-A 蛋白可與 MADS1、MADS6、MADS47、MADS8 等 10 個(gè)蛋白存在互作關(guān)系?！窘Y(jié)論】墨

蘭 CsAP1-A 的基因結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、時(shí)空表達(dá)情況和蛋白互作預(yù)測可為墨蘭花發(fā)育的研究提供理論依據(jù)，對進(jìn)

一步揭示 CsAP1-A 基因在墨蘭成花過程中的作用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：墨蘭；CsAP1-A 基因；生物信息學(xué)；表達(dá)分析；花器官發(fā)育

中圖分類號：S682.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1004-874X（2023）09-0099-09

Analysis on Cloning and Expression of CsAP1-A Gene in

Cymbidium sinense

ZHOU Rong1

, LIU Jiachao1,2, YANG Fengxi2

（1. Foshan University , Foshan 528000, China; 2.Environmental Horticulture Research Institute,

Guangdong Academy of Agricultural Sciences / Guangdong Key Laboratory of Ornamental Plant Germplasm

Innovation and Utilization, Guangzhou 510640, China）

Abstract: 【Objective】AP1 gene plays an important role in the development of floral organs and regulation of

flowering in plants. The analysis on cloning and expression of the AP1 gene of Cymbidium sinense can provide a preliminary

foundation for the study of its role in the development of C. sinense flowers and the regulation of flowering.【Method】An

AP1 gene, named CsAP1-A, was cloned from the C. sinense variety ‘Xiao Xiang’, and its gene structure, protein structural

domains and evolutionary relationship were analyzed by bioinformatics. RT-qPCR was used to detect the expression of

100

【研究意義】墨蘭（Cymbidium sinense）是

我國國蘭的典型代表之一，在福建、廣東、臺

灣廣泛分布。墨蘭葉型獨(dú)特，花姿優(yōu)美，花香

馥郁，花期長（9 月至翌年 3 月），具有很高的

觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值［1–3］，產(chǎn)品遠(yuǎn)銷韓國、日

本等地。開花性狀是墨蘭最重要的育種目標(biāo)，

而 APETALA1（AP1）基因在植物成花轉(zhuǎn)變和花

器官發(fā)育過程中具有非常關(guān)鍵的作用［4］。開展

墨蘭 AP1 基因的克隆和表達(dá)分析研究，對探究

墨蘭開花過程中的分子調(diào)控機(jī)制具有重要意義。

【前人研究進(jìn)展】MADS-box 基因家族是一類在

植物中廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子家族，可與其他轉(zhuǎn)錄

因子和調(diào)控因子相互作用，共同在植物花器官分

化、果實(shí)發(fā)育和開花調(diào)控等方面起作用。MADSbox 基因家族通常分為兩個(gè)亞家族（Type Ⅰ和

Type Ⅱ），其中 Type Ⅱ亞家族基因編碼的蛋白質(zhì)

均有 1 個(gè)特征性結(jié)構(gòu)域 K，能夠折疊形成 3 個(gè) α

螺旋結(jié)構(gòu)，介導(dǎo) MADS-box 蛋白之間形成二聚體，

通過蛋白復(fù)合體共同調(diào)控下游靶基因。以 Type Ⅱ

類 MADS-box 基因?yàn)楹诵臉?gòu)成的花發(fā)育 ABCDE

模型決定植物花器官的發(fā)育［5-6］。A 類基因主要

影響花朵的外輪花器官發(fā)育，同時(shí)與 E 類基因共

同參與萼片的發(fā)育，并與 B 類基因和 E 類基因共

同調(diào)控花瓣的形成和特化。AP1 屬于 A 類基因，

其突變或過表達(dá)都會對植物的開花時(shí)間和花器官

產(chǎn)生顯著影響［7-8］。在擬南芥中，過表達(dá) AP1 可

使擬南芥提前 1 周左右開花［9］。AP1 同時(shí)可以抑

制最外輪花器官萼片葉腋處形成更多花原基。另

外，AP1 可以分別通過抑制細(xì)胞分裂素合成基因

和激活細(xì)胞分裂素降解酶，減少 AP1 基因表達(dá)區(qū)

域的細(xì)胞分裂素含量，從而維持正?；ǚ稚M織

的有限生長。目前，建蘭（C. ensifolium）［10］、

石 斛（Dendrobium Chao Praya Smile）［11］、 萼

脊 蘭（Sedirea japonica）［8］、 牡 丹（Paeonia

suff ruticosa）［12］、荔枝（Litchi chinensis）［13］、

大豆（Glycine max）［14］等多種植物的 AP1 基因

已被成功克隆，研究發(fā)現(xiàn)，它們在花器官的形成

和花期調(diào)控中起著非常重要的作用?！颈狙芯壳?/p>

入點(diǎn)】目前關(guān)于墨蘭 AP1 基因的研究報(bào)道甚少，

該基因在墨蘭上的功能表現(xiàn)也尚未清楚。因此，

本研究以墨蘭為研究對象，克隆并鑒定到 1 個(gè)墨

蘭 AP1 基因（命名為 CsAP1-A），并進(jìn)行基因表

達(dá)模式分析［15］。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究

克隆墨蘭 CsAP1-A 基因，通過生物信息學(xué)分析

其基因結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)域和進(jìn)化關(guān)系，利用 RTqPCR 方法分別檢測 CsAP1-A 在墨蘭不同器官、

不同花發(fā)育階段和不同花組織部位的表達(dá)情況，

通過轉(zhuǎn)錄組測序分析 CsAP1-A 在 5 個(gè)不同花型墨

蘭品種花組織部位的表達(dá)情況，并采用蛋白互作

預(yù)測軟件分析 CsAP1-A 與其他蛋白的互作關(guān)系，

為進(jìn)一步研究 CsAP1-A 在墨蘭花發(fā)育過程的功能

奠定基礎(chǔ)。

CsAP1-A in different organs, flower development stages and flower tissue parts, respectively, and the expression of CsAP1-A

in flower tissues of five different flower types of C. sinense was analyzed by RNA-seq. The interactions between CsAP1-A and

other proteins were analyzed by the Protein Interaction Prediction Software.【Result】The coding region of CsAP1-A gene was

744 bp, encoding 248 amino acids, with highly conserved MADS-box and K-box structural domains, which is in line with the

characteristics of the MADS-box family of transcription factors. The protein sequence comparison revealed that the similarity

between CsAP1-A and the AP1 proteins of other orchid plants was relatively high, among which the highest homology was found

with the AP1/FUL3（APY18447.1） of C. goeringii and MADS1 (AGE15496.1) of C. faberi. RT-qPCR showed CsAP1-A

was expressed in different organs of C. sinense, the highest expression was in flowers, and concentrated in stage of early

flower development (S1). In the five varieties with different floral patterns, the expression of CsAP1-A in common type variety

(WT), multi-perianth variety (MPV), labellum-like petal variety (LaPV) and null-labellum variety (NLV) were the highest in

gynostegiums and the lowest in sepals. CsAP1-A was significantly up-regulated expression in MPV with abnormal development

of gynostegium. The overall expression was the highest in gynostegium-like petal variety (GPV), and the expression area

expanded from gynostegium to petal. Protein interactions predicted that CsAP1-A could interact with 10 proteins, including

MADS1, MADS6, MADS47 and MADS8 etc. 【Conclusion】The gene structure, evolutionary relationship, spatio-temporal

expression and protein interaction prediction of CsAP1-A can provide theoretical basis for the study of flower development in C.

sinense, and lay a foundation for further revealing the role of CsAP1-A gene in flower formation of C. sinense.

Key words: Cymbidium sinense; CsAP1-A gene; bioinformatics; expression analysis; flower development

101

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

基因克隆、表達(dá)分析供試的墨蘭品種為‘小

香’，栽培于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所

國家墨蘭種質(zhì)資源圃內(nèi)。挑選 3 株長勢良好的墨

蘭，采集其花芽、成熟花器官及根、莖、葉和果

各 3 g 左右，用液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

不同花型轉(zhuǎn)錄組測序分析供試的 5 個(gè)墨蘭

品種為‘瑞金’（WT 普通花型）、‘安康梅’

（花瓣蕊柱化的梅瓣花型，Gynostegium-like petal

variety，GPV）、‘ 大 圣 ’（ 重 瓣 花 型，Multi

perianth variety，MPV）、‘金鳳蝶’（花瓣唇瓣

化花型，Labellum -like petal variety，LaPV）和‘六

瓣花’（唇瓣萼片化花型，Null-labellum variety，

NLV），均來源于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研

究所國家墨蘭種質(zhì)資源圃。采集的花朵立即用液

氮速凍處理。

DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞、熒光定量試劑盒（Taq

Pro Universal SYBR qPCR Master Mix）、高保真酶

試劑盒（2×Phanta Flash Master Mix）、產(chǎn)物純化

試劑盒（FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit）、

克隆載體試劑盒（5 min TA/Blunt Cloning Kit）和

RNA 提 取 試 劑 盒（FastPure Universal Plant Total

RNA Isolation Kit），均購自南京諾唯贊生物科技

股份有限公司。

1.2 總 RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄

用多糖多酚植物 RNA 提取試劑盒提取墨蘭

花芽的 RNA，操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)

行。使用蛋白核酸分析儀檢測 RNA 濃度，使用 1%

瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 質(zhì)量，將檢測合格的

RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到 cDNA。

1.3 目的基因克隆

以前期基因組測序得到的 CsAP1-A CDS 為

參考序列，使用 NCBI 設(shè)計(jì)基因克隆的 PCR 引

物：CsAP1-A-F 5'ATGGGAAGAGGGAGGGTT3'、

CsAP1-A-R 5'TTATCCATTCATATGAGTGAGC3'。

以墨蘭花芽 cDNA 為模板，按照高保真酶試劑盒

說明書操作進(jìn)行 CsAP1-A 基因克隆，PCR 體系為

50 μL，反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性 30 s；98 ℃預(yù)變

性 10 s、58 ℃退火 5 s、72 ℃延伸 5 s，34 個(gè)循環(huán)；

72 ℃延伸 1 min。擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后與 TA 克隆

載體連接，轉(zhuǎn)化到 DH5α 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng)，

次日挑選陽性菌液送至生工生物工程（上海）股

份有限公司測序，得到 CsAP1-A 基因完整序列。

1.4 CsAP1-A 生物信息學(xué)分析

使用 Expasy-ProtParam（https://www.expasy.org/）

分析 CsAP1-A 蛋白的分子量大小、親水性等理

化性質(zhì)；使用 NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

Structure/cdd/wrpsb.cgi） 分 析 CsAP1-A 的 保 守 結(jié)

構(gòu)域；使用 DNAMAN 軟件將 CsAP1-A 與 6 個(gè)同

源蛋白進(jìn)行多序列比對；使用 Mega6.0 軟件的鄰

接法構(gòu)建 CsAP1-A 系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 CsAP1-A 基因表達(dá)分析

使用 RT-qPCR 方法對 CsAP1-A 在墨蘭不同

器官（根、莖、葉、花、果）、不同花發(fā)育階段（花

芽分化初期 S1、花芽分化發(fā)育期 S2、花梗伸長期

S3、排鈴期 S4 和開花期 S5）和不同花組織部位（萼

片、花瓣、唇瓣、合蕊柱）的表達(dá)進(jìn)行分析。以

CsActin 作為內(nèi)參基因（表 1），PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，

40 個(gè)循環(huán)?；虮磉_(dá)試驗(yàn)重復(fù) 3 次，使用 2-ΔΔCt

公式計(jì)算 CsAP1-A 相對表達(dá)量［16］。

1.6 不同花型轉(zhuǎn)錄組測序分析

采集 5 個(gè)不同花型（WT、GPV、MPV、LaPV、

NLV）墨蘭品種（‘瑞金’‘安康梅’‘大圣’‘金

鳳蝶’‘六瓣花’）的花朵，立即液氮速凍處理，

送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)

錄組測序。對 CsAP1-A 的 FPKM 值進(jìn)行 log2 轉(zhuǎn)換，

并利用 R 語言中的 Pheatmap 工具包生成熱圖。

1.7 CsAP1-A 蛋白互作關(guān)系

通過 STRING 數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org/）

預(yù)測可能與 CsAP1-A 發(fā)生互作的蛋白質(zhì)，并以水

稻作為參考，構(gòu)建 CsAP1-A 與其他蛋白的互作關(guān)

系圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsAP1-A 基因全長克隆

以墨蘭花芽為材料提取 RNA，并將 RNA 反

轉(zhuǎn)錄為 cDNA。以 cDNA 為模板，以墨蘭基因組

表 1 CsAP1-A 基因熒光定量 PCR 引物

Table 1 Primers for fluorescence quantitative PCR of

CsAP1-A gene

引物名稱 Primer name 序列 Sequence (5'-3')

QCsActin-F

QCsActin-R

QCsAP1-A-F

QCsAP1-A-R

CAATGAGCTTCGTGTTGCCC

GATACGAACCAGTTGTGCGG

TTGCTGGATCAAAACAAGACC

TGCCTAATCTTAACTGTGGCT

102

參考序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增得到約 750 bp 的單一片

段（圖 1）。將回收的 DNA 片段與 TA 克隆載體

進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，最后通過測序得到

CsAP1-A 基因序列，全長 744 bp，編碼 248 個(gè)氨

基酸（圖 2）。

2.2 CsAP1-A 生物信息學(xué)分析

2.2.1 CsAP1-A 蛋白理化性質(zhì)分析 根據(jù)

Expasy-ProtParam 預(yù) 測 分 析 結(jié) 果，CsAP1-A 蛋

白的分子式為 C1242H2038N370O376S9

，蛋白分子量為

28.4 kD，總原子數(shù)為 4 035，脂肪系數(shù)為 83.40，

平均親水性為 -0.762，說明 CsAP1-A 是一個(gè)親水

蛋白。選擇模型一致性高達(dá) 98.38% 的同源蛋白

AOA1P8SCC5.1A 作為模板，通過 SWISS-MODEL

在線軟件構(gòu)建 CsAP1-A 蛋白的三級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該

結(jié)構(gòu)包含 4 個(gè)保守的 α- 螺旋和 2 個(gè) β 折疊結(jié)

構(gòu)（圖 3）。

圖 1 CsAP1-A 基因克隆 PCR 產(chǎn)物

Fig. 1 PCR product of CsAP1-A gene cloning

圖 2 CsAP1-A 基因的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列

Fig. 2 Nucleotide acid sequence of CsAP1-A gene and deduced amino sequence

2.2.2 CsAP1-A 蛋白保守域分析與同源序列

比對 通 過 NCBI 數(shù) 據(jù) 庫 分 析 蛋 白 序 列 可 知，

CsAP1-A 擁有保守的 MADS-box 結(jié)構(gòu)域和 K-box

結(jié)構(gòu)域（圖 4），屬于 MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子家族成員。

此外，通過 NCBI 數(shù)據(jù)庫得到多個(gè)與 CsAP1-A 同

源性很高的蛋白序列，其中，CsAP1-A 與春蘭

（C. goeringii）AP1/FUL（APY18447.1） 和 蕙 蘭

（C. faberi）MADS1（AGE15496.1）的同源性均

高 達(dá) 98.38%， 與 金 釵 石 斛（D. nobile）MADSbox protein 1（ABQ08573.1）、蝴蝶蘭（Phalaenopsis

amabilis）AP1-related protein（AAZ76263.1）、華

山姜（Alpinia oblongifolia）APETALA1-like protein

（ABS83558.1）、銀合歡（Nelumbo nucifera）

APETALA1（AGY54940.1） 的 同 源 性 分 別 為

85.83%、82.19%、66.27% 和 60.32%（圖 5）。

2.2.3 CsAP1-A 氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化 為進(jìn)一

步了解 CsAP1-A 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化情況，從 NCBI

數(shù)據(jù)庫中挑選 20 條與 CsAP1-A 氨基酸序列具有

一定同源性的氨基酸序列，利用 MEGA6.0 軟件的

NJ 法構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果（圖 6）表明，CsAP1-A

的進(jìn)化樹可以分為單子葉植物和雙子葉植物兩

類［17］，其中在單子葉植物中，CsAP1-A 與其他

圖 3 CsAP1-A 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

Fig. 3 Tertiary structure prediction of CsAP1-A protein

103

圖 4 CsAP1-A 蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

Fig. 4 Analysis of conserved domains of CsAP1-A protein

圖 5 CsAP1-A 蛋白同源序列比對

Fig. 5 Homologous sequence alignment of CsAP1-A protein

圖 6 CsAP1-A 蛋白 NJ 系統(tǒng)進(jìn)化樹

Fig. 6 Neighbor-joining phylogenetic tree of CsAP1-A protein

104

圖 7 CsAP1-A 在墨蘭不同器官中的相對表達(dá)量

Fig. 7 Relative expression of CsAP1-A in different organs of Cymbidium sinense

A：不同花發(fā)育階段 ; B：不同花組織部位

A: At different stages of flower development; B: In different floral parts

圖 8 CsAP1-A 在墨蘭花中的相對表達(dá)量

Fig. 8 Relative expression of CsAP1-A in flower of Cymbidium sinense

蘭科植物親緣關(guān)系較近，并聚類一起。

2.3 CsAP1-A 基因時(shí)空表達(dá)分析

為研究 CsAP1-A 的表達(dá)模式，用 RT-qPCR

方法分別檢測其在墨蘭根、莖、葉、花、果不同

器官，不同花發(fā)育階段，以及萼片、花瓣、唇瓣、

合蕊柱不同花朵組織部位的表達(dá)情況。結(jié)果（圖

7）表明，CsAP1-A 在墨蘭不同器官中均有表達(dá)，

在花中表達(dá)量最高，其次分別為莖、果、根和葉。

在墨蘭花芽分化發(fā)育的不同階段，CsAP1-A 集

中在花發(fā)育早期階段表達(dá)，在S1階段的表達(dá)量最高，

之后逐漸下降，在 S3 階段的表達(dá)量降至 60%，在

S5 階段的表達(dá)量降至最低。此外，對墨蘭不同花組

織部位的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，CsAP1-A 在合蕊柱中的表

達(dá)量最高，其次分別是唇瓣、花瓣和萼片（圖 8）。

2.4 不同花型墨蘭 CsAP1-A 表達(dá)模式分析

分析墨蘭不同花型轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集，用熱圖形

式顯示不同花型 CsAP1-A 基因的表達(dá)情況。結(jié)果

（圖 9）表明，CsAP1-A 在 WT、MPV、LAPV 和

NLV 4 種花型［18］中均以合蕊柱中的表達(dá)量最高、

萼片中的表達(dá)量最低；在合蕊柱異常發(fā)育的 MPV

中，CsAP1-A 在合蕊柱的表達(dá)量顯著提高，而在

GPV 中的整體表達(dá)量最高，且表達(dá)區(qū)域從合蕊柱

擴(kuò)展到花瓣。

2.5 CsAP1-A 蛋白互作預(yù)測分析

使用 String 在線網(wǎng)站預(yù)測 CsAP1-A 蛋白與其

他蛋白之間的互作可能性，并以水稻作為參考，

結(jié)果（圖 10）表明，CsAP1-A 可能與 MADS1（A

類基因）、MADS6（D 類基因）、MADS47（B 類

基因）、MADS8（C 類基因）等 10 個(gè)蛋白存在

互作關(guān)系。MADS1 與 MADS47 的綜合得分較高，

推測 CsAP1-A 與它們互作的可能性更大。而在水

稻中，OsMADS1 和 OsMADS6 蛋白均屬于 MADSbox 轉(zhuǎn)錄因子家族成員，且這些蛋白在花器官發(fā)

育和花期調(diào)控方面發(fā)揮重要作用［19］。因此，推

測 CsAP1-A 蛋白參與墨蘭花的發(fā)育。

105

3 討論

MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物花的形態(tài)和

發(fā)育過程方面扮演著重要角色，而 AP1 基因是

MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員，被歸類為

擬南芥 ABCDE 開花模型中的 A 類基因，在許多

植物中均被證實(shí)能夠發(fā)揮調(diào)控植物開花、調(diào)控花

器官發(fā)育的作用［20］。五峰玉蘭 MawuAP1 基因

可以使擬南芥提前開花，并在花序頂端產(chǎn)生頂生

花［21］。過表達(dá)麻風(fēng)樹 JcAP1 基因能夠顯著縮短

擬南芥的生長周期并導(dǎo)致提前開花［22］。過表達(dá)

月季 RcAP1 也可以使擬南芥提前開花［23］。

本研究從墨蘭花芽中克隆出 CsAP1-A 基因，

該基因編碼區(qū)為 744 bp，編碼 248 個(gè)氨基酸，含

有 MADS-box 和 K-box 結(jié) 構(gòu) 域， 表 明 CsAP1-A

是典型 MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子。通過與其相似度較

高的蛋白進(jìn)行多序列比對，發(fā)現(xiàn)它們的保守結(jié)構(gòu)

域相同。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，CsAP1-A 蛋白與

春蘭 AP1/FUL3 蛋白聚為一支，說明二者親緣關(guān)

系最近。

大多數(shù) A 類基因在生殖器官的表達(dá)量均高于

營養(yǎng)器官［24］。本研究比較了 CsAP1-A 基因在墨

蘭根、莖、葉、花、果 5 個(gè)器官的相對表達(dá)量，

發(fā)現(xiàn) CsAP1-A 在花中的表達(dá)量最高，在其他器官

的表達(dá)量較低，說明 CsAP1-A 與花的發(fā)育和形成

有關(guān)。在墨蘭花芽分化的 5 個(gè)時(shí)期中，CsAP1-A

在花芽分化初期（S1）的表達(dá)量最高，然后逐漸

下降，在開花期（S5）的表達(dá)量降到最低，這與

大部分的 A 類基因在不同花發(fā)育時(shí)期表達(dá)規(guī)律相

似，如山茶的 CjAPL1［25］、麻風(fēng)樹的 JcAP1［22］

和洋桔梗的 EgAP1［26］，因?yàn)?S1 期是花器官形

成的起始階段和關(guān)鍵階段，AP1 作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因

子，可以在此階段啟動信號來激活其他基因促進(jìn)

花的形成，而隨著花芽的不斷發(fā)育，其他相互作

用的調(diào)控因子和信號通路逐漸介入，AP1 的表達(dá)

量就會逐漸降低。在墨蘭花朵的不同組織部位中，

CsAP1-A 在合蕊柱的表達(dá)量最高，其次是唇瓣，

推測 CsAP1-A 主要參與墨蘭合蕊柱的發(fā)育。對墨

蘭不同花型進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，發(fā)現(xiàn) CsAP1-A

在 WT、MPV、LaPV 和 NLV 4 種花型的合蕊柱中

表達(dá)量均最高，這與 RT-qPCR 檢測 WT 花型中

CsAP1-A 的表達(dá)結(jié)果相一致。AP1 作為 A 類基因

主要在第一、二輪花器官中表達(dá)，誘導(dǎo)花瓣和萼

片的發(fā)育［7］；但在蘭科植物中，AP1 不在第一、

二輪花器官表達(dá)，而是在內(nèi)輪的合蕊柱中表達(dá)［27］。

根 據(jù) 蛋 白 互 作 關(guān) 系 的 預(yù) 測 結(jié) 果 可 知，

CsAP1-A 大多與 MADS-box 蛋白家族存在相互作

用，而這些蛋白均與花器官發(fā)育和花期相關(guān)，因

此預(yù)測 CsAP1-A 蛋白在墨蘭花器官發(fā)育過程中起

重要作用，這為進(jìn)一步研究墨蘭花器官發(fā)育分子

調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究在墨蘭花芽中克隆得到 CsAP1-A 基

WT：普通花型，GPV：花瓣蕊柱化的梅瓣花型，MPV：重瓣花型，LaPV：花瓣唇瓣化花型，NLV：唇瓣萼片化花型；

1~4：分別代表萼片、花瓣、唇瓣和合蕊柱

WT: Common type variety; GPV: Gynostegium-like petal variety; MPV: Multi perianth variety; LaPV: Labellum-like petal variety; NLV: Null-labellum variety;

1-4: Sepal, petal, labellum and gynostemium, respectively

圖 9 不同花型墨蘭 CsAP1-A 表達(dá)模式分析

Fig. 9 Analysis of expression patterns of CsAP1-A in different floral types of Cymbidium sinense

圖 10 CsAP1-A 蛋白互作關(guān)系預(yù)測

Fig. 10 Prediction of CsAP1-A protein interactions

106

因，該基因編碼 248 個(gè)氨基酸，含有 MADS-box

轉(zhuǎn)錄因子家族的 MADS-box 和 K-box 結(jié)構(gòu)域。墨

蘭 CsAP1-A 與春蘭和蕙蘭的親緣關(guān)系最近，且

可 能 與 MADS1、MADS6、MADS47、MADS8 等

蛋白具有相互作用。CsAP1-A 在墨蘭花中的相對

表達(dá)量顯著高于其他器官，且在花芽分化初期的

表達(dá)量最高，并隨著花朵發(fā)育而逐漸下降；在墨

蘭花朵不同組織部位中，CsAP1-A 在合蕊柱的表

達(dá)量最高，其次是唇瓣、花瓣和萼片。通過對不

同花型的墨蘭品種轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，CsAP1-A 在

WT、MPV、LaPV 和 NLV 4 種花型的合蕊柱中表

達(dá)量均最高。綜上所述，CsAP1-A 可能在墨蘭花

發(fā)育和合蕊柱形成中具有重要作用。

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Orchidaceae［J］. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2015, 31(7):

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（責(zé)任編輯 崔建勛）

周 榮， 碩 士， 三 級 教 授，

碩士生導(dǎo)師，佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院

風(fēng)景學(xué)院學(xué)科和專業(yè)帶頭人，主

要從事園藝園林植物開發(fā)利用研

究。主持廣東省科技廳、省農(nóng)業(yè)

農(nóng)村廳、佛山市等省市廳科研課

題 10 余項(xiàng)，發(fā)表論文 40 多篇，

主編專著 4 部、參編 1 部。獲廣

東省科技進(jìn)步三等獎(jiǎng)、廣東省農(nóng)

業(yè)技術(shù)推廣獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)和三等獎(jiǎng)、

佛山市科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)、中國發(fā)明協(xié)會創(chuàng)業(yè)銀獎(jiǎng)等獎(jiǎng)項(xiàng) 10

余項(xiàng)；授權(quán)國家發(fā)明專利 1 件。曾獲廣東省“三八紅旗手”、

廣東省三下鄉(xiāng)優(yōu)秀教師、廣東省創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)優(yōu)秀指導(dǎo)教師、佛

山市“三八”紅旗手、佛山市科技標(biāo)兵等稱號；指導(dǎo)大學(xué)生

“挑戰(zhàn)杯”創(chuàng)業(yè)計(jì)劃競賽獲得國銀和省銀獎(jiǎng)、“互聯(lián)網(wǎng) +”

大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)大賽獲得省金和省銅獎(jiǎng)；主持教育部協(xié)同育

人、廣東省質(zhì)量工程項(xiàng)目各 1 項(xiàng)、校級教研課題 3 項(xiàng)；主編

和參編教材 2 部；指導(dǎo)學(xué)生國家和省級大學(xué)生創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目 5 項(xiàng)；

兼任中國花卉協(xié)會蘭花分會副秘書長、廣東省蘭花協(xié)會副會

長、《佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)》編委。

楊鳳璽，博士，研究員，碩

士生導(dǎo)師，主要從事蘭花種質(zhì)資

源創(chuàng)新、重要性狀功能基因挖掘、

分子育種及新品種配套栽培技術(shù)

研發(fā)。廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園

藝研究所副所長兼蘭花研究室主

任、廣東省園林花卉種質(zhì)創(chuàng)新綜

合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任，兼任中

國花卉協(xié)會蘭花分會副秘書長、

廣東省園藝學(xué)會副理事長、廣東

省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系花卉團(tuán)

隊(duì)崗位專家、廣東省農(nóng)村科技特派員、廣州市鄉(xiāng)村振興“百

團(tuán)千人科技下鄉(xiāng)”專家等。主持國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目、

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（子課題負(fù)責(zé)人）、廣東省自然科學(xué)

基金、廣東省科技基礎(chǔ)條件建設(shè)重點(diǎn)項(xiàng)目、廣州市重點(diǎn)研發(fā)

計(jì)劃等 30 余個(gè)項(xiàng)目。獲神農(nóng)中華農(nóng)業(yè)科技優(yōu)秀團(tuán)隊(duì)獎(jiǎng)、云

南省自然科學(xué)一等獎(jiǎng)、湖南省科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)、廣東省農(nóng)業(yè)

技術(shù)推廣獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)和汕頭市科學(xué)技術(shù)二等獎(jiǎng)等多項(xiàng)獎(jiǎng)勵(lì)。發(fā)

表論文 50 余篇（SCI 30 篇），參編專著 2 部，獲授權(quán)國家

發(fā)明專利 8 件（排名第一），培育特色蘭花新品種 9 個(gè)。

收稿日期：2023-07-31

基金項(xiàng)目：廣東省科技創(chuàng)新戰(zhàn)略專項(xiàng)基金（pdjh2023b0500）；惠州學(xué)院教授、博士啟動項(xiàng)目（2021JB017）

作者簡介：龔浩（1989—），男，博士，講師，研究方向?yàn)橹参锘蚪M學(xué)，E-mail：mygonghao@163.com

通信作者：孫鍵（1985—），男，博 士，講師，研究方向?yàn)橹参锓诸悓W(xué)，E-mail：sunjian8@mail2.sysu.edu.cn

廣東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2023，50（9）：108-116

Guangdong Agricultural Sciences DOI:10.16768/j.issn.1004-874X.2023.09.011

龔浩，張莉莉，陳富榮，林麗霞，陳意君，張樂，孫春 蓮，孫鍵 . 基于深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的 SSR 分子標(biāo)記對茶葉產(chǎn)地的溯源研究［J］.

廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2023，50（9）：108-116.

基于深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的 SSR 分子標(biāo)記對

茶葉產(chǎn)地的溯源研究

龔 浩 1

，張莉莉 1

，陳富榮 2

，林麗霞1

，陳意君 1

，張 樂1

，孫春 蓮 2

，孫 鍵 1

（1. 惠州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東 惠州 516007；2. 惠州學(xué)院經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院，廣東 惠州 516007）

摘 要：【目的】對不同品種的茶葉進(jìn)行區(qū)分和產(chǎn)地溯源，同時(shí)為其他植物分類提供參考依據(jù)。【方法】

以簡單重復(fù)序列標(biāo)記（Simple sequence repeat，SSR）為基礎(chǔ)，運(yùn)用生物信息學(xué)的研究方法，對來自湖南、云南、

福建和浙江省的 313 個(gè)茶葉樣本的來源屬地及 10 個(gè)外類群關(guān)系進(jìn)行研究：首先，篩選出高質(zhì)量的 54 個(gè) SSR 位

點(diǎn)，通過主成分分析（Principal compon ent analysis，PCA），構(gòu)建進(jìn)化樹，分析各省間茶葉樣本的差異度；其次，

通過比較線性回歸模型、隨機(jī)森林模型和深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（Deep neural network，DNN）模型的分類準(zhǔn)確度，選擇

準(zhǔn)確度最高的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行溯源模型構(gòu)建及優(yōu)化?！窘Y(jié)果】4 個(gè)省的茶葉樣本個(gè)體相對聚集，其中云南省的

樣本個(gè)體較其他省份差異大；福建、浙江、湖南的樣本分別聚集，表明福建、浙江、湖南三省間茶葉差異顯著，

但有少量交叉，具有一定的相似遺傳結(jié)構(gòu)特性，親緣關(guān)系較近。利用 3 種不同的模型對 54 個(gè) SSR 分子標(biāo)記矩陣

構(gòu)建模型，初步鑒定出線性回歸模型準(zhǔn)確率為 81%，隨機(jī)森林模型準(zhǔn)確率為 77%，而 DNN 模型準(zhǔn)確率最高、為

86%，由此可得出 DNN 模型對茶葉的分類效果最好。隨后利用 54 個(gè) SSR 分子標(biāo)記和 323 個(gè)樣本構(gòu)建預(yù)測模型，

并對一次訓(xùn)練的樣本個(gè)數(shù)（Batch size)、訓(xùn)練的次數(shù)（Step size)、隱藏層層數(shù)及每層節(jié)點(diǎn)數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)這 4

個(gè)參數(shù)的優(yōu)化結(jié)果當(dāng)樣本個(gè)數(shù)為 150、訓(xùn)練次數(shù)為 20 000、隱藏層層數(shù)為 2 層時(shí)驗(yàn)證集和測試集的準(zhǔn)確率最高、

約 95%，即 2 層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對茶葉分析效果最佳?！窘Y(jié)論】基于深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的 SSR 分子標(biāo)記為茶葉分類、產(chǎn)地

溯源研究和茶葉育種等方面提供支持依據(jù)，構(gòu)建的分類模型也可用于其他物種重測序數(shù)據(jù)的屬地來源鑒定。

關(guān)鍵詞：茶葉；SSR；PCA; 深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)；溯源；分子標(biāo)記

中圖分類號：S571.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1004-874X（2023）09-0108-09

Research on SSR Molecular Markers for Traceability of

Tea Origins Based on Deep Neural Network

GONG Hao1

, ZHANG Lili1

, CHEN Furong2

, LIN Lixia1

, CHEN Yijun1

,

ZHANG Le1

, SUN Chunlian2

, SUN Jian1

（1. School of Life Science, Huizhou University, Huizhou 516007, China;

2. School of Economics and Management, Huizhou University, Huizhou 516007, China）

Abstract: 【Objective】The study was conducted to differentiate and trace the origin of different varieties of tea,

and provide a reference basis for the classification of other plants.【Method】The sources genus of 313 tea samples from

Hunan, Yunnan, Fujian and Zhejiang Provinces and 10 outgroup relationships were investigated by utilizing SSR-based

and bioinformatics research methods. First, 54 SSR loci of high quality were screened and the degree of variation among

109

【研究意義】茶樹〔Camellia sinensis (L.)

O.Kuntze〕屬山茶科山茶屬多年生常綠木本植物，

原產(chǎn)于熱帶及亞熱帶，是一種喜暖喜濕的葉用植

物，其嫩葉經(jīng)過加工后即為茶葉。茶葉具有防輻

射、提神醒腦、利尿、助消化、減肥和預(yù)防疾病

的作用，因此茶葉的飲用及流傳從古至今都極受

重視，是中華民族的舉國之飲、世界三大飲品之

首［1］。但是茶樹異花傳粉和長期自交不育的特性，

使茶樹高度雜合、親緣關(guān)系復(fù)雜，茶葉品種難以

輕易分辨、分類標(biāo)準(zhǔn)難以統(tǒng)一、鑒別結(jié)果有誤差

等，這就需要對茶葉不同品種進(jìn)行區(qū)分和產(chǎn)地溯

源。SSR 廣泛應(yīng)用于植物基因定位和 QTL 分析、

DNA 指紋和品種鑒定［2］、種質(zhì)資源保存和利用、

系譜分析以及標(biāo)記輔助育種，通常呈共顯性遺傳，

其多態(tài)位點(diǎn)豐富，實(shí)驗(yàn)操作簡單易行［3］。 基于

深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的簡單重復(fù)序列標(biāo)記對茶葉產(chǎn)地的

溯源研究不僅有利于茶葉的分類和產(chǎn)地溯源［4］，

還能為其他植物分類提供參考。

【前人研究進(jìn)展】目前已發(fā)表相關(guān)論文的茶

樹測序群體一般為 100~200 個(gè)樣本，過于零散且

群體覆蓋性和代表性較弱，無法用于深度的群體

遺傳分析［5］。目前，國內(nèi)對茶葉品種、產(chǎn)地、產(chǎn)

季、年份和等級等真實(shí)屬性的鑒別還主要停留在

傳統(tǒng)的理化分析與感官評定相結(jié)合的水平上，例

如 GB/T 19598-2006《地理標(biāo)志產(chǎn)品 安溪鐵觀音》

中評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)是以感官為主，輔以部分理化檢測。

一方面，具有感官評定能力的專家非常少，特別

是面對我國品種繁多的茶葉，具有特定品種茶葉

感官評定能力的專家更為稀缺；另一方面，人的

感官靈敏度容易受到外界因素的干擾而改變，采

用感官評價(jià)方法受人為主觀影響很大，可操作性

較差，且目前還沒有明確且易于實(shí)現(xiàn)的評定指標(biāo)

或參數(shù)，易造成判定結(jié)果的偏差［6］。基于此產(chǎn)生

電子鼻來分類茶葉，利用氣敏傳感器陣列對揮發(fā)

性氣味物質(zhì)響應(yīng)，使氣味成為量化指標(biāo)的新技術(shù)

手段，具有檢測時(shí)間短、樣品預(yù)處理簡單、檢測

結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)［7］，可以高效、快速、無損檢測

不同種類的食品，可應(yīng)用于茶葉貯藏時(shí)間［8］、

加工方式、品質(zhì)［9］和等級［10］等檢測。但這種

方法會因?yàn)闄z驗(yàn)材料部位不同而出現(xiàn)較大的結(jié)果

誤差。

【本研究切入點(diǎn)】近年來，分子生物學(xué)技術(shù)

和生物信息學(xué)的發(fā)展有力地推動了 DNA 分子標(biāo)記

的研究。與形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記、生化標(biāo)記等

相比，DNA 分子標(biāo)記技術(shù)不易受外界環(huán)境及個(gè)體

本身的影響，具有結(jié)果準(zhǔn)確、信息量大、檢測簡

單、重復(fù)性及穩(wěn)定性較好等優(yōu)點(diǎn)［11］。DNA 分子

標(biāo)記技術(shù)在植物分類學(xué)［12］、遺傳多樣性分析［13］、

tea samples from different provinces were analyzed by Principal Component Analysis(PCA) and constructing an evolutionary

tree. Second, the classification accuracy of three models including the Linear Regression Model, the Random Forest Model,

and the Deep Neural Networks Model(DNN) were compared and the Neural Networks Model with the highest accuracy were

selected for constructing and optimizing the traceability model.【Result】The sample individuals showed relative aggregation

within the four provinces, in which the sample individuals within Yunnan Province differed significantly compared with those in

other provinces; while the samples from Fujian, Zhejiang and Hunan showed separated aggregation, indicating that there were

significant differences in tea among Fujian, Zhejiang and Hunan Provinces, but there was a small amount of crossover, with

some similar genetic structure characteristics, and that the individuals from these three provinces were more closely related.

By using three different models to construct a model for the molecular marker matrix of 54 SSR markers, we initially identified

that the accuracy of the Linear Regression Model was 81%, that of the Random Forest Model was 77%, and while the accuracy

of DNN Model was the highest of 86%. Consequently, it could be inferred that the DNN Model was optimal for classifying tea

trees. Subsequently, a prediction model was constructed with 54 SSR markers and 323 samples. The batch size, step size,

number of layers in the hidden layer, and number of nodes in each layer of each training were optimized. It was found that the

highest accuracy of approximately 95% for validation and test sets was achieved when the batch size was 150, the step size was

20 000 and the number of layers in the hidden layer was 2. Therefore, a 2-layer neural network was optimal for the analysis of

tea.【Conclusion】DNN-Based SSR molecular markers provide a strong foundation for researches on tea classification, origin

traceability, and tea breeding. The constructed classification model can also be used for identifying the origin of resequencing

data for other species.

Key words: tea; SSR; PCA; deep neural network; traceability; molecular marker

110

遺傳圖譜構(gòu)建［14］和輔助育種［15］等方面的研究廣

為應(yīng)用，但在茶樹種質(zhì)資源方面的研究應(yīng)用較少，

主要集中在遺傳多樣性及特異標(biāo)記方面?！緮M解

決的關(guān)鍵問題】本研究旨在解決茶葉主成分分析、

茶葉產(chǎn)地溯源及品種鑒定、DNN 模型構(gòu)建等問題。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本 研 究 根 據(jù) Accession No. PRJNA595795 和

PRJNA562973，從 NCBI database 中下載 323 份茶

葉的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，其中來自福建、云南、浙江、

湖南省的茶葉分別有 130、96、54、33 份，其余

10 份屬于外類群樣本即研究類群之外親緣關(guān)系

最近的物種，這 10 個(gè)外類群為全國收集的茶梅

Camellia sasanqua Thunb（表 1）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鑒定 SSR 標(biāo)記位點(diǎn) 本研究先從 323 份樣

本中獲得樣本數(shù)據(jù)，使用 PSR 軟件（Polymorphic

SSR retrieval, PMID:26428628），鑒定茶葉參考基

因組（Tea tree Camellia sinensis, 舒茶早）中所有

可能的 SSR 標(biāo)記位點(diǎn)。首先利用 PSR 軟件，設(shè)置

參數(shù)支持的 reads 總數(shù)大于 5，同時(shí)支持 reads 的

比例大于 10%，其他參數(shù)均為默認(rèn)參數(shù)；再過濾

單個(gè)位點(diǎn)缺失率較大的位點(diǎn)；最后進(jìn)行線性回歸

分析，并結(jié)合不同 SSR 位點(diǎn)的相關(guān)性，保留最終

的 SSR 位點(diǎn)［16］。

1.2.2 主成分分析 本研究將 323 個(gè)茶葉樣本進(jìn)

行樣本間 SSR 序列的相互比對，計(jì)算每個(gè)樣本

與其他樣本的差異度，再基于樣本間的差異度計(jì)

算 323 個(gè)樣本的基因差異矩陣［17］。利用 PCA 對

323 個(gè)樣本基因差異矩陣進(jìn)行分析，然后使用 R

語言中的 read.table 函數(shù)讀入數(shù)據(jù)、ovun.sample 函

數(shù)清理處理數(shù)據(jù)，最后利用內(nèi)置函數(shù) princomp 進(jìn)

行 PCA。

1.2.3 構(gòu)建整體樣本的進(jìn)化樹 先用 perl 的自

編腳本獲得所有個(gè)體的明氏距離矩陣，然后用

PHYLIP 的 neighbour 模塊構(gòu)建原始進(jìn)化樹，再用

dendroscope 對進(jìn)化樹進(jìn)行展示和修飾。

1.2.4 建立及優(yōu)化模型 本研究使用 Matlab 軟件

的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)工具，建立線性回歸模型、隨機(jī)森林

模型和 DNN 模型。在建立線性回歸模型的過程中，

根據(jù)樣本數(shù)據(jù)集，分別生成 x 矩陣和 y 矩陣，利

用線性回歸代碼建模，并使用其模型進(jìn)行預(yù)測。

在建立隨機(jī)森林模型的過程中，先將整體樣本讀

到內(nèi)存中，按照 8∶2 的比例分為 80% 的訓(xùn)練集、

20% 的測試集；然后將訓(xùn)練集的樣本先分詞，再

轉(zhuǎn)換為詞向量；接著將訓(xùn)練集的樣本和標(biāo)簽統(tǒng)一

傳入算法中，得到擬合后的模型；繼而將測試集

的樣本先分詞，再得到詞向量；最終把測試集得

出的詞向量添加到擬合后的模型中，得出結(jié)果并

將結(jié)果轉(zhuǎn)換為準(zhǔn)確率的形式。在建立 DNN 模型的

過程中，本研究通過下載 WeightWatcher 安裝包，

導(dǎo)入樣本數(shù)據(jù)，利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)代碼直接預(yù)測準(zhǔn)確

率。選取準(zhǔn)確率最高的深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型作進(jìn)一

步優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR 標(biāo)記位點(diǎn)鑒定結(jié)果

首先需要初步鑒定 SSR 位點(diǎn)，通過 PSR 軟

件，從茶葉參考基因組數(shù)據(jù)庫中獲得所有可能的

SSR 標(biāo)記，最終得到 3 668 個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)，其中，

比對到染色體上的位點(diǎn)有 3 304 個(gè)（表 2）［18］。

SSR 標(biāo)記位點(diǎn)的鑒定：利用 PSR 軟件，經(jīng)過篩選

后得到 2 924 個(gè)位點(diǎn)；過濾單個(gè)位點(diǎn)缺失率大于

20% 的位點(diǎn)后，獲得 2 155 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)；通過

線性回歸分析，篩選在不同省份特異性存在的位

點(diǎn)（P<0.001），獲得 700 個(gè)位點(diǎn)；結(jié)合不同 SSR

位點(diǎn)的相關(guān)性，在兩個(gè)及其相關(guān)的位點(diǎn)中只保留

差異性較大的位點(diǎn)，最終獲得 54 個(gè) SSR 位點(diǎn)。

2.2 不同來源茶葉樣本 PCA 結(jié)果

如圖 1 所示，圖中每個(gè)點(diǎn)代表 1 個(gè)樣本，兩

點(diǎn)距離代表茶葉樣品受主成分影響下的相似性距

離。全部樣本的 PCA 結(jié)果表明，Dim1（7.6%）

表示第一主成分貢獻(xiàn)率為 7.6%，Dim2（4.3%）

表示第二主成分貢獻(xiàn)率為 4.3%，即前兩個(gè)主成分

的累計(jì)貢獻(xiàn)率為 11.9%（圖1A）；外類群與福建、

表 1 茶葉樣本來源屬地統(tǒng)計(jì)

Table 1 Statistics on the origin and locality of tea samples

來源屬地

Origin and locality

樣本數(shù)

Number of samples

比例

Proportion (%)

福建 Fujian 130 40.24

云南 Yunnan 96 29.72

浙江 Zhejiang 54 16.72

湖南 Hunan 33 10.22

其他 Other 10 3.10

總計(jì) Total 323 100.00

111

湖南、云南、浙江 4 省茶葉樣本差異顯著，部分

與云南省樣品個(gè)體相近。本研究通過對 4 省份數(shù)

據(jù)進(jìn)行 PCA 來做進(jìn)一步判斷。根據(jù) 4 個(gè)省份間的

PCA 結(jié)果（圖 1B），并排除外類群的影響，可以

發(fā)現(xiàn)不同省份間的整體差異較明顯，而 4 個(gè)省份

內(nèi)個(gè)體相對聚集。其中，云南省內(nèi)的個(gè)體較其他

省份差異大；福建、浙江、湖南的樣本分別聚集，

這表明福建、浙江、湖南 3 個(gè)省份間茶葉差異顯

著，但有少量交叉，具有一定相似的遺傳結(jié)構(gòu)特

性，3 個(gè)省份間的親緣關(guān)系較近。其親緣關(guān)系遠(yuǎn)

近與地理來源并不呈現(xiàn)一致性，原因可能與茶葉

人工馴化程度有關(guān)。PCA 也存在一定的不足之處，

簡單的 PCA 只能解釋部分個(gè)體的產(chǎn)地溯源問題，

若要進(jìn)一步研究溯源問題，則還需要用其他方法，

如構(gòu)建進(jìn)化樹、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型等方法，來進(jìn)一步

解釋和驗(yàn)證交叉?zhèn)€體的溯源問題。

表 2 各染色體中含有 SSR 位點(diǎn)數(shù)目的統(tǒng)計(jì)

Table 2 Statistics on the number of SSR loci contained

in each chromosome

染色體名稱 Chromsome name 數(shù)量 Quality

GWHACFB00000009 370

GWHACFB00000013 323

GWHACFB00000003 313

GWHACFB00000006 295

GWHACFB00000002 290

GWHACFB00000011 281

GWHACFB00000005 222

GWHACFB00000001 216

GWHACFB00000012 201

GWHACFB00000007 181

GWHACFB00000004 174

GWHACFB00000008 131

GWHACFB00000010 107

GWHACFB00000014 107

GWHACFB00000015 93

Other_scaffolod 364

A、C：323 個(gè)樣本間的差異主成分分析；B：313 個(gè)樣本間的差異主成分分析

A, C: PCA of variance among 323 samples; B: PCA of variance among 313 samples

圖 1 主成分分析結(jié)果

Fig. 1 Principal component analysis results

112

2.3 進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果

從以上 PCA 分析結(jié)果可以看出，不同省份的

個(gè)體分別聚集，差異較為顯著，但也有少量的交

叉，其中福建主要與浙江、云南鄰近，湖南與云

南較近，外類群主要分布在云南附近，而云南個(gè)

體分類較其他省份分散，由此構(gòu)建不同省份茶葉

的進(jìn)化樹（圖 2），其結(jié)果與 PCA 結(jié)果相似。

2.4 模型構(gòu)建與優(yōu)化結(jié)果

2.4.1 不同模型預(yù)測結(jié)果 本研究利用 3 種不同

的模型對 54 個(gè) SSR 分子標(biāo)記矩陣構(gòu)建模型，再

初步鑒定不同模型的差異。通過線性回歸模型

（81%）、 隨 機(jī) 森 林 模 型（77%） 及 DNN 模 型

（86%）對 54 個(gè) SSR marker 矩形構(gòu)建模型，發(fā)現(xiàn)

深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型準(zhǔn)確率最高、為 86%，故選擇

DNN 模型進(jìn)行預(yù)測［19］。

2.4.2 DNN 模型的優(yōu)化結(jié)果 本研究利用 Matlab

軟件的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)工具對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行建模。使用

54 個(gè) SSR 和 323 個(gè)樣本，構(gòu)建預(yù)測模型，再用

Tensorflow2.0 優(yōu)化 DNN 模型的一次訓(xùn)練樣本個(gè)數(shù)

（Batch size)、訓(xùn)練次數(shù)（Step size)、隱藏層層數(shù)

和每層節(jié)點(diǎn)數(shù) 4 個(gè)參數(shù)。

將 323 份樣本中除了外類群以外的數(shù)據(jù)分成

訓(xùn)練集、測試集和驗(yàn)證集 3 個(gè)部分，其中訓(xùn)練集、

測試集、驗(yàn)證集的測試比例分別為 0.8、0.1、0.1，

即訓(xùn)練集 273 份，測試集 20 份，驗(yàn)證集 20 份。

先用訓(xùn)練集訓(xùn)練模型，再用測試集進(jìn)行最后優(yōu)化，

并使用驗(yàn)證集對優(yōu)化后的模型進(jìn)行驗(yàn)證。

2.4.3 參數(shù) Batch size 和 Step 的優(yōu)化 本研究通

過對參數(shù) Batch size 和 Step 進(jìn)行優(yōu)化，測試不同

參數(shù)對準(zhǔn)確率的影響。對每次訓(xùn)練選取的 Batch

size 分別設(shè)為 150、200、250、300，而迭代的次

數(shù) Step 分別為 5 000、10 000、15 000、20 000、

25 000、30 000。理論上 Step 越高模型準(zhǔn)確率就

越高，但 Step 過高會導(dǎo)致模型過度擬合。通過

對測試集 10 次重復(fù)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)參數(shù) Batch size 為

150 和 Step 為 20 000 綜合起來表現(xiàn)效果最好（表 3、

表 4）。

2.4.4 隱藏層層數(shù)和每層節(jié)點(diǎn)數(shù)的優(yōu)化 （1）

圖 2 不同省份茶葉樣本的進(jìn)化樹

Fig. 2 Evolutionary tree of tea samples from different provinces

表 3 測試集和驗(yàn)證集最優(yōu)準(zhǔn)確率

Table 3 Optimal accuracy of the test and validation set

訓(xùn)練次數(shù)

Step size

測試樣本個(gè)數(shù)（Batch size for test） 驗(yàn)證樣本個(gè)數(shù)（Batch size for validation）

150 200 250 300 150 200 250 300

5000 0.850 0.830 0.855 0.860 0.775 0.790 0.803 0.855

10000 0.820 0.840 0.830 0.855 0.810 0.845 0.815 0.828

15000 0.865 0.860 0.895 0.875 0.858 0.780 0.848 0.838

20000 0.905 0.890 0.830 0.890 0.878 0.845 0.790 0.820

25000 0.865 0.870 0.860 0.845 0.808 0.810 0.805 0.823

30000 0.865 0.900 0.870 0.860 0.838 0.825 0.860 0.805

表 4 測試集和驗(yàn)證集平均準(zhǔn)確率

Table 4 Average accuracy of the test set and validation set

訓(xùn)練次數(shù)

Step size

測試樣本個(gè)數(shù)（Batch size for test） 驗(yàn)證樣本個(gè)數(shù)（Batch size for validation）

150 200 250 300 150 200 250 300

5000 0.700 0.750 0.750 0.850 0.700 0.750 0.750 0.850

10000 0.800 0.850 0.800 0.800 0.800 0.850 0.800 0.800

15000 0.850 0.700 0.800 0.800 0.850 0.700 0.800 0.800

20000 0.850 0.800 0.750 0.750 0.850 0.800 0.750 0.750

25000 0.750 0.750 0.750 0.800 0.750 0.750 0.750 0.800

30000 0.800 0.750 0.850 0.750 0.800 0.750 0.850 0.750

113

圖 3 深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)層數(shù)和節(jié)點(diǎn)數(shù)的參數(shù)優(yōu)化結(jié)果

Fig. 3 Oprtimization results of layer number and node for each layer for the Deep Neural Network

隱藏層層數(shù)的優(yōu)化：利用不同的隨機(jī)參數(shù)模擬 2~

4 層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的測試集和驗(yàn)證集的準(zhǔn)確率。經(jīng)對

比，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)為 2 層時(shí)驗(yàn)證集和測試集的準(zhǔn)

確率最高，約 95%（圖 2 A）。（2）每層節(jié)點(diǎn)數(shù)

的優(yōu)化：確定隱藏層為 2 層后，分別產(chǎn)生 25~150

間隔為 5 的 26 個(gè)可能節(jié)點(diǎn)數(shù)，隱藏層的兩層網(wǎng)絡(luò)

組合一起是 26×26 共 676 個(gè)組合的矩陣，檢測不

同參數(shù)對應(yīng)的準(zhǔn)確率，每個(gè)組合進(jìn)行 10 次重復(fù)。

然后按以下打分規(guī)則對最優(yōu)準(zhǔn)確率進(jìn)行確

定，通過統(tǒng)計(jì)不同指標(biāo)對所有組合進(jìn)行打分，每

一種指標(biāo)都能進(jìn) 10% 得 1 分：測試集和驗(yàn)證集準(zhǔn)

確率的平均值；驗(yàn)證集準(zhǔn)確率的平均值；最優(yōu)驗(yàn)

證準(zhǔn)確率。最后統(tǒng)計(jì) 2 分以上的次數(shù)（圖 3），

圖 3A 為在最優(yōu) Batch size 和 Step size 時(shí)不同神經(jīng)

層數(shù)的柱狀圖，對比發(fā)現(xiàn)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)為 2 層時(shí)驗(yàn)證

集和測試集的準(zhǔn)確率最高；圖 3B、C、D、E 為

2 層隱藏層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)參數(shù)的優(yōu)化，其中 B 為不同

維度模擬的自測數(shù)據(jù)的平均準(zhǔn)確率，C 為不同維

度模擬的驗(yàn)證數(shù)據(jù)的平均準(zhǔn)確率，D 為不同維度

模擬的自測數(shù)據(jù)的最優(yōu)準(zhǔn)確率。綜合準(zhǔn)確率方差

等因素，本研究選擇隱藏層第一層 95、第二層

40 的模型為最優(yōu)模型，其中自測集的平均準(zhǔn)確率

95%，自測集合驗(yàn)證平均值準(zhǔn)確率 89%，驗(yàn)證集

的平均準(zhǔn)確率 75% 以上，最優(yōu)準(zhǔn)確率為 100%。

3 討論

我國是茶葉消費(fèi)大國，隨著人們生活水平的

提高，消費(fèi)者對茶品質(zhì)的要求也日益提高。為了

確定茶葉的真實(shí)產(chǎn)地，研究者運(yùn)用各種方法進(jìn)行

研究。目前，生物信息學(xué)在基因測序分析中發(fā)揮

著舉足輕重的作用，國內(nèi)主要是以實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，

通過測定農(nóng)產(chǎn)物及其土壤中的礦質(zhì)元素，再進(jìn)行

相關(guān)性分析、聚類分析、主成分分析等多種統(tǒng)計(jì)

分析方法，進(jìn)而對農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)行溯源分析［20］。本

114

研究主要以生物信息學(xué)為基礎(chǔ)，通過分析相關(guān)的

基因位點(diǎn)，構(gòu)建模型并進(jìn)行優(yōu)化，最終對茶葉溯

源進(jìn)行分析。

本研究通過基因組的 SSR 位點(diǎn)進(jìn)行基因數(shù)

據(jù)分析。SSR 作為第二代分子標(biāo)記，具有重復(fù)性

好、多態(tài)性高、變異豐富、呈共顯性且廣泛分布

于植物基因組等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于高粱、大

麥、小麥、青稞等作物遺傳多樣性分析和基因研

究［21］。與 SNP 標(biāo)記相比，SSR 標(biāo)記的優(yōu)勢是成

本低、試驗(yàn)技術(shù)簡單［22］。本研究先利用 PSR 軟

件從茶葉參考基因組中鑒定所有可能的 SSR 標(biāo)

記位點(diǎn)，再比對到染色體上，利用 PSR 設(shè)置參

數(shù)支持的 reads 總數(shù)大于 5 同時(shí)支持 reads 的比

例大于 10%［23］，得到樣本后進(jìn)行位點(diǎn)篩選，最

終獲得 54 個(gè) SSR 位點(diǎn)；再利用 3 種不同的模型

對 54 個(gè) SSR 分子標(biāo)記矩陣構(gòu)建模型，初步鑒定

不同模型的差異［24］；選擇準(zhǔn)確率最高的神經(jīng)網(wǎng)

絡(luò)模型，進(jìn)行人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的優(yōu)化和參數(shù)選

擇、Batch size 和 Step size 的優(yōu)化、隱藏層數(shù)目

和每層節(jié)點(diǎn)數(shù)優(yōu)化、2 層隱藏層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)參數(shù)的

優(yōu)化，最后選擇準(zhǔn)確率在 95% 左右最優(yōu)的 2 層神

經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型［25］。

在研究地理溯源領(lǐng)域中，大部分研究都是利

用分子標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記構(gòu)建變異圖譜，然后查看

變異圖譜的相似性來進(jìn)行溯源。本研究使用深度

學(xué)習(xí)預(yù)測方法，在研究產(chǎn)地溯源領(lǐng)域使用量較少，

主要通過建立樣本的基因差異矩陣，使用 PCA 分

析 323 個(gè)樣本間的差異度，結(jié)果非常直觀。通過

分析圖片，發(fā)現(xiàn)外類群與福建、湖南、云南、浙

江 4 省份間的差異顯著，而各省份內(nèi)個(gè)體相對聚

集，其中云南省內(nèi)的個(gè)體差異較其他省份大；4

省份有部分材料重疊在一起，表明不同省份的部

分茶葉也具有一定的遺傳相似性［26］。構(gòu)建整體

樣本的進(jìn)化樹，結(jié)果表明不同省份的茶葉個(gè)體分

別聚集，差異顯著，但也有少量交叉，此結(jié)果與

PCA 結(jié)果相似［27］。

本研究只研究福建、湖南、云南、浙江 4 省

份和 10 個(gè)外類群共 323 個(gè)樣本，茶葉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)

存在樣本量少的局限性，后續(xù)需要增加樣本容量，

對茶葉溯源作進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究對來自湖南、云南、福建和浙江省的

313 個(gè)茶葉樣本的來源屬地及 10 個(gè)外類群關(guān)系進(jìn)

行研究，以篩選出的 54 個(gè)高質(zhì)量的 SSR 位點(diǎn)為

基礎(chǔ)，對樣本進(jìn)行主成分分析，并通過 3 種不同

的分類模型比對及優(yōu)化，得出 2 層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型

對茶葉分析效果最佳，準(zhǔn)確率約 95%。本研究構(gòu)

建的分類模型也可以用于其他物種重測序數(shù)據(jù)的

屬地來源鑒定。

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subtrop.agric.res.2021.02.012.

（責(zé)任編輯 鄒移光）

龔浩，博士，畢業(yè)于中國科學(xué)

院大學(xué)，惠州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院講

師，惠州市食品安全協(xié)會顧問專家，

主要從事不同物種群體的分化和大

數(shù)據(jù)技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)的應(yīng)用研究，

致力于將基因組技術(shù)應(yīng)用在農(nóng)作物

育種和分類上，并利用大數(shù)據(jù)技術(shù)

挖掘農(nóng)作物的優(yōu)良基因資源，促進(jìn)

精 準(zhǔn) 育 種。 在《Genome Biology》

《Theoretical Applied Genetics》《Nature

Genetics》等期刊發(fā)表 SCI 論文 15 篇，其中第一作者 7 篇，

論文累計(jì)被引用轉(zhuǎn)載 500 余次；獲授權(quán)國家發(fā)明專利 3 件。

孫鍵，博士，畢業(yè)于中山大學(xué)，

2017—2020 年在深圳大學(xué)生命與

海洋科學(xué)學(xué)院海洋研究中心進(jìn)行博

士后研究工作，現(xiàn)為惠州學(xué)院生命

科學(xué)學(xué)院講師，主要從事植物分類

與植物生理生態(tài)研究，重點(diǎn)關(guān)注維

管植物分類與紅樹植物生理生態(tài)過

程，目前致力于粵東地區(qū)植物分類

與特色植物資源開發(fā)與利用、綠色

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術(shù)開發(fā)應(yīng)用研究。參與

國家級、省部級科研項(xiàng)目 6 項(xiàng)，在國內(nèi)外核心期刊發(fā)表學(xué)術(shù)

論文 10 余篇，參編專著 2 部。

收稿日期：2023-07-30

基金項(xiàng)目：國家荔枝龍眼產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)（CARS-32-08）；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（202103000057，202206010023）

作者簡介：葛涵濤（1999—），男，在讀博士生，研究方向?yàn)楣麡湓耘嗌?，E-mail：1572482797@qq.com

通信作者：王惠聰（1972—），女，博士，教授，研究方向?yàn)楣麡湓耘嗌?，E-mail：wanghc1972@263.net

廣東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2023，50（9）：117-126

Guangdong Agricultural Sciences DOI:10.16768/j.issn.1004-874X.2023.09.012

葛涵濤，林詩雅，王惠聰 . 荔枝果皮細(xì)胞壁組成與裂果發(fā)生關(guān)系的研究［J］. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2023，50（9）：117-126.

荔枝果皮細(xì)胞壁組成與裂果發(fā)生關(guān)系的研究

葛涵濤，林詩雅，王惠聰

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東 廣州 510642）

摘 要：【目的】通過比較裂果易感性不同的荔枝品種細(xì)胞壁組分的差異，研究外源噴施生長素類似物 2,4-

二氯苯氧乙酸（2,4-D）對裂果和果皮細(xì)胞壁組分的影響，探討細(xì)胞壁組成與裂果發(fā)生的關(guān)系。【方法】比較 2

個(gè)易裂果荔枝品種（‘桂味’‘糯米糍’）和 2 個(gè)不易裂果荔枝品種（‘懷枝’‘嶺豐糯’）花后 75 d 的果皮

碳水化合物含量變化，并觀察花后 60~85 d 果皮組織結(jié)構(gòu)和木質(zhì)素分布。利用 2,4-D 分別對 2 個(gè)果場的‘糯米糍’

果穗進(jìn)行浸泡處理，使用 GC-MS 測定裂果高發(fā)期的果皮可溶性糖含量，分光光度計(jì)法測定果皮淀粉和結(jié)構(gòu)性碳

水化合物含量，最后通過透射電鏡、果皮組織木質(zhì)素染色觀察荔枝果皮組織結(jié)構(gòu)?！窘Y(jié)果】易裂果的‘糯米糍’

果皮中己糖（果糖、葡萄糖、半乳糖）含量顯著低于不易裂果的‘懷枝’和‘嶺豐糯’。果膠含量與裂果易感

性之間關(guān)系復(fù)雜，‘糯米糍’果皮果膠含量較低、僅 1.7 mg/g，且果大、易裂果；‘桂味’果皮果膠含量高、為

4.0 mg/g，果小、也易裂果。2,4-D 處理后，前期暫時(shí)提高了座果率，但對最終座果率無顯著影響；2,4-D 處理可

導(dǎo)致果皮細(xì)胞層數(shù)增多，內(nèi)果皮細(xì)胞輪廓變模糊；與對照相比，40 mg/L 2,4-D 處理后果皮果膠含量增多、細(xì)胞

壁增厚、裂果率增加?！窘Y(jié)論】裂果易感性不同的荔枝品種果皮中碳水化合物含量存在明顯差異，其中果膠在

荔枝裂果中可能扮演雙重的角色，細(xì)胞膨大過程中果膠合成和降解呈動態(tài)變化，果膠含量過高則果皮延展性差，

果實(shí)小易裂果，果膠含量過低則果皮延展性好，果實(shí)大但抗裂性低、也易裂果；2,4-D 處理對‘糯米糍’最終座

果率無影響但顯著增加裂果風(fēng)險(xiǎn)。

關(guān)鍵詞：荔枝；裂果；果皮；可溶性糖；細(xì)胞壁組分；2,4- 二氯苯氧乙酸

中圖分類號：S667.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1004-874X（2023）09-0117-10

Study on the Relationship Between Cell Wall Components of

Pericarp and Fruit Cracking in Litchi

GE Hantao, LIN Shiya, WANG Huicong

（College of Horticulture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China）

Abstract:【Objective】By comparing the differences in cell wall components among litchi varieties with different

susceptibility to fruit cracking, the study aims to investigate the effects of exogenous application of auxin analogue 2,4-D

on the cell wall composition of pericarp and fruit cracking, and to further explore the relationship between the cell wall

synthesis metabolism and fruit cracking incidence.【Methods】The changes in carbohydrate contents of two easily cracked

litchi varieties (‘Guiwei’ and ‘Nuomici’) and two not easily-cracked litchi varieties (‘Huaizhi’ and ‘Lingfengnuo’) after

75 days of flowering were compared, and the tissue structure and lignin distribution of the pericarps at the 60-85 d after

flowering were observed. Fruit clusters of ‘Nuomici’ in two orchards were dipped into auxin analog 2, 4-D, and the soluble

sugar contents in the pericarps were determined by GC-MS. The starch and structural carbohydrate contents of the samples

were detected by using a spectrophotometer. Transmission electron microscopy and lignin staining were used to observe the

118

【研究意義】荔枝 (Litchi chinensis Sonn.) 的

種植面積在我國果樹面積中排第六，屬于大宗果

樹，產(chǎn)業(yè)地位重要。然而，一些優(yōu)質(zhì)荔枝品種裂

果高發(fā)是制約荔枝產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素，亟需對

裂果發(fā)生的內(nèi)在機(jī)制深入研究，以研發(fā)減輕荔枝

裂果的技術(shù)策略，為抗裂育種提供重要參考，促

進(jìn)荔枝產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展。【前人研究進(jìn)展】裂

果是一種生理性病害，是果實(shí)對內(nèi)部生長與外界

環(huán)境不協(xié)調(diào)而作出的應(yīng)激反應(yīng)［1］。果實(shí)從膨大

期到采收期都可能發(fā)生裂果現(xiàn)象，多集中在果實(shí)

膨大期，但部分果實(shí)也可能在采后出現(xiàn)開裂現(xiàn)

象［2-4］。裂果的發(fā)生主要是由果皮的生理失調(diào)導(dǎo)

致［5］，其破壞了果實(shí)的外觀，使果實(shí)內(nèi)部水分流

失、病原菌入侵，影響果實(shí)的采收，從而降低果

實(shí)的商品性［6］。果實(shí)開裂的現(xiàn)象常見于柑橘、荔

枝、棗和葡萄等果樹中［7-10］。與裂果相關(guān)因素的

研究大多集中在生理生化方面，關(guān)于水分、赤霉

素、脫落酸、鈣等因素對裂果的影響已有大量研

究報(bào)道［5］。荔枝果實(shí)的發(fā)育始于果皮和種皮的發(fā)

育，荔枝果實(shí)生長上著名的“球皮對球膽效應(yīng)”［11］

認(rèn)為，荔枝果皮在為假種皮提供生長空間的同時(shí)

又限制了假種皮的生長。當(dāng)果皮生長接近最大值

時(shí)，假種皮開始快速生長［12］。大量研究表明，

環(huán)境因素、礦質(zhì)營養(yǎng)、植物激素、細(xì)胞壁修飾酶、

果皮組織結(jié)構(gòu)和遺傳因素都可能與荔枝裂果的發(fā)

生有關(guān)［13-15］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在裂果高發(fā)期，

假種皮的突發(fā)性生長是裂果的直接原因，但對裂

果起關(guān)鍵作用的果皮生長情況已在果實(shí)發(fā)育的早

中期決定了。使用 2,4-D 對荔枝處理后可以促使

荔枝提前成熟［16］，而關(guān)于 2,4- 二氯苯氧乙酸

（2,4-D）對荔枝裂果的作用則報(bào)道較少。還有研

究表明，荔枝裂果與果皮細(xì)胞壁的降解代謝關(guān)系

密切，但有關(guān)細(xì)胞壁合成代謝方面研究也較少。

【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究比較裂果易感性不

同的荔枝品種細(xì)胞壁組分的差異，通過外源浸泡

2,4-D，揭示細(xì)胞壁組分與裂果發(fā)生的關(guān)系，初探

荔枝裂果發(fā)生機(jī)制，為荔枝防裂果栽培技術(shù)的研

發(fā)提供重要的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于 2021 年 4 月— 6 月在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)長崗山

荔枝種質(zhì)資源圃，選取樹齡約 20 年、樹體健壯、

長勢良好、花期相近的‘懷枝’‘嶺豐糯’‘桂味’‘糯

米糍’各 3 株作為比較試驗(yàn)樹，其中‘桂味’和‘糯

米糍’屬于易裂品種，在果實(shí)成熟期每株隨機(jī)采取

狀態(tài)相似的 10 穗果實(shí)，帶回實(shí)驗(yàn)室后，立即將果

皮分離并用清水清洗，用紗布吸干后放入液氮，后

轉(zhuǎn)入 -80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2021 年在深圳南山西麗果場第二分場和華南

農(nóng)業(yè)大學(xué)荔枝種質(zhì)資源圃各選擇樹體健壯、長勢

良好且相似的 3 株‘糯米糍’作為試驗(yàn)樹，進(jìn)行

生長素類似物 2,4-D 浸泡試驗(yàn)，并跟蹤調(diào)查果實(shí)

落果和開裂情況。

tissue structure of litchi pericarp.【Result】The contents of hexose including fructose, glucose and galactose in the pericarp of

cracking susceptible variety ‘Nuomici’ were significantly lower than those of low-cracking varieties ‘Huaizhi’ and ‘Lingfengnuo’.

A complicate relationship between pectin contents and fruit cracking susceptibility was found. In the pericarp of ‘Nuomici’, the

pectin content was only around 1.7 mg/g. And the fruit was bigger and susceptible to cracking. While in the cracking susceptible

smaller fruit variety ‘Guiwei’, the pericarp contained high pectin (4.0 mg/g). 2,4-D treatment only temporarily increased the fruit

setting rate of litchi in the early stage, but it had no significant impact on the final fruit setting rate. 2,4-D treatment could lead

to an increase in the number of layers of pericarp cells and the blurring of the contour of inner pericarp cells; Compared with

the control, the treatment with 40 mg/L 2,4-D resulted in an increase in pectin content, thickening of cell walls, and an increase

in fruit cracking rate.【Conclusion】There are significant differences in the contents of carbohydrates in the pericarps of litchi

varieties with different susceptibility to fruit cracking. Pectin may play a dual role in litchi fruit cracking. The development of

pericarp requires dynamic changes in pectin synthesis and degradation. Pectin might play dual role in the cracking of litchi

fruit. High pectin in the pericarp results in low expansion, smaller fruit size and higher cracking rate; while low pectin results in

higher pericarp expansion, larger fruit size and higher cracking rate. 2,4-D treatment show no significant effect on the final fruit

setting rate but will increase the risk of fruit cracking.

Key words: litchi (Litchi chinensis Sonn.); fruit cracking; pericarp; soluble sugar; cell wall component;

2,4-dichlorophenoxyacetic acid

119

1.2 外源 2,4-D 浸泡處理

從每株‘糯米糍’試驗(yàn)樹上隨機(jī)選取長勢一

致的果穗 80 穗進(jìn)行掛牌，在花后 28 d 分別用 10、

20、40 mg/L 的 2,4-D 浸泡，以清水為對照，每個(gè)

濃度處理 20 穗，處理后每周對落果數(shù)和裂果數(shù)進(jìn)

行調(diào)查統(tǒng)計(jì)。在果實(shí)轉(zhuǎn)色的裂果高發(fā)期（花后 75

d）將果實(shí)采下，將果皮分離并用清水清洗，用紗

布吸干后放入液氮，后轉(zhuǎn)入 -80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 荔枝果皮組織結(jié)構(gòu)觀察

1.3.1 透射電鏡樣品制備與觀察 在田間用干凈

的雙面刀片將果皮切成長 × 寬約為 0.3 cm×0.2 cm

的小塊，放入裝有 4% 戊二醛溶液的 2 mL 離心

管中，并用針管抽氣至樣品完全沉在管底，密封

后置于 4 ℃，固定過夜，用 0.1 mol/L 磷酸緩沖液

（pH=7.0）漂洗 4 次，每次 20 min。將樣品轉(zhuǎn)至

1% 鋨酸溶液中固定 2~4 h，ddH2

O 漂洗 4 次，每

次 20 min。用 1% 醋酸雙氧鈾塊染色，4 ℃ 過夜，

ddH2

O 漂洗 4 次，每次 20 min。依次用 30、50、

70、85、95% 的乙醇進(jìn)行脫水，每次 15 min，再

用 100% 的乙醇脫水 2 次，每次 20 min。將樣品

轉(zhuǎn)至純丙酮中浸泡 2 次，每次 20 min。依次用 3∶1、

1∶1、1∶3 的丙酮：樹脂滲透，每次 2~8 h，再

用純樹脂滲透 2 次，每次 12 h。將滲透后的樣品

轉(zhuǎn)至包埋板上用樹脂包埋，置于常溫干燥器，3 h

后放入烘箱，70 ℃ 聚合 24~48 h。

使用 Leica UC7 冷凍超薄切片機(jī)（德國徠卡公

司）對包埋好的樣品進(jìn)行切片，厚度為 70~90 nm，

用醋酸雙氧鈾溶液和檸檬酸鉛溶液對切片分別染

色 30 min。在 Talos L120C 型透射電鏡（美國 FEI

公司）中觀察切片中果皮的組織結(jié)構(gòu)，并測量不

同部位細(xì)胞壁的厚度。

1.3.2 果皮組織木質(zhì)素染色與分布觀察 參照 Yi

等［17］的方法進(jìn)行。

1.4 碳水化合物的提取和含量測定

參照 Yi 等［17］的方法測定荔枝果皮中非結(jié)構(gòu)

性碳水化合物（白堅(jiān)木皮醇、果糖、葡萄糖、半

乳糖、蔗糖、淀粉）、結(jié)構(gòu)性碳水化合物（果膠、

纖維素和半纖維素）和木質(zhì)素的含量，所測定的

值均為鮮重含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同裂果易感性荔枝品種果皮碳水化合物含

量比較

2.1.1 果皮非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量 花后 75 d

是各品種果實(shí)開始轉(zhuǎn)色的時(shí)期，也是裂果高發(fā)期。

比較裂果高發(fā)期 4 個(gè)品種果皮中非結(jié)構(gòu)碳水化合

物的含量（圖 1）發(fā)現(xiàn)，易裂荔枝品種‘桂味’和‘糯

米糍’的白堅(jiān)木皮醇含量分別為 9.8、8.5 mg/g，

小寫英文字母不同者表示差異顯著；HZ：‘懷枝’；LFN：‘嶺豐糯’；GW：‘桂味’；NMC：‘糯米糍’

Different lowercase letters represent significant differences; HZ: ‘Huaizi’; LFN: ‘Ningfengnuo’; GW: ‘Guiwei’; NMC: ‘Nuomici’

圖 1 不同荔枝品種果皮非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量比較

Fig. 1 Comparison of non-structural carbohydrate contents in the pericarp of different litchi varieties

120

顯著高于‘懷枝’的 7.5 mg/g；而‘桂味’和‘糯

米糍’的果糖含量（20.4、22.6 mg/g）則顯著低于‘懷

枝’（32.3 mg/g）?！鹞丁衅咸烟桥c半乳糖

含量顯著低于‘懷枝’中的葡萄糖與半乳糖含量。

‘糯米糍’中蔗糖和淀粉含量也顯著低于‘懷枝’

的蔗糖和淀粉含量。

2.1.2 果皮結(jié)構(gòu)性碳水化合物和木質(zhì)素含量 比

較裂果高發(fā)期 4 個(gè)品種果皮中結(jié)構(gòu)性碳水化合物

和木質(zhì)素含量（圖 2A），發(fā)現(xiàn)‘懷枝’果皮中的

果膠含量（7.8 mg/g）顯著高于‘嶺豐糯’（1.5

mg/g）和‘糯米糍’（1.1 mg/g），‘桂味’果皮

中果膠含量（4.3 mg/g）也顯著高于‘嶺豐糯’和‘糯

米糍’，其中‘糯米糍’果皮中果膠含量最低?！畱?/p>

枝’‘嶺豐糯’‘桂味’‘糯米糍’的半纖維素

和纖維素含量分別為 12.7、11.8、17.8、10.3 mg/g，

其中‘桂味’果皮中的半纖維素和纖維素含量顯

著高于其他 3 個(gè)品種，‘糯米糍’果皮中的半纖

維素和纖維素含量最低，顯著低于‘懷枝’?！?/p>

味’果皮中的木質(zhì)素含量（9.7 mg/g）也顯著高于

‘懷枝’（6.6 mg/g）和‘糯米糍’（6.7 mg/g）。

小寫英文字母不同者表示差異顯著。HZ：‘懷枝’；LFN：‘嶺豐糯’；GW：‘桂味’；NMC：‘糯米糍’

Different lowercase letters represent significant differences. HZ: ‘Huaizi’; LFN: ‘Ningfengnuo’; GW: ‘Guiwei’; NMC: ‘Nuomici’

圖 2 不同的荔枝品種果皮結(jié)構(gòu)性碳水化合物和木質(zhì)素含量比較

Fig. 2 Comparison of structural carbohydrate and lignin contents in the pericarp of different litchi varieties

2.1.3 果皮組織結(jié)構(gòu)和木質(zhì)素分布 為更加直觀

地觀察不同品種荔枝果皮組織結(jié)構(gòu)和木質(zhì)素的分

布，用間苯三酚 - 鹽酸對 4 個(gè)品種花后 60~85 d

的果皮進(jìn)行染色觀察。發(fā)現(xiàn)（圖 3）隨著果實(shí)的

發(fā)育，花后 70~75 d，4 個(gè)品種的果皮都顯著變薄，

這與裂果高發(fā)期的時(shí)間相符，花后 80 d 后，‘嶺

豐糯’和‘糯米糍’的果皮繼續(xù)變薄，而‘懷枝’

和‘桂味’則變化不大。另外，花后 75 d 后，‘懷

枝’的果皮整體被染得較紅，而‘糯米糍’的果

皮中則出現(xiàn)略微變褐的情況，表明該時(shí)期‘懷枝’

果皮中的木質(zhì)素含量高于‘糯米糍’。

2.2 2,4-D 處理對‘糯米糍’荔枝落果率和裂果

率的影響

2.2.1 落果率 在花后 28 d 用 10、20、40 mg/L

的 2,4-D 處理‘糯米糍’的果穗，在西麗果場（圖 4），

處理后 7 d，3 個(gè)處理的落果率分別為 26.5%、

32.2%、13.9%，處理后 14 d，3 個(gè)處理的落果率

分別為 52.8%、57.3%、33.9%，均極顯著低于對

照 的 52.8% 和 64.5%； 處 理 后 25 d，20 mg/L 和

40 mg/L 處理落果率分別為 64.5%、70.6%、仍顯

著低于對照（78.2%），但 10 mg/L 處理的落果率

（76.3%）已與對照無顯著差別；處理后 42 d，

20 mg/L 處理累積落果率（87.4%）甚至顯著高于

對照（80.6%）；處理后 52 d，處理與對照間的

落果率無顯著差異。在華農(nóng)果場的處理中（圖 4），

處理后 7 d，3 個(gè)處理的落果率分別為 86.3%、

85.9%、86.4%，均極顯著低于對照（87.9%）；

處 理 后 14 d，20 mg/L 和 40 mg/L 處 理 落 果 率 為

93.1% 和 93.2%、仍極顯著低于對照（96.4%），

但 10 mg/L 的處理與對照無顯著差異；處理后 21 d，

處理與對照間的落果率無明顯差異。這些結(jié)果表

明，2,4-D 在果實(shí)發(fā)育前期可保果，且濃度較大

保果效果較好，但 2,4-D 只是延遲果實(shí)的脫落，

對最終的座果率無顯著的影響。

121

HZ:‘懷枝’；LFN:‘嶺豐糯’；GW:‘桂味’；NMC:‘糯米糍’; DAA 60~85: 花后 60~85 d

HZ: ‘Huaizi’; LFN: ‘Ningfengnuo’; GW: ‘Guiwei’; NMC: ‘Nuomici’

DAA 60-85: 60-85 days after flowering

圖 3 不同荔枝品種果皮組織結(jié)構(gòu)和木質(zhì)素分布

Fig. 3 Tissue structure and lignin distribution in the pericarp of different litchi varieties

* 表示差異顯著，** 表示差異極顯著

* represents significant difference, * * represents extremely significant difference

圖 4 2,4-D 處理對‘糯米糍’荔枝落果率的影響

Fig. 4 Effect of 2,4-D treatment on fruit dropping rate of ‘Nuomici’ litchi

2.2.2 裂果率 對裂果率進(jìn)行調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)（圖 5），

在西麗果場的處理中，10 mg/L 處理后的果實(shí)沒有

出現(xiàn)開裂情況，20、40 mg/L 處理后的果實(shí)裂果率

分別為 2.78% 和 3.05%，均高于對照（1.08%），

但由于果穗之間的差異較大，處理與對照之間裂

果率差異均未達(dá)到顯著水平。在華農(nóng)果場的處理

中，3 個(gè)不同濃度的 2,4-D 處理均增加了裂果率，

且隨著 2,4-D 濃度增加裂果率升高，40 mg/L 2,4-D

處理后的累積裂果率達(dá) 10.75%，顯著高于對照的

1.9%。上述結(jié)果表明，高濃度的 2,4-D 處理顯著

122

增加裂果的發(fā)生。

2.2.3 2,4-D 處理對果皮組織結(jié)構(gòu)的影響 2,4-D

處理后果實(shí)開裂時(shí)間大大提早，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)荔

枝園 40 mg/L 處理的果實(shí)，在處理后 42 d 就開始

出現(xiàn)裂果。本研究取處理后 42 d 的樣品進(jìn)行透射

電鏡觀察發(fā)現(xiàn)（圖 6），2,4-D 處理后，果皮細(xì)胞

層數(shù)增多，內(nèi)果皮細(xì)胞輪廓變模糊，內(nèi)中果皮細(xì)

胞較大且大小不均。果皮組織結(jié)構(gòu)變化程度與處

理濃度呈正相關(guān)，說明果皮細(xì)胞層數(shù)、內(nèi)果皮細(xì)

胞輪廓清晰度和內(nèi)中果皮細(xì)胞大小與果皮應(yīng)力相

關(guān)，進(jìn)而影響了裂果。另外，外中果皮的薄壁細(xì)

胞明顯變小、數(shù)量增多，40 mg/L 2,4-D 處理的外

中果皮的細(xì)胞壁明顯增厚。

* 表示差異顯著

* represents significant difference

圖 5 2,4-D 處理對‘糯米糍’荔枝裂果率的影響

Fig. 5 Effect of 2,4-D treatment on fruit cracking rate

of ‘Nuomici’ litchi

1: 內(nèi)果皮；2: 海綿組織；3: 中果皮；4: 厚壁組織；5: 外果皮

1: Endocarp; 2: Spongy tissue; 3: Mesocarp; 4:Sclerenchyma; 5: Exocarp

圖 6 2,4-D 處理對‘糯米糍’荔枝果皮組織結(jié)構(gòu)的影響

Fig. 6 Effect of 2,4-D treatment on the tissue structure in pericarp of ‘ Nuomici’ litchi

2.2.4 2,4-D 處理對果皮細(xì)胞壁組分的影響

進(jìn)一步測定 2,4-D 處理后的每克鮮質(zhì)量果皮中細(xì)胞

壁組分的含量，結(jié)果如圖 7 所示，隨著果實(shí)發(fā)育，

處理組中果皮果膠含量逐漸下降，對照組中的果

膠含量則逐漸上升。在處理后 7 d 3 個(gè)濃度 2,4-D

處理的果膠含量分別為 6.0、8.9、12.1 mg/g，對照

組中的果膠含量僅為 2.7 mg/g，表明 2,4-D 處理

后顯著增加果皮果膠含量，且隨著處理濃度增加，

增加幅度加大。在處理后 42 d 除 40 mg/L 的果膠

含 量（10.3 mg/g） 仍 顯 著 高 于 對 照（5.9 mg/g）

外，兩個(gè)低濃度處理果皮中的果膠（4.8、6.7 mg/g）

均與對照無顯著差異。到花后 52 d，隨著對照

樣品果膠的增加和處理樣品果膠的減少，兩個(gè)

低濃度處理果膠含量（2.2、4.6 mg/g）均顯著低

于 對 照（7.7 mg/g）， 而 裂 果 最 嚴(yán) 重 的 40 mg/L

處理中果皮的果膠（8.9 mg/g）與對照無顯著差異。

不同濃度 2,4-D 處理對荔枝果皮半纖維素和纖維

素的含量（圖 7B）影響較小，高濃度處理在不

同的階段似乎會降低半纖維素和纖維素的水平，

但未達(dá)到顯著。處理對木質(zhì)素含量（圖 7C）的影

響也不明顯，在處理后 7 d，20、40 mg/L 處理的

木質(zhì)素含量（8.6、9.4 mg/g）均明顯低于對照和

123

10 mg/L（10.7、11.3 mg/g）的處理果皮，在其余

發(fā)育階段，對照和處理之間木質(zhì)素的含量無顯著

差異。

3 討論

3.1 不同品種荔枝果皮碳水化合物與細(xì)胞壁代謝

和裂果易感性的關(guān)系

碳水化合物是植物光合作用的主要產(chǎn)物，也

是植物生長發(fā)育過程的重要營養(yǎng)因子。葉片是光

合作用的主要場所，光合作用的同化產(chǎn)物從葉片

（源器官）運(yùn)輸?shù)焦麑?shí)（庫器官）后被分解成己糖，

磷酸戊糖途徑和糖酵解途徑進(jìn)一步將己糖代謝，

為植物提供生長發(fā)育所需的能量及代謝中間產(chǎn)

物，同時(shí)也為植物提供細(xì)胞碳架、調(diào)控相關(guān)基因

的表達(dá)與酶活性，從而影響植物的生長發(fā)育［18-20］。

己糖包含果糖、葡萄糖和半乳糖等，其中葡萄糖

是果膠與半纖維素和纖維素的重要合成前體，而

半乳糖是組成果膠的重要單體。有研究發(fā)現(xiàn)，在

果膠降解的過程中，果膠的合成前體半乳糖醛

酸、葡萄糖和阿拉伯糖等含量也會減少［21-24］，

說明己糖與細(xì)胞壁之間有著密不可分的關(guān)系。本

研究對裂果易感性不同的荔枝品種果皮中非結(jié)構(gòu)

性碳水化合物的變化趨勢與含量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，

裂果率低的‘懷枝’3 種己糖的含量明顯高于易

裂果的‘糯米糍’和‘桂味’。相對于己糖，白

堅(jiān)木皮醇和蔗糖的含量與裂果沒有明顯規(guī)律性的

聯(lián)系，表明果皮中的己糖水平與裂果的發(fā)生有重

要聯(lián)系，可能在果皮的細(xì)胞壁代謝和發(fā)育中發(fā)揮

重要作用［17］，影響果皮細(xì)胞壁的強(qiáng)度與完整性，

進(jìn)而影響裂果的易感性。

細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)性多糖組成的變化可能通過影響

細(xì)胞壁的完整性與機(jī)械性來影響果皮的結(jié)構(gòu)與狀

態(tài)，進(jìn)而影響裂果的發(fā)生［25］。原果膠在細(xì)胞壁

代謝過程中被降解成可溶性果膠，導(dǎo)致細(xì)胞壁胞

間層與初生壁分解，細(xì)胞間黏合力下降，破壞細(xì)

胞壁結(jié)構(gòu)［26］。果皮中原果膠與纖維素的減少，

會引起細(xì)胞壁總體結(jié)構(gòu)的破壞，降低果皮的硬度

與應(yīng)力，增加果實(shí)的開裂［27-29］。本研究中，‘懷枝’

的果膠含量明顯高于其他 3 個(gè)品種，易裂果的‘糯

米糍’果皮中的果膠基本上均低于其余 3 個(gè)品種。

半纖維素和纖維構(gòu)成了細(xì)胞壁的基本骨架，兩者

連接形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)保持細(xì)胞壁的穩(wěn)定性［24］，同

時(shí)纖維素微纖絲的排列方式也決定了細(xì)胞壁的致

密性［30］，果皮纖維素含量較高或纖維素酶活性

較低的果實(shí)一般開裂率較低［12］。本研究中，易

裂果的‘糯米糍’果皮半纖維素和纖維素含量均

明顯低于其他品種。次生壁中木質(zhì)素的沉積造成

木質(zhì)化，提高了細(xì)胞壁的強(qiáng)度［31］。觀察果皮組

織結(jié)構(gòu)和木質(zhì)素的分布可發(fā)現(xiàn)，‘糯米糍’果皮

纖維中的木質(zhì)素一直比‘懷枝’少，然而‘桂味’

中卻比‘懷枝’中多，表明裂果高發(fā)期果皮中果

膠含量可能更顯著影響裂果的發(fā)生。此外，在易

裂品種‘糯米糍’與‘桂味’中的細(xì)胞壁組成成

分含量與代謝可能存在差異（特別是半纖維素與

纖維素和木質(zhì)素），不同品種誘發(fā)果實(shí)開裂的具

體原因可能存在差異。

3.2 2,4-D 處理對‘糯米糍’荔枝細(xì)胞壁代謝和

裂果率的影響

2,4-D是生產(chǎn)上常用的一種保果生長調(diào)節(jié)劑，

在荔枝上使用的濃度一般為 10 mg/L，一些生產(chǎn)者

會提高 2,4-D 的濃度，以求達(dá)到更好的保果效果。

本研究設(shè)置了 10、20、40 mg/L 濃度的 2,4-D 對

小寫英文字母不同者表示差異顯著

Different lowercase letters represent significant differences

圖 7 2,4-D 處理對果皮細(xì)胞壁組分的影響

Fig. 7 Effect of 2,4-D treatment on the components of pericarp cell wall

124

‘糯米糍’進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)在果實(shí)發(fā)育前期，2,4-D

處理可顯著降低落果率，但在果實(shí)發(fā)育后期，落

果率與對照沒有顯著差異，且隨著使用濃度的增

加裂果率明顯上升。上述結(jié)果說明，2,4-D 可以

減少荔枝落果是果實(shí)發(fā)育前期的表象，后期反而

會增加裂果的風(fēng)險(xiǎn)。

果皮組織結(jié)構(gòu)的差異與完整性程度是裂果發(fā)

生的重要影響因素。表皮細(xì)胞的厚度、細(xì)胞壁的

厚度和角質(zhì)層的厚度都是影響裂果的因素［7,32］。

本研究中，2,4-D 處理在增加裂果率的同時(shí)，也

加厚了果皮的厚壁組織、外中果皮和內(nèi)果皮，說

明 2,4-D 可能誘導(dǎo)了細(xì)胞壁厚度的增加，而果皮

細(xì)胞壁的增厚可能限制細(xì)胞的膨大，降低了果皮

的延展性從而增加了開裂的發(fā)生。果皮的機(jī)械性

是保證果實(shí)完整性的重要性質(zhì)，果皮組織結(jié)構(gòu)的

差異與裂果息息相關(guān)［33-35］。易裂的荔枝果實(shí)外

果皮細(xì)胞較細(xì)長，而內(nèi)果皮的細(xì)胞層數(shù)較多且細(xì)

胞的輪廓不清晰，果實(shí)開裂處果皮組織的排列連

接變得模糊不清［36-38］。本研究對果皮進(jìn)行透射

電鏡觀察，發(fā)現(xiàn) 2,4-D 處理后果皮細(xì)胞層數(shù)增多，

內(nèi)果皮的細(xì)胞輪廓變模糊，內(nèi)中果皮細(xì)胞較大且

大小不均，同時(shí)外中果皮的薄壁細(xì)胞明顯變小、

數(shù)目增多，果皮組織結(jié)構(gòu)的變化和差異與前人研

究結(jié)果一致，說明果皮的細(xì)胞層數(shù)和中果皮的細(xì)

胞大小及均勻程度會影響果實(shí)的開裂。比較細(xì)胞

壁組分含量與變化，發(fā)現(xiàn)在裂果高發(fā)期時(shí)，在

2,4-D 誘導(dǎo)下的裂果果皮中半纖維素和纖維素含

量比對照低但差異不顯著；處理的果皮果膠含量

顯著高于對照，但發(fā)育過程中的果膠含量變化動

態(tài)有明顯區(qū)別，對照明顯增加，而處理明顯下降。

處理顯著增加果皮果膠的含量可能與細(xì)胞壁明顯

增厚有關(guān)，植物細(xì)胞的生長涉及細(xì)胞壁組成的降

解和重新合成，在生長發(fā)育過程中細(xì)胞壁代謝是

一個(gè)動態(tài)的過程，僅測定細(xì)胞壁的組分可能很難

判定 2,4-D 如何影響細(xì)胞壁代謝，進(jìn)一步的研究

需要探討處理后細(xì)胞壁代謝相關(guān)基因表達(dá)和酶活

性的變化。

4 結(jié)論

裂果易感性不同的荔枝品種果皮中非結(jié)構(gòu)性

碳水化合物與結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量存在明顯差

異，其中果皮中己糖和果膠的含量與裂果的發(fā)生

密切相關(guān)。易裂果的‘糯米糍’果皮中的果糖（22.6

mg/g）和蔗糖（18.6 mg/g）含量明顯低于不易裂

果的‘懷枝’（32.3、21.5 mg/g）；果膠與裂果

的關(guān)系較為復(fù)雜，本研究的 4 個(gè)品種中，易裂的‘糯

米糍’果皮果膠含量（1.1 mg/g）低于不易裂果的

‘懷枝’（7.8 mg/g）和‘嶺豐糯’（1.5 mg/g），

而同是易裂果的‘桂味’果皮果膠含量（4.3 mg/g）

則高于‘懷枝’和‘嶺豐糯’，說明果膠含量過

低或過高都可能導(dǎo)致裂果高發(fā)。2,4-D 處理后果

皮果膠增多，裂果率增加，進(jìn)一步表明高含量果

膠會增加裂果風(fēng)險(xiǎn)。

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（責(zé)任編輯 陳麗娥）

王惠聰，博士，教授，博士

生導(dǎo)師。主要從事果樹栽培生理

研究，現(xiàn)任廣東省荔枝工程技術(shù)

研究中心主任。主持國家自然科

學(xué)基金 4 項(xiàng)，發(fā)表學(xué)術(shù)論文 100 余

篇，其中 SCI 收錄 50 余篇，包括

在《Plant Physiology》《Plant

Journal》《Horticulture Research》

等國際知名期刊發(fā)表論文多篇。

獲國家科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)、廣東省科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)、神農(nóng)中華

農(nóng)業(yè)科技獎(jiǎng)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)獎(jiǎng)等科技成果 6 項(xiàng)，獲授權(quán)國家發(fā)明專

利 5 件。廣東省“五一”巾幗獎(jiǎng)和廣東省“五一”勞動獎(jiǎng)?wù)?/p>

獲得者，入選重慶“巴渝學(xué)者”人才計(jì)劃。

收稿日期：2023-07-26

基金項(xiàng)目：國家荔枝龍眼產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)（CARS-32-07）；國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2020YFD1000103）

作者簡介：張航（1999—），男，在讀碩士生，研究方向?yàn)閳@藝植物栽培與生理，E-mail：1326122415@qq.com

通信作者：李建國（1966—），男，博士，研究員，研究方向?yàn)槔?枝栽培生理與發(fā)育調(diào)控、種質(zhì)資源創(chuàng)新和利用，

E-mail：jianli@scau.edu.cn

廣東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2023，50（9）：127-134

Guangdong Agricultural Sciences DOI:10.16768/j.issn.1004-874X.2023.09.013

張航，何紫迪，孔子尚，梁志儉，覃宏銘，馬興帥，趙明磊，李建國 . ‘仙進(jìn)奉 ’荔枝結(jié)果母枝質(zhì)量與坐果和果實(shí)品質(zhì)

關(guān)系的研究［J］. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2023，50（9）：127-134.

‘仙進(jìn)奉 ’荔枝結(jié)果母枝質(zhì)量與坐果和

果實(shí)品質(zhì)關(guān)系的研究

張 航，何紫迪，孔子尚，梁志儉，覃宏銘，馬興帥，趙明磊，李建國

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東 廣州 510642）

摘 要：【目的】調(diào)查和分析‘仙進(jìn)奉’荔枝結(jié)果母枝質(zhì)量與坐果和果實(shí)品質(zhì)之間的相關(guān)性，比較不同質(zhì)

量結(jié)果母枝對坐果和果實(shí)品質(zhì)的影響，提出優(yōu)質(zhì)結(jié)果母枝量化標(biāo)準(zhǔn)，為生產(chǎn)上培養(yǎng)健壯結(jié)果母枝提供參考。【方

法】在‘仙進(jìn)奉’荔枝關(guān)鍵物候期測量和統(tǒng)計(jì)結(jié)果母枝質(zhì)量指標(biāo)（長度、粗度和葉片數(shù)）、初始掛果數(shù)、最終

留果數(shù)和果實(shí)品質(zhì)，利用小提琴圖、Person 相關(guān)系數(shù)和單因素 ANOVA 等方法對數(shù)據(jù)的分布、相關(guān)性和差異顯著

性進(jìn)行分析，并比較不同質(zhì)量結(jié)果母枝坐果和果實(shí)品質(zhì)的差異?！窘Y(jié)果】‘仙進(jìn)奉’結(jié)果母枝長度、粗度和葉

片數(shù)集中分布范圍分別為 10.2~14.5 cm、0.4~0.5 cm 和 28~38 片。初始掛果數(shù)與結(jié)果母枝粗度呈極顯著正相關(guān)，

最終座果率與長度和粗度呈極顯著正相關(guān)，結(jié)果母枝長度、粗度和葉片數(shù)與果實(shí)品質(zhì)同一性狀的相關(guān)性基本一致，

即全部正相關(guān)或負(fù)相關(guān)，其中單果重與粗度呈顯著正相關(guān)，TSS 和 TSS/TA 與葉片數(shù)顯著正相關(guān)。長度大于 14.5

cm 的結(jié)果母枝初始坐果數(shù)和最終座果率最高，分別為 16.95 個(gè)和 20.73%；粗度大于 0.5 cm 的結(jié)果母枝初始掛果

數(shù)、最終座果率、單果重和可食率均最高，分別為 15.48 個(gè)、28.03%、26.28 g 和 70.95%；葉片數(shù)大于 38 片的結(jié)

果母枝 TSS 含量和 TSS/TA 最高，分別為 18.36% 和 250.81?！窘Y(jié)論】‘仙進(jìn)奉’荔枝結(jié)果母枝健壯標(biāo)準(zhǔn)是長度、

粗度和葉片數(shù)分別大于 14.5 cm、0.5 cm 和 38 片。

關(guān)鍵詞：‘仙進(jìn)奉 ’荔枝；結(jié)果母枝；坐果；果實(shí)品質(zhì)；相關(guān)性分析；差異分析

中圖分類號：S667.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1004-874X（2023）09-0127-08

Study on the Relationship Between the Quality of

Fruit-bearing Shoot, Fruit Setting and Fruit Quality in

‘Xianjinfeng’ Litchi

ZHANG Hang, HE Zidi, KONG Zishang, LIANG Zhijian, QIN Hongming,

MA Xingshuai, ZHAO Minglei, LI Jianguo

（College of Horticulture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China）

Abstract: 【Objective】This study aimed to investigate and analyze the correlation between the quality of fruitbearing shoots in ‘Xianjinfeng’ litchi and fruit setting and fruit quality. Tthe effects of different quality fruit-bearing shoots

on fruit setting and quality were compared. The quantitative standard of high quality fruit branches was put forward to

provide reference for the development of strong fruit branches in production.【Method】During the key phenological period,

the quality indicators of fruit-bearing shoots in ‘Xianjinfeng’ litchi, including length, diameter, and number of leaves, were

128

【研究意義】荔枝（Litchi chinensis Sonn.）

是原產(chǎn)于我國云南的重要熱帶亞熱帶經(jīng)濟(jì)果樹，

荔枝產(chǎn)業(yè)已成為一些地區(qū)由“脫貧攻堅(jiān)”向“鄉(xiāng)

村振興”轉(zhuǎn)型的支柱產(chǎn)業(yè)之一。但荔枝生產(chǎn)中一

直存在生理落果嚴(yán)重的難題，導(dǎo)致荔枝大小年結(jié)

果嚴(yán)重，打擊種植者信心，同時(shí)特優(yōu)鮮食品種比

例偏低的產(chǎn)業(yè)現(xiàn)實(shí)，嚴(yán)重制約荔枝產(chǎn)業(yè)發(fā)展［1-4］。

果實(shí)品質(zhì)是影響荔枝商品價(jià)值的重要因素，荔枝

果實(shí)發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)大部分由結(jié)果母枝和其

葉片提供［5-6］，因此培育健壯的結(jié)果母枝是提高

荔枝產(chǎn)量和品質(zhì)的重要生產(chǎn)措施。生產(chǎn)上常將末

次秋梢作為來年結(jié)果母枝，而末次秋梢長度、粗

度和葉片數(shù)量是衡量結(jié)果母枝健壯程度的重要指

標(biāo)［7-8］?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，研究者在荔枝［9］、

龍眼［10］、蜜橘［11］、獼猴桃［12］、核桃［13］和金柑［14］

果樹中進(jìn)行了結(jié)果母枝質(zhì)量與坐果和果實(shí)品質(zhì)的

相關(guān)性研究，指出‘石硤’龍眼［10］、‘香玲’

核桃［13］和‘融安’金柑［14］坐果數(shù)與結(jié)果母枝粗

度均呈正相關(guān)，南豐蜜橘［11］和‘東紅’獼猴桃［12］

結(jié)果母枝粗度與固酸比和糖酸比之間分別呈負(fù)相

關(guān)和正相關(guān)。徐寧等［15］研究發(fā)現(xiàn)，‘三月紅’‘妃

子笑’等多個(gè)荔枝品種的結(jié)果母枝粗度與最終坐

果數(shù)呈正相關(guān)，與可溶性固形物含量之間的相關(guān)

性存在差異。以上研究結(jié)果表明，不同果樹種類、

同一果樹不同品種的結(jié)果母枝與坐果和果實(shí)品質(zhì)

的關(guān)系存在異同。研究者也通過比較不同結(jié)果母

枝長度、粗度和葉片數(shù)對坐果和果實(shí)品質(zhì)的影響，

提出不同果樹不同品種的最適結(jié)果母枝標(biāo)準(zhǔn)，如

‘寧杞 7 號’枸杞［16］結(jié)果母枝截留長度為 20 cm

有利于提高產(chǎn)量；‘黑葉’荔枝［17］結(jié)果母枝粗

度在 0.5 cm 以上時(shí)落果最少；早熟柑橘‘興津早

生’結(jié)果母枝著生 7 片葉對果實(shí)品質(zhì)有顯著影響。

【本研究切入點(diǎn)】‘仙進(jìn)奉’荔枝是由廣東省農(nóng)

業(yè)科學(xué)院果樹研究所主持選育的優(yōu)質(zhì)晚熟品種，

具有果實(shí)厚、可食率高、遲熟、蜜香等優(yōu)良特性，

在廣東和廣西均有大面積引種［8,18］。目前，尚未

見‘仙進(jìn)奉’荔枝結(jié)果母枝質(zhì)量與坐果和果實(shí)品

質(zhì)關(guān)系的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】分析‘仙

進(jìn)奉’結(jié)果母枝質(zhì)量與初始坐果數(shù)、最終座果率

和果實(shí)品質(zhì)的相關(guān)性，比較不同質(zhì)量結(jié)果母枝坐

果和果實(shí)品質(zhì)的差異，為‘仙進(jìn)奉’荔枝結(jié)果母

枝培養(yǎng)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為廣州市增城區(qū)郭仔農(nóng)業(yè)有限公司

果園高接換種后 10 年生‘仙進(jìn)奉’荔枝（中間砧

木為‘妃子笑’），樹高約 3.5 m，冠徑 5 m，株

行距 6 m×7 m。

1.2 試驗(yàn)方法

2023 年 3 月 27 日選取樹冠大小一致、生長

勢相近的‘仙進(jìn)奉’荔枝 5 株，在每株樹東、南、

measured and statistically analyzed. Number of initial fruit setting and final fruit setting with fruit quality were also assessed.

Violin plots, Pearson correlation coefficients, and one-way ANOVA were utilized to analyze the distribution, correlation, and

significance of the data, as well as to compare the differences in fruit setting and quality among fruit-bearing shoots of different

qualities.【Result】The length, diameter, and number of leaves of fruit-bearing shoots in ‘Xianjinfeng’ litchi were concentrated

within the ranges of 10.2-14.5 cm, 0.4-0.5 cm, and 28-38 leaves, respectively. The number of initial fruit setting exhibited a

significant positive correlation with the diameter of the mother branches, while the final fruit setting rate showed a significant

positive correlation with both length and diameter. The correlation between the length, diameter, and number of leaves of fruitbearing shoots and the same fruit quality traits was generally consistent, either positively or negatively correlated. Notably, single

fruit weight demonstrated a significant positive correlation with diameter, while TSS (Total Soluble Solids) and TSS/TA (Total

Soluble Solids/Titratable Acidity) showed a significant positive correlation with the number of leaves. Fruit-bearing shoots with

a length greater than 14.5 cm exhibited the highest initial fruit setting number (16.95 fruits) and final fruit setting rate (20.73%).

Fruit-bearing shoots with a diameter greater than 0.5 cm exhibited the highest initial fruit setting number (15.48 fruits), final

fruit setting rate (28.03%), single fruit weight (26.28 g), and edible rate (70.95%). Fruit-bearing shoots with more than 38 leaves

exhibited the highest TSS (18.36%) and TSS/TA (250.81).【Conclusion】Based on the findings, a robust standard for fruitbearing shoots in 'Xianjinfeng' litchi was determined as having a length greater than 14.5 cm, diameter greater than 0.5 cm, and

number of leaves greater than 38.

Key words: ‘Xianjinfeng’ litchi; fruit-bearing shoot; fruit setting; fruit quality; correlation analysis; difference analysis

129

西、北 4 個(gè)方位分別隨機(jī)挑選 10 條末次秋梢（結(jié)

果母枝）掛牌，用于測定結(jié)果母枝粗度、長度、

葉片數(shù)量、初始掛果數(shù)和最終坐果數(shù)，果實(shí)成熟

后，每條結(jié)果母枝隨機(jī)采摘 2~3 個(gè)果實(shí)進(jìn)行果實(shí)

品質(zhì)測定。

1.2.1 結(jié)果母枝質(zhì)量測定 于 2023 年 3 月 27 日，

第 2 批雄花盛開期，使用精確度為 0.1 cm 的鋼尺

測量末次秋梢長度，使用精確度為 0.01 mm 的游

標(biāo)卡尺測量末次秋梢中部粗度，末次秋梢的小葉

數(shù)即為葉片數(shù)。

1.2.2 初始掛果數(shù)調(diào)查 于 2023 年 4 月 6 日，果

實(shí)分單期，調(diào)查每株樹掛牌標(biāo)記的結(jié)果母枝的初

始掛果數(shù)。

1.2.3 最終座果率測定 于 2023 年 6 月 21 日果

實(shí)成熟時(shí)，統(tǒng)計(jì)每株樹掛牌標(biāo)記的結(jié)果母枝的存

留果數(shù)。

最終座果率（%）=（初始坐果數(shù) - 存留果數(shù)）/

初始坐果數(shù) ×100

1.2.4 果實(shí)品質(zhì)測定 使 用 日 本 ATAGO pal-1

數(shù) 顯 糖 度 計(jì) 測 量 可 溶 性 固 形 物（TSS） 含 量，

可滴定酸（TA）含量采用酸堿滴定法，固酸比

（TSS/TA）為可溶性固形物與可滴定酸的比值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用 Excel 和 Origin 2021 軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)

統(tǒng)計(jì)分析及作圖，使用 SPSS 22.0 軟件進(jìn)行單因素

ANOVA 和皮爾遜相關(guān)性分析。采用小提琴圖展示

結(jié)果母枝質(zhì)量指標(biāo)分布趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘仙進(jìn)奉’荔枝結(jié)果母枝質(zhì)量指標(biāo)分布情況

使用小提琴圖分析 200 條結(jié)果母枝質(zhì)量指標(biāo)

（長度、粗度和葉片數(shù)）的分布情況，結(jié)果（圖 1）

表明，‘仙進(jìn)奉’荔枝結(jié)果母枝長度和其集中分

布范圍分別為 6.2~20.9 cm 和 10.2~14.5 cm，結(jié)果

母枝粗度和其集中分布范圍分別為 0.3~0.6 cm 和

0.4~0.5 cm，結(jié)果母枝葉片數(shù)和其集中分布范圍分

別為 15~53 片和 28~38 片。長度＜ 14.5 cm、粗度

＜ 0.5 cm、葉片＜ 38 片結(jié)果母枝均占 75%。

圖 1 ‘仙進(jìn)奉’荔枝結(jié)果母枝長度（A）、粗度（B）和葉片數(shù)（C）分布情況

Fig. 1 Distribution of length(A), diameter(B), and number of leaves (C) of the fruit-bearing shoots in ‘Xianjinfeng’ litchi

2.2 ‘仙進(jìn)奉’荔枝結(jié)果質(zhì)量指標(biāo)與初始掛果數(shù)、

最終座果率和果實(shí)品質(zhì)相關(guān)性分析

由表 1 可知，結(jié)果母枝長度、粗度和葉片數(shù)

與初始掛果數(shù)、最終座果率和果實(shí)品質(zhì)呈正相關(guān)

和負(fù)相關(guān)的指標(biāo)分別有 16 對和 8 對，其中極顯著

正相關(guān)和顯著正相關(guān)均為 3 對，表明結(jié)果母枝質(zhì)

量變化會對坐果和果實(shí)品質(zhì)產(chǎn)生顯著影響。結(jié)果

母枝長度與最終座果率呈極顯著正相關(guān)，粗度與

初始掛果數(shù)和最終座果率呈極顯著正相關(guān)，葉片

數(shù)與初始掛果數(shù)和最終座果率呈正相關(guān)、但均未

達(dá)到顯著水平；除可食率外，結(jié)果母枝長度、粗

度和葉片數(shù)與同一果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性一致，

130

即全部正相關(guān)或負(fù)相關(guān)，其中粗度和單果重呈顯

著正相關(guān)，葉片數(shù)與 TSS 和 TSS/TA 呈顯著正相

關(guān)。綜上，結(jié)果母枝質(zhì)量尤其是粗度對初始掛果、

最終坐果和果實(shí)重量影響最大，葉片數(shù)對 TSS 和

TSS/TA 影響最大。

2.3 ‘仙進(jìn)奉’荔枝結(jié)果母枝長度對坐果和果實(shí)

品質(zhì)影響

由 表 2 可 知， 最 終 座 果 率 隨 結(jié) 果 母 枝 長

度增加而變大，這與表 1 中長度和最終座果率

相 關(guān) 性 分 析 結(jié) 果 一 致， 其 中 結(jié) 果 母 枝 長 度 在

10.0~14.5 cm 和 14.5 cm 以上的最終座果率分別為

19.53% 和 20.73%，顯著大于 10 cm 以下的最終

座果率；長度和初始坐果數(shù)相關(guān)性并無規(guī)律，結(jié)

果母枝長度在 10 cm 以下和 14.5 cm 以上的初始

坐果數(shù)分別為 16.16 個(gè)和 16.95 個(gè)，均顯著大于結(jié)

果母枝長度在 10.0~14.5 cm 的初始坐果數(shù)；單果

重、焦核率、可食率和 TA 等果實(shí)品質(zhì)雖存在差異，

但均未達(dá)到顯著水平。綜上，‘仙進(jìn)奉’荔枝結(jié)果

母枝最適長度是 14.5 cm 以上，其初始坐果數(shù)和

最終座果率最優(yōu)。

表 1‘仙進(jìn)奉’荔枝結(jié)果母枝質(zhì)量指標(biāo)與果實(shí)品質(zhì)相關(guān)系數(shù)

Table 1 Correlation coefficient between the quality indexes of the fruit-bearing shoots and fruit quality of ‘Xianjinfeng’ litchi

相關(guān)指標(biāo)

Correlation

indexes

初始掛果數(shù)

Number of

initial fruit setting

最終座果率

Final fruit

setting rate

單果重

Single fruit

weight

焦核率

Ratio of

abortive seed

可食率

Edible portion TSS TA TSS/TA

長度 Length 0.049 0.236** 0.271 -0.290 -0.208 0.023 -0.198 0.216

粗度 Diameter 0.282** 0.370** 0.329* -0.140 -0.213 0.034 -0.050 0.090

葉片數(shù) Number of leaves 0.128 0.113 0.227 -0.064 0.011 0.309* -0.201 0.310*

注：* 表示差異顯著 (P<0.05)，** 表示差異極顯著（P<0.01）。

Note: * indicate significant difference at P<0.05, and **indicate extremely significant differences at P<0.01.

表 2 ‘仙進(jìn)奉’荔枝結(jié)果母枝不同長度對坐果和果實(shí)品質(zhì)影響

Table 2 Effects of different lengths of the fruit-bearing shoots on fruit setting and fruit quality in ‘Xianjinfeng’ litchi

結(jié)果母枝長度

Length of fruitbearing shoot (cm)

初始坐果數(shù)

Number of

initial fruit setting

最終座果率

Final fruit

setting rate (%)

單果重

Single fruit

weight (g)

焦核率

Ratio of abortive

seed (%)

可食率

Edible

portion (%)

TSS (%) TA (%) TSS/TA

<10 16.16±2.43a 6.01±1.45b 24.48±0.35a 54.39±3.58a 73.41±0.33a 17.97±0.10a 0.094±0.010a 194.63±20.63a

10.0~14.5 10.64±0.90b 19.53±2.39a 24.67±0.33a 59.28±4.70a 73.91±0.30a 17.81±0.16a 0.085±0.004a 212.06±11.62a

>14.5 16.95±1.91a 20.73±3.37a 25.22±0.53a 54.51±6.16a 72.81±0.86a 18.04±0.05a 0.085±0.007a 216.58±18.38a

注：同列數(shù)據(jù)后小寫英文字母不同者表示差異顯著（P<0.05）。

Note: Different lowercase letters after data in the same column represent significant differences (P<0.05).

表 3 ‘仙進(jìn)奉’荔枝結(jié)果母枝不同粗度對坐果和果實(shí)品質(zhì)的影響

Table 3 Effects of different diameters of the fruit-bearing shoots on fruit setting and fruit quality in ‘Xianjinfeng’ litchi

結(jié)果母枝粗度

Diameter of fruitbearing shoot(cm)

初始坐果數(shù)

Number of

initial fruit setting

最終座果率

Final fruit

setting rate (%)

單果重

Single fruit

weight (g)

焦核率

Ratio of abortive

seed (%)

可食率

Edible

portion (%)

TSS (%) TA (%) TSS/TA

<0.4 8.76±1.40b 10.48±2.50b 22.55±0.61c 53.33±6.07a 68.68±1.84b 18.08±0.35a 0.103±0.001a 176.13±5.32a

0.4~0.5 14.87±1.17a 14.81±1.73b 24.04±0.39b 54.29±3.88a 69.25±0.74b 18.79±0.21a 0.104±0.005a 187.69±8.12a

>0.5 15.48±1.79a 28.03±4.68a 26.28±0.19a 57.33±0.06a 70.95±0.46a 18.87±0.23a 0.094±0.004a 205.03±17.78a

注：同列數(shù)據(jù)后小寫英文字母不同者表示差異顯著（P<0.05）。

Note: Different lowercase letters after data in the same column represent significant differences (P<0.05).

2.4 ‘仙進(jìn)奉’荔枝不同粗度結(jié)果母枝對坐果和

果實(shí)品質(zhì)的影響

由表 3 可知，隨著結(jié)果母枝粗度增加，初始

坐果數(shù)、最終座果率和單果重逐漸增加。其中，

粗度 0.4~0.5 cm 和 0.5 cm 以上的結(jié)果母枝初始坐

果數(shù)分別為 14.87 個(gè)和 15.48 個(gè)，顯著高于粗度

在 0.4 cm 以下的結(jié)果母枝；粗度在 0.5 cm 以上、

0.4~0.5 cm 和 0.4 cm 以下的單果重分別為 26.28、

24.04 和 22.55 g，3 者之間均存在顯著差異；粗

度在 0.5 cm 以上的最終座果率和可食率分別為

131

28.03% 和 70.95%，顯著高于粗度在 0.4 cm 以下

和 0.4~0.5 cm 的結(jié)果母枝；不同粗度結(jié)果母枝的

TA、TSS 和 TSS/TA 雖存在差異，但未達(dá)到顯著

水平。綜上，‘仙進(jìn)奉’荔枝結(jié)果母枝最適粗度

為 0.5 cm 以上，其初始坐果數(shù)、最終座果率、單

果重和可食率均顯著優(yōu)于 0.5 cm 以下的結(jié)果母枝，

但焦核率、TSS 和 TA 等果實(shí)品質(zhì)無顯著差異。

2.5 ‘仙進(jìn)奉’荔枝不同葉片數(shù)結(jié)果母枝對坐果

和果實(shí)品質(zhì)的影響

由表 4 可知，隨著葉片數(shù)增加，果實(shí) TSS 和

TSS/TA 逐漸增加，其中葉片數(shù)在 38 片以上的結(jié)

果母枝果實(shí)的 TSS（18.36%）和 TSS/TA（250.81）

顯著高于葉片數(shù) 38 片以下的結(jié)果母枝；葉片數(shù)在

30 片以下的結(jié)果母枝果實(shí) TSS 和 TSS/TA 最低，

分別為 17.79% 和 209.98。不同葉片數(shù)結(jié)果母枝

的初始坐果數(shù)、最終座果率和單果重等果實(shí)品質(zhì)

雖存在差異，但均未達(dá)到顯著水平。綜上，‘仙

進(jìn)奉’最適結(jié)果母枝葉片數(shù)是 38 片以上，其 TSS

和 TSS/TA 顯著高于 38 片以下的結(jié)果母枝，但初

始坐果數(shù)和最終座果率以及單果重和焦核率等果

實(shí)品質(zhì)無顯著差異。

表 4 ‘仙進(jìn)奉’荔枝結(jié)果母枝不同葉片數(shù)對坐果和果實(shí)品質(zhì)影響

Table 4 Effects of different leaf numbers of the fruit-bearing shoots on fruit setting and fruit quality in ‘Xianjinfeng’ litchi

結(jié)果母枝葉片數(shù)

Number of fruitbearing shoot leaves

初始坐果數(shù)

Number of

initial fruit setting

最終座果率

Final fruit setting

rate (%)

單果重

Single fruit

weight (g)

焦核率

Ratio of abortive

seed (%)

可食率

Edible

portion (%)

TSS (%) TA (%) TSS/TA

<30 12.89±1.56a 14.38±2.71a 24.87±0.35a 51.25±4.82a 73.46±0.35a 17.79±0.13b 0.085±0.002a 209.98±2.99b

30~38 13.34±1.35a 15.82±1.85a 25.72±0.36a 56.49±4.12a 74.08±0.23a 17.81±0.24b 0.084±0.005a 214.88±11.97b

>38 14.95±1.45a 21.94±4.60a 24.40±0.33a 56.99±4.48a 73.24±0.27a 18.36±0.05a 0.074±0.004a 250.81±11.47a

注：同列數(shù)據(jù)后小寫英文字母不同者表示差異顯著（P<0.05）。

Note: Different lowercase letters after data in the same column represent significant differences (P<0.05).

3 討論

3.1 ‘仙進(jìn)奉’荔枝結(jié)果母枝質(zhì)量與坐果和果實(shí)

品質(zhì)密切相關(guān)

前人研究結(jié)果顯示，結(jié)果母枝粗度是影響果

樹坐果的重要原因之一，如‘香玲’核桃［13］、‘妃

子笑’荔枝［19］、‘桂味’荔枝［20］和‘大烏圓’

龍眼［21］的最終坐果量與結(jié)果母枝粗度呈顯著正

相關(guān)。也有報(bào)導(dǎo)指出，結(jié)果母枝長度或葉片數(shù)與

‘大丁香’‘三月紅’和‘草莓荔’荔枝最終坐

果量呈顯著正相關(guān)［15］。蔡小林等［22］研究發(fā)現(xiàn)，

‘石硤’龍眼結(jié)果母枝長度、直徑和葉片數(shù)與落

果率之間呈負(fù)相關(guān)，而周翡云等［14］指出，‘融

安’金柑最終坐果量與結(jié)果母枝長度、粗度和葉

片數(shù)均呈顯著正相關(guān)。以上研究表明，不同物種

或品種的結(jié)果母枝質(zhì)量與坐果的相關(guān)性存在較大

差異，本研究結(jié)果與前人研究存在異同，即‘仙

進(jìn)奉’荔枝坐果主要受結(jié)果母枝長度和粗度雙重

影響，與結(jié)果母枝葉片數(shù)相關(guān)性不顯著，其中結(jié)

果母枝粗度與初始坐果數(shù)和最終座果率呈顯著正

相關(guān)，長度與最終座果率呈顯著正相關(guān)。

不同物種或品種的結(jié)果母枝質(zhì)量和果實(shí)品質(zhì)

之間的關(guān)系也存在差異，如前人研究發(fā)現(xiàn)‘石硤’

龍眼［22］、‘早鐘 6 號’枇杷［23］和‘三月紅’荔枝［15］

果實(shí) TSS 與結(jié)果母枝粗度呈顯著正相關(guān)，而 ‘妃

子笑’荔枝［19］和‘黑珍珠’櫻桃［24］果實(shí) TSS

與結(jié)果母枝粗度未呈顯著負(fù)相關(guān)，‘貴妃’枇杷［25］

果實(shí) TSS 與夏梢結(jié)果母枝長度呈顯著正相關(guān)。本

試驗(yàn)結(jié)果顯示，‘仙進(jìn)奉’荔枝果實(shí) TSS 與結(jié)果

母枝葉片數(shù)呈顯著正相關(guān)，單果重與結(jié)果母枝長

度、粗度和葉片數(shù)均呈正相關(guān)，說明提高結(jié)果母

枝質(zhì)量能顯著增加果實(shí)質(zhì)量，但‘桂熱 1 號’火

龍果［26］、‘國慶一號’溫州蜜柑［27］、‘妃子笑’［19］

和‘大丁香’［15］荔枝果實(shí)單果重與結(jié)果母枝長度、

粗度和葉片數(shù)的相關(guān)性并不一致。

3.2 ‘仙進(jìn)奉’荔枝結(jié)果母枝健壯量化標(biāo)準(zhǔn)

為提高坐果和果實(shí)品質(zhì)，研究者針對不同果

樹提出了相對應(yīng)量化的健壯結(jié)果母枝標(biāo)準(zhǔn)，對于

大部分荔枝品種，結(jié)果母枝粗度越大，其坐果數(shù)

就越多。例如，嚴(yán)婷等［28］調(diào)查發(fā)現(xiàn)，‘糯米糍’

荔枝結(jié)果母枝粗度在 0.4 cm 以上掛果多且均勻；

李曉河等［29-30］指出，提高‘桂味’荔枝結(jié)果母枝

粗度在 0.41 cm 以上比例，是提高座果率的關(guān)鍵；

林躍平［31］指出‘雞嘴荔’荔枝結(jié)果母枝粗度在

132

0.3 cm 以上時(shí)，結(jié)果母枝越粗壯，坐果力越強(qiáng)，本

研究結(jié)果與此規(guī)律一致，但也存在如‘靈山香荔’

荔枝［31］結(jié)果母枝粗度大于 0.5 cm 后坐果反而減少

的品種。鐘利文［32］通過回歸方程預(yù)測得出，當(dāng)‘妃

子笑’荔枝結(jié)果母枝長度在 19.8 cm 時(shí)坐果量最高；

葉淑媛等［33］通過比較不同樹勢香榧結(jié)果母枝和結(jié)

實(shí)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)當(dāng)結(jié)果母枝粗度為 1.91~2.50 mm、

長度為 5.51~8.70 cm 時(shí)，掛果量最大。本研究通過

比較結(jié)果母枝長度、粗度和葉片數(shù)對‘仙進(jìn)奉’

坐果的影響，發(fā)現(xiàn)結(jié)果母枝長度 14.5 cm 以上的初

始坐果數(shù)和最終座果率最高，分別為 16.95 個(gè)和

20.73%；粗度大于 0.5 cm 的初始掛果數(shù)和最終座

果率最高，分別為 15.48 個(gè)和 28.03%。

易淑瑤等［12］指出，‘東紅’獼猴桃結(jié)果母

枝粗度為 0.8~1.0 cm 的果實(shí)綜合品質(zhì)最佳。對于

不同種類的果樹來說，結(jié)果母枝粗度并不是越大，

果實(shí)品質(zhì)就越佳，如結(jié)果母枝粗度≤ 0.25 cm 時(shí)

‘南豐蜜橘’果實(shí)固酸比最高、化渣性最好［11］。

董雪潔等［34］發(fā)現(xiàn)早熟柑橘‘興津早生’結(jié)果枝

著生 7 片葉對果實(shí)品質(zhì)有顯著影響，張國濤等［35］

指出‘赤霞珠’葡萄每結(jié)果枝留 10 片葉摘心有

利于葡萄品質(zhì)形成。本研究發(fā)現(xiàn)‘仙進(jìn)奉’荔枝

結(jié)果母枝粗度大于 0.5 cm 時(shí)其單果重和可食率最

高，分別為 26.28 g 和 70.95%；葉片數(shù)大于 38 片

時(shí)，果實(shí) TSS 和 TSS/TA 最高，分別為 18.36% 和

250.81。田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，‘仙進(jìn)奉’結(jié)果母枝長

度＜ 14.5 cm、粗度＜ 0.5 cm、葉片數(shù)＜ 38 片的

比例均超過 75%，表明大部分‘仙進(jìn)奉’結(jié)果母

枝不符合健壯的標(biāo)準(zhǔn)，因此在生產(chǎn)中應(yīng)重視荔枝

采后修剪和施肥、適時(shí)放梢、適度控梢、害蟲防

治和合理水肥等環(huán)節(jié)［36-38］，以培養(yǎng)符合健壯標(biāo)

準(zhǔn)的結(jié)果母枝，從而提高產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，‘仙進(jìn)奉’荔枝結(jié)果母枝長

度與最終座果率呈極顯著正相關(guān)，粗度與初始坐果

數(shù)、最終座果率和單果重呈極顯著或顯著正相關(guān)，

葉片數(shù)與 TSS 和 TSS/TA 呈顯著正相關(guān)?！蛇M(jìn)奉’

結(jié)果母枝長度＞ 14.5 cm 時(shí)最終座果率最高，粗度

＞ 0.5 cm 時(shí)初始坐果數(shù)、最終座果率、單果重和可

食率最高，葉片數(shù)＞38片時(shí)果實(shí)TSS和TSS/TA最高。

因此認(rèn)為，‘仙進(jìn)奉’荔枝結(jié)果母枝健壯標(biāo)準(zhǔn)是長

度＞ 14.5 cm、粗度＞ 0.5 cm、葉片數(shù)＞ 38 片。

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