二、研究成果

96

四、結(jié)論與展望

以上細胞試驗結(jié)果有力證明了單獨及混合霉菌毒素 AFB1 和 AFM1 對腸道

屏障的毒性作用。并且，AFB1 和 AFM1 存在著交互作用。牛奶中的霉菌毒素

可能會對人體腸道造成一定的負面影響，從而引發(fā)腸道相關疾病。因此，進一

步研究霉菌毒素在體內(nèi)生理吸收、代謝、轉(zhuǎn)化規(guī)律十分必要。建議在食品中、

尤其是嬰幼兒配方食品中優(yōu)化相關的霉菌毒素尤其是 AFB1 的安全限量標準。

研究成果已在學術(shù)期刊《Toxins》2021 年第 13 期上發(fā)表。該研究得到國家

自然科學基金（31972190）和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項資金（CARS-36）等

項目支持，高亞男和包曉宇為共同第一作者，鄭楠博士為通訊作者。

——Y. N. Gao, X. Y. Bao, L. Meng, H. M. Liu, J. Q. Wang, N. Zheng*,

Aflatoxin B1 and Aflatoxin M1 Induce Compromised Intestinal Integrity through

Clathrin-Mediated Endocytosis. 2021, 13, 184.

二、研究成果

97

工業(yè)區(qū)牧場生乳中重金屬的風險評估

奶牛養(yǎng)殖環(huán)境是保障生乳安全的基本和前提條件，隨著人口增長、工業(yè)化

和城市化進程的加快，各種污染物被排放到環(huán)境中。一些重金屬已廣泛分布在

環(huán)境中，特別是 Cr（鉻）、As（砷）、Cd（鎘）和 Pb（鉛），促進了它們進

入人類食物鏈對人類健康產(chǎn)生負面影響。美國毒物和疾病登記署（ATSDR）根

據(jù)毒性、發(fā)生率和人類暴露的可能性，制定了應優(yōu)先考慮的食品污染物清單，

其中 As、Pb、Cd 和 Cr 被列為了第 1、第 2、第 7 和第 17 位。為了保障人類健

康，我國將生乳中 As、Cr 和 Pb 的限量分別定為 0.1、0.3 和 0.05 mg/kg。生乳

中這些重金屬的含量不僅可以作為牛奶衛(wèi)生的直接指標，也可以作為生乳生產(chǎn)

地區(qū)環(huán)境污染的間接指標。

重金屬污染源包括采礦、靠近道路、燃料燃燒和工業(yè)活動。我們假設，由

于工業(yè)活動，如果當?shù)厮?、土壤和青玉米中的重金屬含量較高，當?shù)仫曫B(yǎng)的奶

牛所產(chǎn)生乳中的重金屬含量就會升高。

本研究從河北唐山、天津、內(nèi)蒙古呼和浩特工業(yè)區(qū)垃圾焚燒場、水泥場附

近 18 個牧場，山東濰坊、黑龍江齊齊哈爾農(nóng)區(qū) 2 個牧場采集樣本。評估工業(yè)活

動對牧場生乳、水、飼料和土壤中 Cr、As、Cd 和 Pb 污染水平的影響，探索生

乳、青貯玉米、水和土壤中重金屬之間的關系，以及重金屬從環(huán)境到生乳的可

能途徑，并對當?shù)鼐用裢ㄟ^牛奶暴露重金屬的風險進行了評估。

生乳中 Cr、As、Cd 和 Pb 的含量范圍分別為 0.54–10.61、0.10–1.49、0.02–

0.39 和 ND–15.22 μg/kg（表 1）。工業(yè)區(qū)生乳中 Cr 和 As 的含量分別為

2.41±2.12 和 0.44±0.31 μg/kg，顯著高于非工業(yè)區(qū)的 1.10±0.15 和 0.25±0.09 μg/kg

（P<0.01）（圖 1）。

二、研究成果

表 1 工業(yè)區(qū)和非工業(yè)區(qū)牧場生乳樣品重金屬含量(μg/kg)

N Cr As Cd Pb 非工業(yè)區(qū) I 5 平均值±標準差 1.17±0.15bc 0.33±0.03c 0.05 ± 0.02 c 0.45 ± 0.07 b

范圍 1.06–1.37 0.31–0.38 0.04–0.09 0.40–0.56

II 5 平均值±標準差 1.04±0.15c 0.17±0.02b 0.11 ± 0.04 ab 0.94 ± 0.19 b

范圍 0.87–1.28 0.13–0.19 0.04–0.15 0.74 –1.18

工業(yè)區(qū) III 25 平均值±標準差 1.18±0.22c 0.24±0.09bc 0.13 ± 0.09 a 4.46 ± 2.45 a

范圍 0.90–1.89 0.12–0.53 0.04–0.41 2.26 –12.68

IV 35 平均值±標準差 1.86±1.24b 0.42±0.24a 0.11 ± 0.06 a 2.68 ± 3.60 b

98

范圍 0.54–7.03 0.16–1.47 0.02–0.31 ND–15.22

V 30 平均值±標準差 4.09±2.72a 0.64±0.38a 0.09 ± 0.08 bc 2.29 ± 3.10 b

范圍 0.87–10.61 0.10–1.49 0.02–0.39 ND–10.12

合計 100 平均值±標準差 2.28±2.01 0.42±0.40 0.10±0.07 2.18 ± 3.16

范圍 0.54–10.61 0.10–1.49 0.02–0.39 ND–15.22

限量 300 100 20 50

注：N表示樣本數(shù)；I、 II、III、IV和V分別代表齊齊哈爾、濰坊、唐山、天津和呼和浩特；同一列中上標小寫字母（a、b、

c）不同表示有顯著差異（P<0.05）。

二、研究成果

99

圖 1. 工業(yè)區(qū)和非工業(yè)區(qū)生乳中重金屬濃度的比較

工業(yè)區(qū)和非工業(yè)區(qū)青貯玉米中 Cr、As、Cd 和 Pb 的濃度分別為 1.57–4.84、

0.06–0.29、0.01–0.09 和 0.26–1.17 mg/kg 和 1.05–1.66 0.05–0.11 0.02–0.03 和

0.16–0.22 mg/kg。工業(yè)區(qū)和非工業(yè)區(qū)水中 Cr、As、Cd 和 Pb 的濃度范圍分別為

ND–4.93、0.15–2.80、ND–0.040 和 0.01–0.10 μg/L 和 0.07–0.38、0.30–0.47、

0.001–0.005 和 0.09–0.15μg/L。工業(yè)區(qū)和非工業(yè)區(qū)土壤中 4 種重金屬的含量范圍

分別為 42–218、3.73–17.30、0.06–0.27 和 21–42 mg/kg、59–133、5.48–10.20、

0.09–0.10 和 24–29 mg/kg。青貯玉米中 Cr、As、Cd 和 Pb 的含量低于中國的限

量標準。水中的 Cr、As、Cd 和 Pb 濃度低于中國飲用水的限量，土壤中的 Cr、

As、Cd 和 Pb 濃度低于中國農(nóng)業(yè)土壤的風險篩選值。

表 2 工業(yè)區(qū)和非工業(yè)區(qū)牧場奶牛飲水、土壤、TMR 和青貯飼料重金屬

重金屬 非工業(yè)區(qū) 工業(yè)區(qū) 限量

青貯玉米(mg/kg)

Cr 1.05–1.66 1.57–4.84 5

As 0.05–0.11 0.06–0.29 2

Cd 0.02–0.03 0.01–0.09 1

Pb 0.16–0.22 0.26–1.17 30

水 (μg/L)

Cr 0.07–0.38 ND–4.93 50

As 0.30–0.47 0.15–2.80 10

Cd 0.001–0.005 ND–0.040 5

二、研究成果

100

Pb 0.09–0.15 0.01–0.10 10

土 (mg/kg)

Cr 59–133 42–218 250 a

As 5.48–10.20 3.73–17.30 240 a

Cd 0.09–0.10 0.06–0.27 0.8 a

Pb 24–29 21–42 170 a

注: a 農(nóng)業(yè)土壤風險管理(pH > 7.5 mg/kg) .

生乳和青貯玉米中的 Cr 含量呈中度正相關（r=0.626），而生乳中的 Cr 含

量與飲水中的 Cr 含量幾乎沒有相關性（r=0.041），與土壤中的 Cr 含量呈弱負

相關（r=0.344）。生乳和水中 As 濃度呈中度正相關（r=0.637），而生乳濃度

與青貯玉米濃度呈弱正相關（r=0.326）。生乳與土壤 As 含量呈弱負相關（r=-

0.112）。生乳 Cd 濃度與青貯玉米（r=0.676）和土壤（r=0.557）呈中度正相

關。生乳和水樣中的 Cd 濃度呈弱正相關（r=0.119）。生乳中 Pb 含量與青貯玉

米中 Pb 含量（r=0.194）和土壤中 Pb 含量（r=0.327）呈弱正相關，而與水中 Pb

含量（r=0.046）幾乎沒有相關性。

青貯玉米中 Cr 濃度與土壤濃度呈中度正相關（r=0.604），As 濃度與水分

濃度呈中度正相關（r=0.556）。青貯玉米中 Cd、Pb 含量與土壤濃度呈中度正

相關（r=0.739，r=0.654），與水濃度呈弱正相關（r=0.444，r=0.424）。推斷生

乳中 Cr 的來源可能是土-青貯玉米-生乳，As 來源可能是水-青貯玉米-生乳或水生乳，而 Cd 的來源可能通過土（水）-青貯玉米-生乳，其他飼料原料可能是生

乳 Pb 重要來源。

表 3 生乳、青貯玉米、水和土中重金屬相關性分析

Cr As Cd Pb

生乳-青貯玉米 0.626 ** 0.326 0.676 ** 0.194

生乳-水 0.041 0.637 ** 0.119 0.046

生乳-土 0.344 ?0.112 0.557 * 0.327

青貯玉米-水 0.076 0.556 * 0.444 * 0.424

二、研究成果

101

青貯玉米-土 0.604 ** 0.180 0.739 ** 0.654 **

水-土 ?0.045 0.113 0.237 0.341

注: * P < 0.05, ** P < 0.01.

(a) (b)

圖 2. 3 至 69 歲人群的鉻和鎘暴露值（μg/kg/天）與 TDI 和 PTDI 的比較。

膳食暴露是評估食品污染物和確定潛在健康風險的有效方法。本研究計算

了不同年齡（3–69 歲）人群通過牛奶暴露 Cr、As、Cd 和 Pb 的 EDI 值。女性和

男性的 Cr、As、Cd 和 Pb 結(jié)果分別為 0.0120–0.0758、0.0022–0.0138、0.0005–

0.0035 和 0.0151–0.0959 μg/kg/d 和 0.0101–0.0726、0.0018–0.0132、0.005–0.0033

和 0.0128–0.0919 μg/kg/d。這些重金屬的 EDI 值低于 Cr、As、Cd 和 Pb 的 RfD

值（分別為 3.0、0.3、1 和 4 μg/kg/d）。通過牛奶暴露 Cr 的 EDI 值遠低于 TDI

（0.9 μg/kg BW）暴露 Cd 的 EDI 低于 TDI (0.9 μg/kg BW)。

圖 3 總結(jié)了 3 至 69 歲人群通過牛奶暴露重金屬的目標危害商（THQ）和危

害指數(shù)（HI）。暴露 Cr、As、Cd、Pb 的 THQ 值與年齡呈負相關。As、Cr、Pb

和 Cd 對總 THQ 的貢獻率分別為 46.64%、25.54%、24.30%和 3.52%。

二、研究成果

102

圖 3. 3 至 69 歲人群飲用牛奶后四種重金屬暴露的目標危害商（THQ）和危

害指數(shù)（HI）。

結(jié)論：工業(yè)區(qū)奶牛生乳中 Cr、As 含量顯著高于非工業(yè)區(qū)奶牛生乳中 Cr、

As 含量。生乳中 Cr 的來源途徑可能是土-青貯玉米-生乳，As 可能是水-青貯玉

米-生乳或水-生乳，而 Cd 的來源可能通過土（水）-青貯玉米-生乳，其他飼料

原料可能是生乳 Pb 重要來源。通過牛奶暴露 Cr、As、Cd 和 Pb 對消費者造成

的健康風險低。鑒于工業(yè)污染會引起生乳中重金屬含量升高，強烈建議對牛場

建立一個連續(xù)的生乳監(jiān)測系統(tǒng)，特別是在受高濃度重金屬污染的地區(qū)。

研究成果已于 2021 年 11 月發(fā)表在《Toxics》雜志。該成果由生乳中環(huán)境

污染物風險評估項目、中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系

專項資金資助，第一作者蘇傳友、高亞男，通訊作者鄭楠、王加啟。

——Chuanyou Su ?, Yanan Gao ?, Xueyin Qu, Xuewei Zhou, Xue Yang,

Shengnan Huang, Lei Han, Nan Zheng* and Jiaqi Wang *. The Occurrence,

Pathways, and Risk Assessment of Heavy Metals in Raw Milk from Industrial Areas

in China. Toxics. Toxics. 2021, 9(12), 320

二、研究成果

103

3. 奶產(chǎn)品營養(yǎng)功能評價

熱處理條件對牛奶乳清蛋白組分含量的影響

蛋白質(zhì)是構(gòu)成免疫力防御功能的物質(zhì)基礎，而乳清蛋白是免疫監(jiān)視、防御和

調(diào)控的最重要小分子蛋白質(zhì)，被認為是“蛋白之王”。因乳清蛋白對熱敏感，需要

開展乳品加工熱處理影響乳清蛋白活性的研究，從而為提升奶類品質(zhì)提供基礎證

據(jù)。

熱處理導致牛奶中的乳清蛋白性質(zhì)及其營養(yǎng)成分發(fā)生變化。本研究基于

TMT 10-plex labels 蛋白組定量技術(shù)，對比分析了巴氏殺菌（85°C）和超高溫滅

菌（UHT, 135℃）條件對牛奶乳清蛋白成分的改變。試驗共鑒定到 223 種蛋白，

這些蛋白主要參與了內(nèi)肽酶活性負調(diào)控的生物學過程和蛋白結(jié)合的分子功能（圖

1）。

表 1 乳清蛋白的主要功能途徑

二、研究成果

104

不同熱處理導致 32 種乳清蛋白呈現(xiàn)差異表達，這些差異蛋白主要參與了抗

原加工提呈、蛋白聚糖在癌癥中的作用等生物學過程（表 1）。

表 1. 熱處理影響 KEGG 富集通路分析

KEGG 通路名

稱

蛋白名稱 超高溫滅菌/巴氏

殺菌的差異

抗原加工提呈

蛋白質(zhì)二硫異構(gòu)酶 A3 前體物 1.29

組織蛋白酶 L1 前體物 1.31

β2-微球蛋白 1.23

溶酶體

組織蛋白酶 L1 前體物 1.31

激活蛋白原前體物 0.82

組織蛋白酶 D 前體物 0.81

吞噬體

組織蛋白酶 L1 前體物 1.31

Ras 相關 C3 肉毒毒素底物 1 前體物 1.21

單核細胞分化抗原 CD14 前體物 0.78

癌癥中的蛋白

聚糖

組織蛋白酶 L1 前體物 1.31

Ras 相關 C3 肉毒毒素底物 1 前體物 1.21

金屬蛋白酶抑制劑 3 前體物 0.83

其中，UHT 處理導致 17 種乳清蛋白豐度相對升高，這類乳清蛋白屬于非

熱敏感類蛋白質(zhì)；15 種乳清蛋白豐度顯著降低，屬于熱敏感類蛋白（表 2）。

對這部分蛋白進行生物功能分析顯示：它們具備生物免疫調(diào)制活性功能。巴氏

二、研究成果

105

殺菌對這些蛋白的破壞則較為輕微，側(cè)面反映巴氏殺菌對乳清蛋白的功能活性

保留較好。

表 2. 15 種對熱處理敏感類牛奶蛋白

蛋白名稱

超高溫滅

菌/巴氏殺菌的

差異

αS2-酪蛋白前體物 0.70

腎素受體前體物 0.74

溶質(zhì)載體家族 28 成員 3 亞型 X1 0.74

免疫球蛋白 g 重鏈 Mem5-樣蛋白, 部分 0.78

單核細胞分化抗原 CD14 前體物 0.78

Ras 相關蛋白 Rab-18 0.79

蛋白激酶 c 結(jié)合蛋白 NELL2 前體物 0.81

組織蛋白酶 D 前體物 0.81

激活蛋白原前體物 0.82

Ras 相關蛋白 Rab-11A 0.82

C 4b 結(jié)合蛋白鏈亞型 X6 0.82

αS1-酪蛋白亞型 X5 0.82

金屬蛋白酶抑制劑 3 前體物 0.83

富含半胱氨酸的分泌蛋白 3 前體物 0.83

烯醇酶亞型 X1 0.83

另一方面，135°C 滅菌奶中的乳過氧化物酶含量顯著高于前人研究報道中

使用的 142°C 熱處理。因此，在兼顧貨架儲存期、運輸距離和活性功能等方

面，適當降低滅菌溫度，可以減少牛奶中營養(yǎng)功能物質(zhì)的熱損傷或損失。

二、研究成果

106

研究成果已被《Molecules》雜志接收，該成果由中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)科技

創(chuàng)新工程重大產(chǎn)出科研選題(CAAS-ZDXT2019004)、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專

項資金（CARS-36）、中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-IAS12）資助。

—— Zhang Y, Min L, Zhang S, Zheng N, Li D, Sun Z, Wang J. 2021.

Proteomics Analysis Reveals Altered Nutrients in the Whey Proteins of Dairy Cow

Milk with Different Thermal Treatments. Molecules, 26, 4628.

二、研究成果

107

熱處理對牛奶 microRNA 組成的影響

一 、研究背景

生乳（RM）可以將哮喘和過敏的風險降低 30%-50%，早期食用 RM，呼吸

道感染和發(fā)燒的風險可顯著降低約 30%，但是食用 RM 有潛在的感染風險，如

布魯氏菌病、李斯特菌、結(jié)核病或腸出血性大腸桿菌會導致溶血性尿毒癥綜合

征。考慮到 1 歲嬰兒呼吸道感染的高發(fā)病率，如果能夠克服 RM 的健康風險，

熱處理生乳得到無病原體的牛奶可能會對公共衛(wèi)生產(chǎn)生重大影響。

牛奶中的熱敏成分（如脂類、蛋白質(zhì)甚至微生物成分）在超高溫(UHT)處理

過程中發(fā)生了變性。據(jù)報道，牛奶中的 microRNA(miRNA)可被人體血液吸收并

對人類健康有益，熱處理和均質(zhì)化導致牛奶中 63%的 mir-200c 損失和 67%的 mir29b 損失。然而，熱處理對牛奶中 miRNA 影響的信息至今仍缺乏。因此，本研

究目的是揭示不同的熱處理方式對牛奶中 miRNA 含量的影響，從而為“優(yōu)質(zhì)奶”

的加工、處理提供理論支撐。

二、實驗方法

1. 牛奶樣品和熱處理

我們從一家商業(yè)牛奶廠獲得了所有的牛奶樣品，包括RM、巴氏殺菌奶（PM）

和超高溫處理奶（UM）。在每個試驗中，來自同一批的牛奶都經(jīng)過巴氏殺菌或

UHT 處理。擠奶后 24 小時內(nèi)，RM 被冷藏到 4°C，PM（85°C 15s）和 UM（135°C

15s）在-20°C 保存后分析。三批樣本中第一批 RM 采集自 1500 多頭奶牛，重 40.6

噸(t)，其中 9.6t 進行巴氏殺菌，31t 采用 UHT 處理。第二批 RM 采集自 1500 多

頭奶牛，重 48.8t，其中 8.3t 進行巴氏殺菌，40.5t 采用 UHT 工藝處理。第三批采

集自 1200 多頭奶牛，重 34.6t，其中 8.9t 進行巴氏殺菌，25.7t 通過 UHT 工藝進

行處理。

2. 總RNA提取與純化

二、研究成果

108

使用 miRNeasy Mini Kit 從牛奶樣本中提取總 RNA(包括小 RNA)。將提取的

牛奶樣品放在冰上，與氯仿按 1:5 的比例混合。將洗脫后的 RNA 溶解在 30μL 水

中，使用 Qubit2.0 熒光計測量總 RNA 濃度和 260/280 的比值。使用生物分析儀

2100 系統(tǒng)和小 RNA 芯片試劑盒評估 miRNA 濃度、純度、miRNA/小 RNA 比值

和 RNA 完整性。RNA 質(zhì)量經(jīng)變性瓊脂糖凝膠電泳驗證。RNA 樣本在?80°C 下

保存至分析。

3. RNA測序過程

根據(jù)制造商的說明，使用 RNA Library Prep Kit 構(gòu)建測序文庫。利用 Illumina

Hiseq 2500 平臺對文庫進行測序,使用 FastQC 評估序列、序列位置和長度分布的

Phred 質(zhì)量分數(shù)。使用 SAMtools 計算序列的 GC 百分比、長度、重復水平并生成

read counts。

4. 定量聚合酶鏈反應(qPCR)驗證

取合格的基因組樣本(30ng)匹配相對應的引物，qPCR 過程按照制造商的說

明進行。PCR 條件為：95°C 30s（預變性），94°C 30s（變性），57°C 30s（退

火），72°C 30s（延伸）共 35 個循環(huán)，最終在 72°C 處延伸 8min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)純

化后溶于洗脫緩沖液。使 Bioanalyzer 檢測文庫片段的范圍和濃度。

5. RNA測序分析

利用 R 軟件(https://cran.r-project.org)構(gòu)建熱圖，R ade4 軟件包用于主成分分

析(PCA)。使用 VennDiagram (https://cran.r-project.org)繪制維恩圖?；虮倔w(GO)

富集和基因和基因組 Kyoto Encyclopedia (KEGG) 通路分別用

http://www.geneontology.org http://www.genome.jp/kegg/pathway.html 分析。使用

Rfam 數(shù)據(jù)庫中的信息對 miRNA 讀取序列進行分析。

6. 數(shù)據(jù)分析

通過 SPSS 軟件中的 Tukey 比較分析數(shù)據(jù)，結(jié)果均以平均值±標準誤 (SEM)

顯示。

二、研究成果

109

三、結(jié)果與討論

1. PCA結(jié)果和miRNA測序

使用 Rfam 數(shù)據(jù)庫提取得到的 rRNAs、小核 Rnas(snRNAs)、小核仁

RNAs(snoRNAs)和 tRNAs(tRNAs)并進行注釋（表 1）。主成分分析（PCA）、熱

圖與 Veen 圖結(jié)果證實，RM 與 PM 關系密切，RM 與 UM 之間的 miRNA 變化顯

著，表明 UHT 處理顯著影響牛奶 miRNAs（圖 1）。

表 1 使用 Rfam 數(shù)據(jù)庫（生奶）統(tǒng)計 miRNAs

Rfam filtered small

RNA

Total

reads

Total percentage

(%)

Unique

reads

Unique percentage

(%)

rRNA 106993 0.560345 32298 2.82157

tRNA 182524 0.879555667 13213 1.13387

snRNA 21260 0.1082188 6802 0.582962

snoRNA 119637 0.595279 12954 1.11676667

圖 1 RM、PM 和 UM 中的 miRNA 的 PCA(A)、熱圖(B)和 Venn 圖(C)

二、研究成果

110

2. 熱處理對牛奶miRNAs含量和特性的影響

PM（RM 的 82.90%）和 UM（RM 的 68.21%）中 miRNAs 含量與 RM 相比

均顯著降低。具有前 2 名 read count 的 miRNAs 含量（含有 22 和 23 個核苷酸的

miRNAs）在 PM 和 UM 中顯著降低（圖 2A）。UM 中 miRNAs 的平均長度和

GC 占比與 RM 比顯著增加，這表明 UHT 處理可能會提高 miRNAs 的穩(wěn)定性（圖

2B-E）。

圖 2 熱處理對 RM、PM 和 UM 的總 read counts（A）、22 核苷酸 miRNAs

的 read counts（B）、23 核苷酸 miRNAs 的 read counts（C）、長度（D）和

GC 占比（E）的影響。

二、研究成果

111

3. 通過qPCR驗證miRNA的含量

qPCR 的驗證結(jié)果與 RNA 測序結(jié)果一致（圖 3）。

圖 3 通過 qPCR 驗證 RM、PM 和 UM 中 miRNA 的表達

4.GO富集分析

圖 4 表明，結(jié)果表明，基因在三個主要的生物過程中富集：細胞組分(如 RNA

聚合酶 II 啟動子調(diào)控轉(zhuǎn)錄、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導)、生物過程（如質(zhì)膜、細胞骨架等）

和分子功能 (如 RNA 聚合酶 II 核心啟動子近端區(qū)域序列、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合和 ATP

結(jié)合)。

二、研究成果

112

圖 4 在 RM、PM 和 UM 差異表達 miRNA 的 GO 富集

5.KEGG富集法分析靶基因

利用 KEGG 數(shù)據(jù)庫分析靶基因的通路，結(jié)果表明靶基因在癌癥、人乳頭瘤

病毒感染、人乳頭瘤病毒感染和氨基酸（酪氨酸和組氨酸）代謝等通路顯著富集

(圖 5)。在 RM、PM 和 UM 中差異顯著的排名前 20 的 miRNA（圖 6）主要功能

是抗癌、抗炎和抗疾病。

圖 5 在 RM、PM 和 UM 差異表達 miRNA 的 KEGG 通路圖

二、研究成果

113

圖 6 在 RM、PM 和 UM 中差異表達且豐度排名前 20 的 miRNA

6.討論

在本研究中，RM 和 PM 中顯示了 191 個常見的 miRNAs，但 RM 與 UM 相

關的常見 miRNAs 很少，原因可能是 miRNAs 可以被外泌體保護，而這種保護被

UHT 處理破壞。工業(yè)牛奶加工中的低熱強度可能有助于保護 miRNA 免于降解，

并保持良好的特性，UHT 可能會使這種影響消失。本研究中鑒定出的前 20 個差

異 miRNAs 的功能見表 2。RM 具有潛在的病原體，并不是預防策略的最優(yōu)，而

巴氏殺菌對牛奶中的 miRNA 沒有顯著的影響，未來，miRNA 的生物活性功能有

待驗證和探索。

五、、結(jié)論與展望

UHT 處理顯著損失了 miRNAs 的含量，而巴氏殺菌處理則不那么顯著，這

些結(jié)果表明，含有生物活性 miRNA 且不含致病菌的巴氏殺菌奶可能對人體健康

更有利。研究提示“優(yōu)質(zhì)奶”的產(chǎn)出過程中應該考慮使用巴氏殺菌法替代超高溫滅

菌法進行滅菌，減少乳中活性 miRNA 和其他活性物質(zhì)的損傷或失活，能夠更充

分的發(fā)揮牛奶對人體的健康作用。

二、研究成果

114

該成果由中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程重大產(chǎn)出科研選題、動物營養(yǎng)學

國家重點實驗室開放課題、中央高校基本科研業(yè)務費、中國現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體

系資助。張養(yǎng)東、許慶彪、侯金秀為共同第一作者，王加啟研究員為通訊作者。

—— Zhang Y#, Xu Q#, Hou J#, Huang G, Zhao S, Zheng N, Wang J*. Loss of

bioactive microRNAs in cow's milk by ultra-high-temperature treatment but not by

pasteurization treatment. J Sci Food Agric. 2021 Oct 23. doi: 10.1002/jsfa.11607. Epub

ahead of print. PMID: 34689341.

二、研究成果

115

牛奶十八碳脂肪酸的氣質(zhì)聯(lián)用檢測方法

脂肪酸（FA）是乳脂發(fā)揮營養(yǎng)功能的主要活性因子。由于乳 FA 組成的復

雜性導致其在色譜分離上存在困難，單次進樣的方法難以全面地分析乳 FA。針

對 FA 有效色譜分離的研究被廣泛關注，尤其是 FA 的位置異構(gòu)體和幾何異構(gòu)

體。由于不飽和脂肪酸在瘤胃中異構(gòu)化和生物氫化作用以及乳腺的去飽和作

用，C18 FA 在乳脂中具有眾多的同分異構(gòu)體，這些異構(gòu)體具有潛在的健康益處

和風險。因此，C18 FA 的準確測定是乳 FA 分析的關鍵和難點。

氣相色譜（GC）的方法被廣泛應用于 FA 的鑒定和定量，在檢測前 FA 通

常需要轉(zhuǎn)化為脂肪酸甲酯（FAME）進行分析。為了提高 C18 FA 的色譜分離

度，研究學者們通過嘗試使用不同的色譜柱或溫度程序?qū)?C18 FA 進行分離，

將兩次分離的結(jié)果結(jié)合起來對 C18 FA 進行整體分析。還有研究學者應用銀離

子色譜法在 GC 分析前預先分離 C18 FA 的順式和反式異構(gòu)體，并通過 4 次進樣

檢測更多種類的 C18 FA。然而，多次進樣檢測的方法耗時、費力、成本高，并

且會增大數(shù)據(jù)處理過程中的誤差。在定量方面，氫火焰離子化檢測器（FID）因

計算簡單被廣泛用作 GC 檢測器，但 FID 對牛奶中低豐度脂肪酸含量檢測靈敏

度不足，而質(zhì)譜（MS）檢測器在選擇離子監(jiān)測（SIM）模式下能明顯提高靈敏

度，同時以相對更寬或更合理的線性范圍滿足乳 C18 FA 巨大的含量差異變

化。在甲酯化時，常用多步驟法衍生化 C18 FA，包括 GC 分析前的堿催化和酸

催化反應。然而，堿催化反應對游離 FA 的轉(zhuǎn)化較弱，而酸催化反應的高溫條

件可能導致共軛亞油酸等不飽和脂肪酸被降解。因此，高分辨率、高靈敏度和

穩(wěn)定簡便的甲酯化處理是建立牛奶中 C18 FA 準確定量方法的基礎。

本試驗擬通過調(diào)整氣相色譜條件優(yōu)化分離度、建立質(zhì)譜的選擇離子方法提

高靈敏度、對比經(jīng)不同甲酯化溫度處理的牛奶樣品的 C18 FA 含量，確定最適

的甲酯化溫度，旨在建立高分辨、高靈敏的牛奶 C18 FA 的檢測方法，并通過

線性、靈敏度、準確度、精密度等指標進行方法驗證，最后應用建立的檢測方

法，分析生乳、巴氏殺菌乳、超高溫滅菌乳中 C18 FA 的種類和含量。

二、研究成果

116

1 實驗方法

1.1 樣品前處理

將冷凍牛奶樣品置于 40°C 的水浴中預熱解凍。解凍后的牛奶樣品，充分混

勻，用于后續(xù)的脂肪酸含量分析。樣品前處理依據(jù) AOAC 996.06 和 Serafim 等的

方法，準確移取 2 mL 均勻試樣至 15 mL 離心管中，加入 5 mL 氨水、1 mL 乙醇

和 50 mg 焦性沒食子酸，隨后，將離心管放入 70℃水浴 20 min。水解完成后，

取出離心管冷卻至室溫。而后，加入 4 mL 正己烷/異丙醇混合溶液（V / V = 3/2），

渦旋振蕩 30 s 后，于 4℃、12000 rpm 離心 3 min。將正己烷相移至帶蓋耐高溫試

管中，向水解試樣中加正己烷 1.3 mL，于相同條件下離心，轉(zhuǎn)移正己烷相后，繼

續(xù)向水解試樣中加正己烷 1.3 mL，離心轉(zhuǎn)移正己烷相，收集三次所得的正己烷相

中即包含脂肪提取物。

向包含脂肪提取物的正己烷相中加入 2 mL 氫氧化鈉-甲醇溶液（2%），擰緊

試管蓋，搖勻，于 50℃水浴 20 min 進行堿催化甲酯化。冷卻至室溫后，加入 2

mL 乙酰氯-甲醇（10%）進行酸催化甲酯化處理，比較了不同反應溫度(60℃、70℃、

80℃和 90℃)和反應時間(90 min和 150 min)下的十八碳脂肪酸甲酯（C18 FAME）

產(chǎn)率。只用堿催化甲酯化(50°C，20min)處理的樣品作為對照組，不進行額外的酸

催化。冷卻至室溫后，加入 5ml 超純水，使兩相界面更加清晰。轉(zhuǎn)移正己烷相至

10 mL 棕色容量瓶中，用正己烷定容。加入約 0.5 g 無水硫酸鈉，渦旋振搖 30 s，

靜置 10 min。吸取包含 FAME 的正己烷相到進樣瓶中稀釋后，使用 GC-MS 進行

分析。

1.2 GC-MS 測定

采用 Agilent 7890A氣相色譜和 5975C 質(zhì)譜(Agilent Technologies, Santa Clara,

California, USA))結(jié)合使用 CP-Sil 88 毛細管柱(100 m×0.25 mm×0.20 μm)分析 C18

FAME。

色譜條件如下：進樣量為 1 μL，分流比為 10:1；載氣為氦氣，壓力恒定 38

psi；進樣口溫度 250℃；色譜柱溫度程序如下:初始溫度 120℃保持 10min，以 3℃

二、研究成果

117

/min 升至 180℃，再以 1.5℃/min 升至 200℃保持 3min，再以 2℃/min 至 220℃保

持 24min，總運行時間 80.33 min；質(zhì)譜檢測器傳輸線溫度為 250℃。

質(zhì)譜條件如下：自動調(diào)諧；溶劑延遲時間為 10 min；質(zhì)譜離子源溫度為 230℃，

四極桿溫度為 150℃，電子能量為 70 eV。采用 SIM 模式對 C18 FAME 進行定性

和定量分析，24 種 C18 FAME 的保留時間及質(zhì)譜參數(shù)見表 1。FAMs 的定性基于

與 FAMEs 標準品的保留時間和特征離子(1 個定量離子和 3 個定性離子)的比較，

以及在全掃描模式下進行結(jié)構(gòu)驗證，與 NIST 數(shù)據(jù)庫中的譜圖進行比較。FAMEs

的定量基于定量離子的峰面積，并通過各 FAME 外標的標準曲線計算。在 GCMS SIM法中，針對各 FAME建立了相應的標準曲線和線性范圍，以避免各 FAME

響應因素的差異造成的定量不準確的問題。為了提高靈敏度，以最佳信噪比（S/N）

選擇各 FAMEs 的定量離子，將運行時間分為 5 個時間窗口，在每個時間窗口中

僅選擇有限的特征離子進行掃描，其中每個離子的駐留時間為 20 ms，掃描頻率

超過 12 cycle/s。脂肪酸含量結(jié)果以絕對濃度（mg/L）表示。

1.3 方法驗證

依據(jù)方法驗證指南（ICH, 2005）和《合格評定 化學分析方法確認和驗證指

南 GB/T 27417-2017》對方法的線性、靈敏度、精密度和準確度進行驗證。通過

在 0.15~400 μg/mL 范圍內(nèi)測定 6 個不同濃度的 C18 FAMEs 標準溶液，得到了線

性回歸。以 S/N 為 3 和 10 計算檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。一天的三個

時間點檢測同一份樣品所得的相對標準偏差反映日內(nèi)差異，通過連續(xù)三天每天對

同一份樣品檢測一次所得的相對標準偏差反映日間差異。在空白樣品即乳清溶液

中添加濃度分別為 20、100 和 400 μg/mL 的 3 水平的 C18:1 c9, C18:2 c9,c12, C18:3

c9,c12,c15, 和 C18:3 c6,c9,c12 甘油三酯標準溶液，進行添加回收試驗，重復 4 次，

計算平均回收率和相對標準偏差。應用該方法測定了 50份牛奶樣品中的 C18 FA，

其中包含 20 份生乳樣品、15 份巴氏殺菌乳和 15 份超高溫滅菌乳。

2 結(jié)果與討論

二、研究成果

118

圖 1 24 種十八碳脂肪酸甲酯選擇離子流圖（a）標準品（b）生乳樣品

如圖 1 所示，該方法同時檢測了 24 個 C18 FAME，包括 1 個 C18:0、8 個

C18:1、6 個 C18:2 和 9 個 C18:3 FAME。色譜上有 3 組共洗脫峰，分別為 C18:1

c6/c8、C18:3 t9,t12,c15/t9,c12,t15 和 C18:3 c9,t12,t15/c9,c12,t15。此外，本研究嘗

試了不同的色譜柱溫度和壓力來分離牛奶樣品中的 C18 FAME，發(fā)現(xiàn)共洗脫峰的

峰形隨分離度變化不大，表明共洗脫峰所對應的 FA 或其他 C18 FA 異構(gòu)體，其

含量在牛奶中處于極低水平。因此，本試驗所提出的方法能滿足對牛奶中 C18

FAs 檢測需求，實現(xiàn)高通量分析。

二、研究成果

119

圖 2 不同甲酯化條件下的共軛亞油酸甲酯產(chǎn)率（a）C18:2 c9,t11（b）C18:2

t10,c12

如圖 2 所示，在堿催化甲酯化之后進行的酸催化甲酯化對共軛亞油酸甲酯的

產(chǎn)率影響不大，如 C18:2 c9,t11 和 C18:2 t10,c12，因此，省略酸催化步驟以提高

前處理效率。

通過方法學驗證，該方法具有良好的線性、靈敏度、準確度和精密度。C18:0、

C18:1、C18:2 和 C18:3 FAME 的 LOQs 分別為 30.1、498.0~562.7、283.0~343.4

和 101.2~148.9 μg/L，分別能對牛奶中低至 0.6、9.5~10.7、5.4~6.5 和 1.9~2.8 mg/L

的脂肪酸進行定量。假設乳脂總含量約為 4%，C18:0、C18:1、C18:2、C18:3 FA

的相對含量分別為 0.001、0.024~0.027、0.013~0.016、0.005~0.007 g/100g FA。C18

FAME 標準曲線的回歸方程在 0.15 ~ 400 μg/mL 的線性范圍內(nèi)，決定系數(shù)均在

0.998 以上，單個 C18 FAME 的線性范圍符合牛奶中 C18 FA 的實際含量要求。

二、研究成果

120

對于各 C18:1、C18:2 和 C18:3 FAME 的同分異構(gòu)體，當使用相同的定量離子時，

其標準曲線非常相似，因此可以使用相同的標準曲線用于共洗脫脂肪酸的定量。

根據(jù)牛奶中檢測到的 C18 FA，日間差異為 2.1% ~ 4.6%，日內(nèi)差異為 1.8% ~ 4.9%。

根據(jù)回收率試驗，平均回收率為 95.5% ~ 105.8%，變異系數(shù)為 1.8%~5.1%。

圖 3 生乳（n=20）、巴氏殺菌乳（n=15）和超高溫滅菌乳（n=15）的十八

碳脂肪酸含量的主成分分析圖

應用上述建立的檢測方法，測定 20 份生乳、15 份巴氏殺菌乳和 15 份超高

溫滅菌乳樣品中的十八碳脂肪酸。如圖 3 所示，本研究基于每份樣品的 C18 FA

組成，使用主成分分析來闡述觀測值與變量之間的關系。前三個主成分（PCs）

的累積貢獻率為 69.0% （PC1(34.4%)、PC2(23.4%)、PC3(11.2%)）。生乳和巴

氏殺菌乳之間存在一些重疊，而超高溫滅菌乳與其他牛奶樣品有區(qū)別。結(jié)果表

明，超高溫處理顯著影響了 C18 FA 的組成，即過度加熱會改變牛奶中 C18 FA

的組成。

3 結(jié)論

本研究建立了同時測定牛奶中 C18 FA 的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法。結(jié)果表

明，50℃、20 min 的堿性條件是牛奶 C18 FA 的甲酯化處理的適宜條件，而無

需額外的酸性甲酯化。C18 FAME 在 0.60~400 μg/mL 濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線

性關系。此外，該方法具有較好的靈敏度、準確度和精密度。通過分析生乳、

二、研究成果

121

巴氏殺菌乳和超高溫滅菌乳樣品的 C18 FA，發(fā)現(xiàn)超高溫滅菌乳與生乳和巴氏殺

菌乳的 C18 FA 組成有差異，表明過度加熱會改變牛奶中 C18 FA 的組成。綜上

所述，該方法是一種高通量測定牛奶中 C18 FA 的替代方法，提高了色譜的分

辨率和靈敏度，并簡化了甲酯化過程。

研究成果已在國際學術(shù)期刊《separations》上發(fā)表。該研究得到中國農(nóng)業(yè)科

學院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程重大產(chǎn)出科研選題（CAAS-ZDXT2019004）、中國農(nóng)業(yè)

科學院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-IAS12）、財政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)

產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-36）等項目支持，碩士研究生陳美慶和張養(yǎng)東副研究員

為共同第一作者，王加啟研究員為通訊作者。

——Chen, M., Y. Zhang, F. Wang, N. Zheng, and J. Wang. 2021. Simultaneous

Determination of C18 Fatty Acids in Milk by GC-MS. Separations 8(8).

二、研究成果

122

乳鐵蛋白和亞麻酸通過凋亡通路抑制結(jié)直腸癌生長機制

結(jié)直腸癌（CRC）是全球最常見的癌癥之一，死亡率較高。2015 年，中國約

39 萬人患有結(jié)直腸癌，男性 22.5 萬例，女性 16.26 萬例，亟待研發(fā)相關有效的預

防藥物或膳食產(chǎn)品。天然食品成分結(jié)合輔助治療，可能在預防和抑制結(jié)直腸癌中

發(fā)揮重要作用。近年來研究表明，乳制品消費量的增加與結(jié)直腸癌的降低顯著相

關，這可能是由于乳制品中含有的多種活性脂肪酸和活性蛋白。乳鐵蛋白

(Lactoferrin, LF)是牛奶中的主要活性生物因子之一，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、

抗腫瘤的作用。而活性脂肪酸，其中主要為油酸、亞麻酸和二十二碳六烯酸

（DHA），也被證實具有抗腫瘤作用。為研究乳鐵蛋白和活性脂肪酸聯(lián)合抗腫瘤

的效果，本研究通過體內(nèi)與體外方法探究了乳鐵蛋白與油酸/DHA/亞麻酸組合對

食道癌的抑制作用，并初步探究其機制。

試驗采用結(jié)腸癌細胞（HT29 細胞），分為對照組、乳鐵蛋白組、油酸組、

亞麻酸組、DHA 組、乳鐵蛋白+油酸組、乳鐵蛋白+亞麻酸組、乳鐵蛋白+DHA

組。首先利用 CCK-8 檢測細胞活力，以選擇 LF 和 3 種不飽和脂肪酸的最佳處理

濃度；而后在最佳劑量濃度下，分別進行細胞劃線實驗、transwell 實驗以確定 LF

和不飽和脂肪酸的最佳組合。對以上不同組別的 HT29 細胞同時裂解并提取總蛋

白，并采用 western blot 方法檢測細胞裂解液中 β-actin、AMPK/(p)-AMPK、

JNK/(p)-JNK、Caspase-3/Cleaved Caspase-3、Bcl-2 和 Bax 的蛋白表達量。

試驗采用 BALB/c 裸鼠（18-22 g 左右），皮下注射 HT29 細胞構(gòu)建食管癌小

鼠模型。該試驗的空白對照組為正常飼養(yǎng)的小鼠；乳鐵蛋白處理組灌胃 50 mg/kg

體重的乳鐵蛋白；亞麻酸組處理組灌胃 5 mg/kg 體重的亞麻酸；乳鐵蛋白+亞麻

酸處理組灌胃 50 mg/kg 體重的乳鐵蛋白+5 mg/kg 體重的亞麻酸。試驗結(jié)束后，

斷頸處死小鼠，解剖取腫瘤組織稱重，并計算腫瘤體積及相對腫瘤體積（RTV）。

二、研究成果

123

試驗結(jié)果：

圖 1 顯示，與對照組相比，6.25 mM 乳鐵蛋白可顯著抑制 HT29 細胞活力，

而油酸、DHA 和亞麻酸分別在 0.18 mM、0.18 mM 和 0.15 mM 時可顯著抑制

HT29 細胞活力(p<0.05)?；趧┝窟x擇的兩個原則，即細胞活力>80%和顯著差

異(與對照組相比，p<0.05)，選擇 6.25 mM 為 LF 的適宜劑量，同時 0.18 mM 為

油酸、DHA 的適宜劑量，0.15 mM 為亞麻酸的適宜劑量。

如圖 1B 所示，在選定的濃度下，4 種化學物質(zhì)對 HT29 細胞生長的抑制作用

均高于其他 4 種細胞系，說明 HT29 細胞對 LF 和 3 種多不飽和脂肪酸的敏感性

高于其他細胞系。此外，在 IC50 濃度條件下，乳鐵蛋白和 3 種不飽和脂肪酸對

HT29 細胞生長的抑制作用約為 50%，而對其他癌細胞生長的抑制作用僅為 30%-

40%(圖 1C)。

圖 1 乳鐵蛋白、油酸（OA）、亞麻酸（LA）和 DHA 處理 HT29 細胞后 CCK8 試劑盒檢測細胞活力。 (A)以 5-Fu 為陽性對照，乳鐵蛋白和 3 種不飽和脂肪酸

處理 48 h 后對 HT29 細胞存活率有不同程度的抑制作用。(B)比較(A)中所選濃度

二、研究成果

124

下乳鐵蛋白(6.25 mM)、OA (0.18 mM)、DHA (0.18 mM)和 LA (0.15 mM)對其他 4

種不同癌細胞的抑制作用。(C) 比較乳鐵蛋白(39.14 mM)、OA (87.43 mM)、

DHA(116.30 mM)和 LA (36.61 mM)在 IC50 濃度(對 HT29 細胞)下對其他 4 種不

同癌細胞株的抑制作用。

我們通過 Annexin V-FITC/PI 染色進一步探討了 LF 和 3 種不飽和脂肪酸對

HT29 細胞凋亡的影響。發(fā)現(xiàn) LF 和 3 種不飽和脂肪酸均可誘導 HT29 細胞產(chǎn)生

不同程度的凋亡，其中 LF + LA 組凋亡率最高(17.40%±2.31%)。

圖 2 乳鐵蛋白、油酸（OA）、亞麻酸（LA）和 DHA 處理對 HT29 細胞凋

亡的影響

二、研究成果

125

為了研究 LF 和三種不飽和脂肪酸對 HT29 細胞侵襲、遷移能力的影響，我

們進行了 transwell 和劃線實驗。結(jié)果表明 LF、不飽和脂肪酸、乳鐵蛋白和其組

合可不同程度抑制 HT29 細胞侵襲和遷移能力。其中，與其他組相比，乳鐵蛋

白+亞麻酸組對細胞侵襲和遷移能力的抑制作用最強(p<0.05)。因此，選擇乳鐵

蛋白+亞麻酸組進行后續(xù)試驗。

圖 3 乳鐵蛋白、油酸（OA）、亞麻酸（LA）和 DHA 處理對 HT29 細胞侵

襲（左）和遷移能力（右）的影響

根據(jù)體外實驗結(jié)果，選擇乳鐵蛋白和亞麻酸的組合進行體內(nèi)實驗。如圖所

示，與對照組相比，治療組相對腫瘤體積(RTV)和腫瘤相對增殖率均降低

(p<0.05)。25 天時，與其他組相比，HT29 腫瘤重量在乳鐵蛋白+亞麻酸組顯著

降低（p<0.05）。

二、研究成果

126

圖 4 乳鐵蛋白及亞麻酸乳鐵蛋白和亞麻酸對 HT29 荷瘤裸鼠的影響。

為探討 LF 和 LA 在 HT29 腫瘤模型中的抗腫瘤作用，采用 western blotting

檢測 AMPK/JNK 相關因子的蛋白水平。如圖所示，與對照組相比，LF、LA 或

LF + LA 組合顯著上調(diào) p-AMPK、p-JNK、Bax 和 cleaved Caspase-3 (p<0.05)，顯

著下調(diào) Bcl-2 (p<0.05)。LF+LA 聯(lián)合組的 p-AMPK、p-JNK、cleaved Caspase-3

和 Bax 水平高于 LF 組和 LA 組。與對照組相比，JNK、AMPK 和 Caspase-3 水

平無明顯變化(p>0.05)。為了驗證 AMPK 在調(diào)節(jié)凋亡因子中的作用，我們用

AMPK 抑制劑(dorsomorphin)處理 HT29 細胞，并檢測其下游蛋白。結(jié)果顯示，

與對照組相比，這些蛋白(p-AMPK、AMPK、JNK、p-JNK 和 cleaved Caspase3)水平顯著下調(diào)，Bcl-2 水平顯著上調(diào)(p<0.05)。此外，LF+LA+AMPK 抑制劑組

的這些因子與 AMPK 抑制劑組表現(xiàn)出相似的趨勢，提示 LF+LA 激活了

AMPK/JNK 相關通路和隨后的凋亡因子。

二、研究成果

127

圖 5 乳鐵蛋白和亞麻酸處理后 HT29 細胞中 p-AMPK/AMPK、JNK/p-JNK,

Bcl-2, Bax, Caspase-3/cleaved Caspase-3 蛋白的表達

結(jié)論：乳鐵蛋白+亞麻酸組合通過上調(diào) AMPK/JNK 磷酸化水平，下調(diào)凋亡

相關因子 Bcl-2/Bax 比例，從而抑制 HT29 細胞和結(jié)腸癌荷瘤裸鼠腫瘤生長。要

證明乳鐵蛋白和亞麻酸之間的添加效應，還需要進一步的藥物實驗證實。

二、研究成果

128

研究成果已被《peerJ》雜志接收，該成果由中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新

工程重大產(chǎn)出科研選題(CAAS-ZDXT2019004)、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項資

金（CARS-36）、中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-IAS12）資助。姚倩

倩和李慧穎為第一作者，鄭楠和王加啟為通訊作者。

—— Yao Q, Li H, Fan L, Huang S, Wang J, Zheng N. 2021. The combination of

lactoferrin and linolenic acid inhibits colorectal tumor growth through activating

AMPK/JNK-related apoptosis pathway. PeerJ, e11072.

二、研究成果

129

乳鐵蛋白通過調(diào)節(jié)壞死因子途徑減輕糠氨酸引起的肝

損傷

美拉德反應在食品的熱加工過程中很常見，尤其是乳制品加工和烘焙過程。

不同的美拉德反應產(chǎn)物(MRPs)在美拉德反應的早期、中期和晚期產(chǎn)生，包括 N(ε)-

2-呋喃甲酰甲基-烯丙基辛(furosine)、N(6)-(1-羧乙基)-l-賴氨酸(CEL)、果聚糖(FL)、

鏈酰賴氨酸、N(ε)-羧甲基-l-賴氨酸(CML)、戊聚糖、吡喃糖和 5-羥甲基糠醛(5-

HMF)。MRPs 不僅會影響熱加工食品的感官屬性，改變其外觀、風味、香氣和質(zhì)

地，還會損害其營養(yǎng)價值。此外，越來越多的證據(jù)表明，服用 MRPs 可能導致多

種疾病，如白內(nèi)障、糖尿病、退行性疾病、動脈粥樣硬化、慢性腎衰竭等。在本

文中，我們構(gòu)建了 HL-7702 細胞(正常肝細胞系)模型和 ICR 小鼠模型，研究了糠

氨酸、吡喃糖和 5-HMF 對體外細胞活力以及體內(nèi)肝功能和肝臟病理狀態(tài)的毒性

作用。此外，還評估了乳鐵蛋白（LF）在減輕肝損傷以及調(diào)節(jié)壞死因子途徑方面

的作用。

在本研究中，我們檢測了包括奶粉、烘焙面包、咖啡和蜂蜜在內(nèi)的幾種食品

中糠氨酸、吡喃糖和 5-HMF 的含量，以驗證這三種物質(zhì)在常見食品中的含量。

此后，我們構(gòu)建了 HL-7702 細胞(正常肝細胞系)模型和 ICR 小鼠模型，并研究了

糠氨酸、吡喃糖和 5-HMF 對體外細胞活力以及小鼠肝功能的毒性作用，探討具

有呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物對肝組織的毒性機制，并通過蛋白質(zhì)印跡法驗證其相關蛋

白 RIPK-1、RIPK-3 的表達，以及乳鐵蛋白在含呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物所致肝損傷

方面的保護作用。

首先，用 UHPLC 法檢測了面包、奶粉、咖啡和蜂蜜中 MPRS 的含量，同時

將 HL-7702 細胞在 RPMI 1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將細胞接種至 96 孔板(104個細胞

/孔)，培養(yǎng) 24 h，將細胞分別暴露于糠氨酸、FL、CEL、CML、pyrraline、HMF

(0-1000 mg/L)和乳鐵蛋白，共培養(yǎng) 48 h；然后用 CCK-8 試劑盒檢測細胞活力。

考慮到安全性(存活率>80%)和效果(與對照組相比，P＜0.05)的原則，確定乳鐵蛋

二、研究成果

130

白和 MRPs 的合適劑量。然后，測定乳鐵蛋白(經(jīng) 2 h 預處理)和敏感 MRP 組合的

細胞活力，以進一步觀察乳鐵蛋白的保護作用。

在急性毒性模型中，將 60 只 ICR 小鼠(20±2 g，雌性)隨機分為 12 組(每組 5

只):對照組(未經(jīng)任何處理)、ddH2O 處理組(0.20 mL/只，每天 1 次)、0.10 g/kg 糠

氨酸組、0.25 g/kg 糠氨酸組、0.50 g/kg 糠氨酸組；0.10 g/kg b.w.吡喃糖組、0.25

g/kg b.w.吡喃糖組、0.50 g/kg b.w.吡喃糖組；0.10 g/kg b.w.5-HMF 組、0.25 g/kg

b.w.5-HMF 組、0.50 g/kg b.w. 5-HMF 組和 0.25 g/kg b.w.乳鐵蛋白組。給藥前 1 h

禁食小鼠，試驗期共 14 天，觀察是否有任何毒性或死亡的臨床癥狀。第 14 天結(jié)

束時，處死急性毒性模型中的活動物，選擇 3 種化學物質(zhì)的適當劑量(無明顯癥

狀)用于進一步實驗。

在慢性毒性模型中，將 45 只 ICR 小鼠(20±2g，雌性)隨機分為 9 組(每組 5

只):對照組(未經(jīng)任何處理)、ddH2O 處理組(0.20 mL/只，每天 1 次)、0.25 g/kg

b.w.乳鐵蛋白組、0.10 g/kg b.w.糠氨酸組、0.10 g/kg b.w.吡喃糖組、0.10 g/kg

b.w.吡喃糖 5-HMF 組、乳鐵蛋白+糠氨酸組、乳鐵蛋白+吡喃糖組治療組小鼠連

續(xù) 21 天每天灌胃給藥 1 次(0.20 mL/只)。第 22 天處死小鼠，眼眶取血并采集肝

組織。

用 UHPLC 法檢測面包、奶粉、咖啡和蜂蜜中 MPRS 的含量，發(fā)現(xiàn)糠氨

酸、5-HMF 和吡喃糖的含量在這幾種物質(zhì)中都有存在（圖 1）。

二、研究成果

131

圖 1 奶粉、烘焙面包、咖啡、蜂蜜中糠氨酸、吡喃糖和 5-HMF 的檢測。

將 3 種 MRPS 以及 LF 分別作用于 HL-7702 細胞，通過 CCK-8 檢測細胞活

力，進一步證明 3 種 MRPS 對 HL-7702 細胞的體外存活有明顯的抑制作用（圖

2A），并且 LF 能有效能減輕細胞的損傷，篩選出 100mg/L 的 LF 作為合適的

劑量（圖 2B、2C）。

二、研究成果

132

圖 2 CCK-8 試劑盒檢測 MRP、乳鐵蛋白和聯(lián)合作用對 HL-7702 細胞活力的

影響

ICR 小鼠的肝組織的 HE 染色結(jié)果顯示，3 種 MRP(0.10 g/kg b.w.)可引起肝

組織細胞形態(tài)改變和輕微的水腫（圖 3）。

二、研究成果

133

圖 3 小鼠肝組織的 HE 染色病理檢測

用 Elisa 試劑盒測定乳鐵蛋白、3 種 MRP 及其組合對小鼠血清和肝組織生

化指標(ALT、AST、ALP、γ-GT、TNFα 和 IL1β)的影響，發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白(0.25

g/kg b.w.)具有保護肝損傷的作用（圖 4）。

二、研究成果

134

圖 4 乳鐵蛋白、MRP 以及二者聯(lián)合對 ICR 小鼠血清及肝臟組織生化指標

的影響

在免疫印跡法中，蛋白質(zhì)印跡法研究乳鐵蛋白、3 種 MRP 及其組合對

RIPK1、RIPK3、MLKL、p-MLKL、腫瘤壞死因子-α 和白細胞介素-1β 的調(diào)

控。與對照組相比，MRPs 顯著上調(diào) RIPK1、RIPK3、p-MLKL、腫瘤壞死因子α 和白細胞介素-1β，而 LF 能顯著下調(diào)這些蛋白的表達（圖 5）。

二、研究成果

135

圖 5 HL-7702 細胞和小鼠肝臟組織中 RIPK1/RIPK3 相關通路蛋白表達水

平。A. HL-7702 細胞中的蛋白質(zhì)條帶。B. 小鼠肝組織中的蛋白質(zhì)帶。C. HL7702 細胞中蛋白質(zhì)的定量。D. 小鼠肝組織中蛋白質(zhì)的定量。

結(jié)論：乳鐵蛋白對呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)的 MRPs 所致的肝損傷具有保護作用，主要

通過激活 RIPK1/RIPK3/p-MLKL 壞死因子途徑，進而調(diào)控下游炎癥反應實現(xiàn)。

該部分研究成果已被《Food science and nutrition》雜志接收，由現(xiàn)代農(nóng)業(yè)

產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資金（CARS-36）和中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程（ASTIPIAS12）資助。范琳琳和王峰恩為第一作者，李慧穎和鄭楠為通訊作者。

——Linlin Fan, Fengen Wang, Qianqian Yao, Haoming Wu, Fang Wen, Jiaqi

Wang, Huiying Li, Nan Zheng. Lactoferrin could alleviate liver injury caused by

Maillard reaction products with furan ring through regulating necroptosis pathway.

Food science and nutrition. Accepted.

二、研究成果

136

乳鐵蛋白通過調(diào)控 TLR4 相關通路抑制脂多糖誘導的肺部炎癥

急性肺炎(ALI)具有較高的發(fā)病率和死亡率，其主要病理生理表現(xiàn)是炎癥、

氧化應激和肺泡屏障功能障礙。革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的脂多糖（LPS）是引起 ALI

的常見原因。肺細胞識別 LPS 后，引起機體保護性免疫反應，包括上皮細胞釋放

炎癥介質(zhì)、中性粒細胞募集到感染部位、自然殺傷細胞數(shù)量的增加和吞噬作用的

增強等。牛奶作為主要的膳食食物之一，不僅提供必要的能量和營養(yǎng)物質(zhì)，而且

在免疫功能、腸道微生態(tài)和營養(yǎng)平衡方面發(fā)揮著重要作用。乳鐵蛋白是奶中的一

種重要活性蛋白。我們前期研究表明，乳鐵蛋白可調(diào)節(jié)缺血/再灌注處理下 PC-12

細胞中 TLR4 炎癥通路。因此，我們進一步探究乳鐵蛋白是否也對肺細胞內(nèi) LPS

激活的 TLR4 相關信號通路有顯著影響，并可能控制炎癥細胞因子的產(chǎn)生。此外，

乳鐵蛋白是一種熱敏性蛋白，在熱處理條件下很容易變性。因此，研究熱處理對

乳鐵蛋白抗炎生物活性的影響具有重要意義，可指導乳鐵蛋白在實際生產(chǎn)中加工

工藝。

試驗采用人肺癌細胞（A549）。使用 RPMI-1640 培養(yǎng)基、且在 95% N2-5%

CO2條件下培養(yǎng)細胞，待細胞長到 90%匯合度時接種到 6 孔板中，用不同濃度乳

鐵蛋白處理組（0、0.1、1.0、10、20 和 30 mg/mL）處理 48 h，CCK-8 法檢測細

胞活力，選擇乳鐵蛋白最佳作用濃度。

將 A549 細胞接種到 6 孔板中，采用 1 μg/mL LPS 處理細胞構(gòu)建炎癥模型，

采用 ELISA 法測定 TNF-α 和 IL-1β 炎癥因子水平；在乳鐵蛋白處理組中，首先

將 A549 細胞接種到 6 孔板中，采用 10 mg/mL 乳鐵蛋白處理 4 h 后，用 1 μg/mL

LPS 處理構(gòu)建細胞炎癥模型。

為探究熱處理對乳鐵蛋白活性的影響，將乳鐵蛋白溶液分別在 50 ℃或 100 ℃

加熱 3 min 后加入細胞培養(yǎng)基中，培養(yǎng)結(jié)束后收取細胞樣品。

對以上不同組別的 A549 細胞，裂解并提取總蛋白，并采用 western blot 方法

檢測細胞裂解液中 TLR-4、MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-1β 的蛋白表達量。

二、研究成果

137

試驗采用 40 只 CD-1 雌鼠，分為 4 組：對照組、LPS 組、乳鐵蛋白組、LPS+

乳鐵蛋白組。該試驗的空白對照組為正常飼養(yǎng)的小鼠；小鼠氣管腔注射 50 μL LPS

溶液(終濃度為 10 mg/kg BW)，乳鐵蛋白組將乳鐵蛋白粉溶于 PBS 中，濃度為 10

mg/mL，LPS 處理前 6 h，每只小鼠腹腔注射乳鐵蛋白溶液 0.2 mL。LPS 處理 48

h 后，斷頸處死小鼠，取左肺葉進行進一步的組織病理學檢查，并對肺部組織 TNFα、IL-1β 因子基因和蛋白表達進行定量分析。

試驗結(jié)果：

結(jié)果表明，與對照組相比，乳鐵蛋白濃度為 10 mg/mL 時，開始對 A549 細

胞的活力有顯著的抑制作用(94.1%±1.2% vs 99.5%±0.3%，P<0.05，圖 1)。乳鐵蛋

白濃度提高時會進一步降低 A549 細胞的活力。因此在本研究中，選擇 10 mg /mL

乳鐵蛋白進行后續(xù)實驗。

圖 1 CCK8 法檢測不同濃度乳鐵蛋白對 A549 細胞活力的影響

與對照組相比，乳鐵蛋白處理組 TLR4、Myd88、IRAK1、TRAF6、NF-κB、

TNF-α 和 IL-1β 的表達在 mRNA 和蛋白水平上均無明顯變化，而 LPS 處理組均

顯著上調(diào)（P<0.05）。LPS+LF 聯(lián)合組 TLR4 相關通路較 LPS 單獨組明顯受到抑

制（P<0.05）。LPS 刺激后 A549 細胞培養(yǎng)液中 TNF-α 和 IL-1β 的濃度顯著升高，

而乳鐵蛋白預處理降低了這兩種細胞因子的釋放(P<0.05)。與對照組相比，LPS

組 miR-146a 的基因表沒有明顯改變，但乳鐵蛋白組 miR-146a 表達顯著升高，二

者聯(lián)合作用組 miR-146a 表達雖然降低但仍顯著低于對照組(P<0.05)。

二、研究成果

138

圖 2 A549 細胞中 TLR4 相關通路因子基因和蛋白表達。A，Western blot 檢

測各因子蛋白表達量；B，Western blot 結(jié)果定量分析；C，ELISA 試劑盒檢測細

胞培養(yǎng)基中促炎因子(TNF-α 和 IL-1β)的濃度；D，實時熒光定量 PCR 檢測 A549

細胞中 miR-146a、TLR4、Myd88、IRAK1、TRAF6、NF-κB、TNFA、IL-1β 的基

因表達。

二、研究成果

139

結(jié)果表明，與對照組相比，LPS 組小鼠肺組織中 TLR4、Myd88、IRAK1、

TRAF6、NFKB、TNF-α、IL-1β mRNA 和蛋白水平均上調(diào)(P<0.05)，乳鐵蛋白可

不同程度地抑制這些因子的上調(diào)(P<0.05)。LPS 刺激后支氣管肺泡灌洗液中 TNFα 和 IL-1β 的濃度顯著升高，而乳鐵蛋白預處理降低了這兩種細胞因子的釋放

(P<0.05)。同時，LPS 組小鼠肺組織中 miR-146a 基因表達量顯著下調(diào)，乳鐵蛋白

組其含量顯著高于對照組(P<0.05)。此外，與單純 LPS 組相比，LPS+LF 組 miR146a 基因表達量相對升高(P<0.05)。

采用蘇木精和伊紅染色觀察肺組織病理情況，結(jié)果顯示，對照組肺泡邊界清

晰薄，肺組織結(jié)構(gòu)整體規(guī)則；而 LPS 組肺泡間隔明顯增厚，大量彌漫性炎癥細胞

浸潤間質(zhì)。但與 LPS 組相比，LPS+LF 組的肺部炎癥強度似乎有所減輕，浸潤細

胞較少，出血程度較輕，說明乳鐵蛋白在一定程度上減輕了 LPS 引起的肺組織

炎癥損傷。

雖然天然乳鐵蛋白有助于緩解 LPS 處理后 A549 細胞中促炎細胞因子表達

量升高，但尚不清楚實際生產(chǎn)中的熱加工是否對這種生物活性有影響。與未加熱

的乳鐵蛋白相比，50 ℃加熱 3 min 乳鐵蛋白活性無顯著變化；而 100℃加熱 3

min，乳鐵蛋白的抑制活性幾乎消失，TNF-α 和 IL-1β 的含量在 100 ℃ LF+LPS

組和 LPS 組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。同時乳鐵蛋白在 100℃下凝成白色的絮

狀物，并且 SDS-PAGE 結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析表明，在天然乳鐵蛋白上方

出現(xiàn)的較大的“新”條帶實際上是蛋白質(zhì)聚合物的一種形式。

二、研究成果

140

圖 3 TLR4 相關通路因子在小鼠肺組織中的基因和蛋白表達。A，Western blot

檢測各因子蛋白表達量；B，Western blot 結(jié)果定量分析；C，ELISA 試劑盒檢測

細胞培養(yǎng)基中促炎因子(TNF-α 和 IL-1β)的濃度；D，實時熒光定量 PCR 檢測小

鼠肺組織中 miR-146a、TLR4、MYD88、IRAK1、TRAF6、NF-κB、TNFA、IL1β 的基因表達。

二、研究成果

141

圖 4 (A)蘇木精和伊紅染色的小鼠肺組織病理切片。(B)病理組織評分

圖 5 （A）LPS 處理后的 A549 細胞進行代謝組學分析和特殊代謝物驗證；

（B）加熱后乳鐵蛋白樣品的 SDS-PAGE

結(jié)論：乳鐵蛋白能夠顯著抑制由 LPS 誘導的細胞及肺組織炎癥因子表達上

調(diào)。但是加熱處理會一定程度減弱這種抑制活性。由于食品，如嬰配粉、液態(tài)奶

等在加工過程中會受到一定的熱負荷，因此需要控制熱加工溫度或?qū)θ殍F蛋白進

行理化保護，使其活性能夠保留。

二、研究成果

142

研究成果已被《Journal of Dairy Science》雜志接收，該成果由中國農(nóng)業(yè)科學

院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程重大產(chǎn)出科研選題(CAAS-ZDXT2019004)、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技

術(shù)體系專項資金（CARS-36）、中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-IAS12）

資助。李慧穎為第一作者，王加啟和鄭楠為通訊作者。

——H. Y. Li, H. G. Yang, H. M. Wu, Q. Q. Yao, Z. Y. Zhang, Q. S. Meng, L. L.

Fan, J. Q. Wang* and N Zheng*. 2021. Inhibitory effects of lactoferrin on pulmonary

inflammatory processes induced by lipopolysaccharide through modulating the TLR4-

related pathway. Journal of Dairy Science.

二、研究成果

143

乙酸、丙酸和丁酸對離體培養(yǎng)的胎鼠空腸和未成熟小腸細

胞的抗炎作用

壞死性小腸結(jié)腸炎（NEC）是一種常見于早產(chǎn)兒的腸道疾病。由于 NEC 的

發(fā)病機制復雜，目前尚無治療 NEC 的有效方法。因此，盡早采取有效的干預措

施是降低 NEC 發(fā)病率的關鍵。短鏈脂肪酸（SCFAs）是腸桿菌發(fā)酵的主要終產(chǎn)

物，其中乙酸、丙酸和丁酸的含量高達 95%。SCFAs 已被證明可以促進腸道完整

性，調(diào)節(jié)代謝紊亂，并調(diào)節(jié)免疫反應。在目前的研究中，SCFAs 對腸道炎癥的保

護作用研究主要集中在成熟的小鼠結(jié)腸或人類結(jié)腸細胞系。然而，很少有研究關

注它們在未成熟小腸中的作用。為了驗證 SCFAs 對未成熟小腸炎癥是否具有保

護作用及相關機制，該研究通過 IL-1β 誘導的 ICR 胎鼠空腸離體培養(yǎng)物炎癥模型

評估乙酸、丙酸和丁酸的抗炎作用，并通過轉(zhuǎn)錄組學探索潛在的抗炎調(diào)節(jié)通路，

然后用人類胎兒小腸上皮 FHs 74 Int 細胞進行體外驗證。

試驗首先進行了離體試驗。將懷孕的 ICR 小鼠在特定的無病原體環(huán)境中飼

養(yǎng)，并自由進食和飲水。在懷孕 18.5 天時處死，通過剖腹產(chǎn)取出胎鼠。然后解剖

胎鼠，取出胎鼠空腸，切割成 3 mm 片段并保存在 37?C 的器官培養(yǎng)基中。胎鼠

空腸培養(yǎng)物用或不用 20-40 mM 乙酸、丙酸或丁酸預處理 1h，然后與 IL-1β

（1ng/mL）共同培養(yǎng) 24h。將胎鼠空腸培養(yǎng)上清液通過 ELISA 法測定 CXCL2 濃

度，并提取胎鼠空腸 RNA 進行轉(zhuǎn)錄組學分析。離體試驗完成后，進行體外試驗。

將 FHs 74 Int 細胞用或不用乙酸、丙酸或丁酸（5-30mM）預處理 1h，然后與 IL1β（0.5ng/mL）共同孵育 24h。然后，通過 ELISA 和 qRT PCR 測定細胞中 IL-8

和 IL-6 的表達，并通過 Western Blot 測定炎癥相關信號通路表達。

為了建立胎鼠空腸炎癥模型，不同濃度的 IL-1β 用于處理胎鼠空腸培養(yǎng)物。

如圖 1A 所示，經(jīng) 1 ng/mL IL-1β 處理的胎鼠空腸培養(yǎng)物中 CXCL2 的產(chǎn)生顯著增

加，表明胎鼠空腸炎癥模型構(gòu)建成功。乙酸、丙酸和丁酸在所有試驗濃度（20-40

二、研究成果

144

mM）下處理均顯著降低 IL-1β 誘導的胎鼠空腸培養(yǎng)物中 CXCL2 的表達（圖 1B、

C 和 D）。

圖 1 IL-1β 和 SCFAs 對胎鼠空腸培養(yǎng)物中 CXCL2 表達水平的影響

基于基因表達量信息，對各個處理組組內(nèi)的 3 個生物學重復樣品開展主成分

分析（PCA，Principal Component Analysis），以了解重復樣本間的重復性與組間

樣本的差異性。從圖 2 可以看出各個處理組組內(nèi)樣品都有較好的重復性，對照組、

IL-1β 單獨處理組和 SCFAs 與 IL-1β 共同處理組樣品能夠很好的分離。

圖 2 各組樣品主成分分析（PCA）