第 11 期 王世堯等：基于表型的蝴蝶蘭花色數(shù)量分類 2229

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用 SQCX 軟件獲取分光測色儀測定的基于

CIE Lab 表色系統(tǒng)的明度值（L*

）、紅度值（a*

）、

黃度值（b*

）、彩度值（C）、色相角（h）和基于

孟塞爾顏色系統(tǒng)的色相值（Hue）、明度值（Value）

和彩度值（Chroma）；采用 Microsoft Excel 2007

軟件對統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行整理；利用 Origin 2023軟件，

使用最遠鄰近法（歐式距離）對 L*

值、a*

值和 b*

值進行系統(tǒng)聚類分析，分析其不同色系的差異并

作圖。

2 結果與分析

2.1 蝴蝶蘭花瓣、萼片和唇瓣的花色表型差異

分析

蝴蝶蘭花朵由 3 枚萼片、2 枚側花瓣和 1 枚

高度特化的腹部花瓣——唇瓣構成，具有較高的

觀賞價值。對供試的 146 份蝴蝶蘭種質(zhì)資源的側

花瓣、萼片和唇瓣的顏色進行測定（存在部分復

色材料，分別獲得 172 組側花瓣、萼片數(shù)據(jù)及 146

組唇瓣數(shù)據(jù)），取其均值分析整體花色表型差異。

如表 1 所示，側花瓣和萼片的顏色參數(shù)值均無顯

著差異，而唇瓣 L*

值顯著低于花瓣和萼片，其 a*

值和 C 值則顯著高于二者，表明唇瓣相對于花瓣

和萼片的顏色亮度較暗，但彩度較大，更偏向于

紅色。

2.2 基于聚類分析的蝴蝶蘭花色分類

因供試種質(zhì)資源的花瓣和萼片的顏色差異不

表 1 蝴蝶蘭花瓣、萼片與唇瓣的花色表型差異

Tab. 1 Flower colour difference of Phalaenopsis of petal,

sepal and labellum

器官 Organ L*

a*

b*

C h

花瓣 58.89 27.75 ?2.27 27.84 ?4.68

萼片 59.20 26.98 ?1.59 27.03 ?3.37

唇瓣 44.62** 35.23** ?2.50 35.32** ?4.06

注：**表示極顯著相關（P<0.01）。

Note: ** indicates extremely significant correlation (P<0.01).

大，本研究主要以側花瓣的色值作為分類依據(jù)。

供試蝴蝶蘭花色在 CIE Lab 表色系統(tǒng)各參數(shù)分布

廣泛（表 2），L*

值介于 20.20~93.00 之間；a*

值

和 b*

值分別分布在?13.76~74.10，?35.40~64.07 區(qū)

間內(nèi)。對其 L*

、a*

、b*

值進行系統(tǒng)聚類分析，當

歐式距離為 10 時，可將其分為 8 個類別（圖 3）；

參考 RHSCC 的命名規(guī)則進行命名，可分為 8 個

色系（表 2）：紫色系、暗紫色系、淺紫色系、

紫紅色系、白色系、黃綠色系、粉色系和灰橙色

系，其中紫紅色系和白色系占比較大，但通過分

析聚類樣本發(fā)現(xiàn)，部分淡黃綠色、淡粉色等彩度

偏低的品種被劃在白色系，表明僅通過聚類分析

不能對蝴蝶蘭花色有效區(qū)分。

2.3 基于 ISCC-NBS色名表示法的蝴蝶蘭花色

分類

2.3.1 蝴蝶蘭花色分類 基于聚類分析結果，采

用 ISCC-NBS 色名表示法對所測得的 172 個蝴蝶

蘭花色表型值重新進行命名及歸類，共獲得 44 個

顏色名稱（表 3）。通過簡化飽和度和明度描述，

表 2 蝴蝶蘭花色表型數(shù)量聚類分析結果

Tab. 2 Results of cluster analysis of flower colour phenotype in Phalaenopsis examples

供試樣本 Examples CIELab 表色系統(tǒng) CIELab coordinate

序號

Code

色系

Colour

group

顏色描述

Colour description 數(shù)量

Number

占比

Percentage/%

L*

a*

b*

C h

Ⅰ 紫色 紫偏灰、暗紅偏紫 24 13.95 20.20~44.02 29.75~56.50 ?14.89~8.28 29.86~58.43 ?16.66~15.55

Ⅱ 暗紫色 暗紫 3 1.74 22.90~28.71 8.86~22.81 ?0.83~1.84 9.05~22.83 ?2.08~11.73

Ⅲ 淺紫色 淺紫、淺紫偏紅、

淡紫

29 16.86 42.63~68.24 34.31~55.70 ?32.06~?17.04 40.76~64.11 ?34.99~?20.76

Ⅳ 紫紅色 紅偏紫、紫偏紅 30 17.44 26.54~46.16 53.44~74.10 ?35.40~?16.25 58.10~81.02 ?30.06~?14.42

Ⅴ 白色 白、白偏綠、白偏黃、

白偏粉

33 19.19 78.52~93.00 ?13.76~5.03 ?2.75~38.59 0.27~40.97 ?2.05~28.12

Ⅵ 黃綠色 淺黃綠、強綠偏黃、

強黃偏綠

15 8.72 59.66~84.89 ?13.47~7.69 40.94~64.07 40.99~64.45 80.11~103.86

Ⅶ 粉色 淺粉、淡粉 21 12.21 64.36~84.78 10.05~31.39 ?21.00~?4.47 12.25~37.71 ?38.57~?12.65

Ⅷ 灰橙色 淺黃、橙黃、淡黃、

橙偏棕

17 9.88 48.76~71.83 4.52~30.14 2.87~34.48 22.41~40.13 6.75~78.36

總計 172 20.20~93.00 ?13.76~74.10 ?35.40~64.07 0.27~81.02 ?38.57~103.86

2230 熱帶作物學報 第 44 卷

圖 3 基于 L*

、a*

、b*

值的 146 個蝴蝶蘭花瓣的花色表型聚類分析

Fig. 3 Cluster analysis results of 146 Phalaenopsis petal examples based on L*

, a*

, b* valus

可將供試蝴蝶蘭花色劃分為 7 大色系：黃色系、

棕色系、紅色系、紫羅蘭色系、粉色系、紫色系

和白色系。根據(jù)劃分色系的色相、明度和彩度的

參數(shù)范圍（表 4），可發(fā)現(xiàn)紫羅蘭色和紫色系的

明度和彩度相當，紅色系中存在品種的明度較低，

表現(xiàn)為暗紅色或暗紅偏灰，接近于黑色。

2.3.2 蝴蝶蘭花色表型分布特點 使用 CIE Lab

表色系統(tǒng)對基于 ISCC-NBS 體系分類下的蝴蝶蘭

7 個色系的 L*

、a*

、b*

參數(shù)進行分析，各色系的參

數(shù)值分布規(guī)律較為明顯（圖 4）。白色系和黃色系

的 L*

值較大且分布集中，紅色系的 L*

值最?。环?/p>

色系、紫色系和棕色系的 L*

值重疊，可通過 a*

值

和 b*

值進行有效區(qū)分；白色系和黃色系的 a*

值在

負值范圍內(nèi)有分布，其他色系的 a*

值均在正值范

圍；紫羅蘭色系和紫色系 b*

值集中分布在負值，

二者在 a*

、b*

值的分布相似，但前者 L*

值明顯低

于后者。

供試蝴蝶蘭花色在 a*

、b*

色相坐標上，主要

集中在第Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ象限，在呈現(xiàn)藍色的第Ⅲ象

限中無分布（圖 5A）。在第Ⅰ象限主要分布棕色、

粉色、紅色 3 個色系的品種；黃色系主要分布在

第Ⅱ象限；第Ⅳ象限主要分布紫色、紫羅蘭色 2

個色系，紅色系亦有分布；白色系集中分布在接

近原點的位置。在 L*

、a*

、b*

值的三維散點圖中

花色數(shù)據(jù)多集中在一條主線附近，呈帶狀分布（圖

5B）。

2.3.3 蝴蝶蘭 L*

值與 C 值相關性分析 彩度 C 值

的變化會對明度 L*

值產(chǎn)生影響，根據(jù)供試蝴蝶蘭

不同色系的 L*

值與 C 值二維坐標的分布，可將其

分為 2 個類群（圖 6）。第一類群的 L*

值隨 C 值的

增大而變小，包含白色、黃色、棕色、紫羅蘭色、

紫色和粉色等 6 個色系（圖 7A），對其 L*

值和 C

值進行線性擬合分析，繪制線性回歸圖，結果表明，

擬合線性方程為 y=-0.71749+93.17836，呈顯著負相

關（r=0.689）；第二類群僅包含紅色系（圖 7B），

L*

值和 C 值間無顯著相關性（r=0.080）。

第 11 期 王世堯等：基于表型的蝴蝶蘭花色數(shù)量分類 2231

表 3 基于 ISCC-NBS 系統(tǒng)對蝴蝶蘭的花色命名結果

Tab. 3 Colour naming results of Phalaenopsis based on ISCC-NBS system

色系

Colour group

顏色名稱

Colour name

數(shù)量

Number

色系

Colour group

顏色名稱

Colour name

數(shù)量

Number

黃偏粉 2 暗紅偏灰 1

淡黃 11 暗橙偏紅 1

中黃 1 強藍紫 9

強黃 1 淺藍紫 2

暗黃 1 淡藍紫 2

黃偏綠 11 艷藍紫 4

黃色

淡綠偏黃 1 中藍紫 1

棕偏紅 2

紫羅蘭

極淡藍紫 1

淺棕 5 粉偏灰紫 1

強棕 1 暗粉 1

棕偏黃 2

粉色

暗粉偏黃 1

淡棕 1 淺紫 9

淺棕偏黃 1 極淺紫 7

棕色

中棕偏紅 1 強紫 5

紅偏灰紫 2 淡紫 3

極深紅偏紫 2 亮紫 5

中紅偏紫 2 中紫偏紅 19

深紅偏紫 3 強紫偏紅 2

暗紅偏紫 8 淺紫偏紅 1

淺紅偏灰紫 3 艷紫偏紅 8

強紅偏紫 5

紫色

深紫偏紅 1

紅色

暗紅 4 白色 白 18

表 4 基于 ISCC-NBS 系統(tǒng)的蝴蝶蘭花色分類

Tab. 4 Classification of Phalaenopsis flower colour based on ISCC-NBS system

色系 供試樣本 Examples 孟塞爾系統(tǒng) Munsell system

Colour group 數(shù)量 Number 百分比 Percentage/% 色相 Hue 明度 Value 彩度 Chroma

白色 18 10.47 1.7P~4.0GY 8.48~9.01 0.03~0.79

黃色 28 16.28 7.9YR~9.4Y 5.67~8.58 1.26~9.24

棕色 13 7.56 10.0R~10.0YR 4.61~6.89 3.50~7.18

紫羅蘭色 19 11.05 0.4P~1.7P 3.10~8.39 2.00~15.73

紫色 60 34.88 6.6P~3.9RP 2.75~8.18 2.00~13.96

粉色 3 1.74 3.0RP~7.5R 4.98~6.62 4.00~5.38

紅色 31 18.02 4.1RP~9.2R 1.91~5.70 1.24~13.28

圖 4 基于 ISCC-NBS 系統(tǒng)蝴蝶蘭各系 L*

、a*

、b*

值箱線圖

Fig. 4 Box plot of different colour group of Phalaenopsis according to L*

、a*

、b* based on ISCC-NBS system

2232 熱帶作物學報 第 44 卷

圖 5 蝴蝶蘭花色表型分布圖

Fig. 5 Flower colour distribution of Phalaenopsis

圖 6 蝴蝶蘭 L*

值與 C 值的二維分布圖

Fig. 6 Scatterplot according to L*

and

C among Phalaenopsis

3 討論

蝴蝶蘭新品種 DUS 測試指南中[18]，利用

RHSCC 以群體目測的方式定義花瓣主色，將蝴蝶

蘭分為白色、黃色、綠色、橙色、粉紅色、紫紅

色和褐色等 7 種類型，該種方式存在一定的主觀

性，在實際應用中不能保證定義結果具有良好的

便捷性和精確度。而比色卡與測色儀相結合可保

留視覺的直觀性和精密儀器的客觀性，可實現(xiàn)對

花色的量化和精確描述。本研究中，基于側花瓣

的 L*

、a*

、b*

值進行聚類分析方法將蝴蝶蘭劃分

為 8 個類別，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)并不能將白色與淺粉色、

淺黃色和淺綠色等花色進行有效區(qū)分。殷涵泰等[19]

利用測色儀測定 107 份秋石斛品種花瓣和唇瓣的

顏色并進行聚類分析，將其分為白、粉、黃綠、

紫紅、淺紫、紫、深紫、復色等 8 個色系，但存

在黃色和綠色資源不能分開的情況；王玉蛟等[20]

在對芍藥的花色分類中也出現(xiàn)了此類情況，白色

與黃綠色系中的淺色品種聚為一類，表明僅使用

圖 7 蝴蝶蘭 L*

值與 C 值相關性分析

Fig. 7 Correlation analysis among L*

and C of Phalaenopsis

第 11 期 王世堯等：基于表型的蝴蝶蘭花色數(shù)量分類 2233

聚類分析對顏色較接近的花色進行分類易導致偏

差。ISCC-NBS 色名表示法是基于孟塞爾顏色系

統(tǒng)由美國色彩協(xié)會（Inter Society Colour Council,

ISCC）和美國國家標準局（National Bureau of

Standards, NBS）共同確定并頒布了 267 個適用于

非發(fā)光物質(zhì)的標準顏色名稱，可從 6 個維度對顏

色進行準確的分類和定義[21]。吳靜等[22]基于 466

個紫斑牡丹單株花色的表型值，使用 ISCC-NBS

色名表示法將紫斑牡丹的花色分為 8 大色系，可

有效區(qū)分相近的色系，取得了較合理的分類結果。

本研究基于聚類分析結果并利用 ISCC-NBS 色名

表示法將蝴蝶蘭花色分為 7 個色系，不同色系與

CIE Lab 系統(tǒng)的 L*

、a*

和 b*

參數(shù)具有合理的對應

關系，即可歸納各色系的參數(shù)分布范圍，實現(xiàn)對

不同蝴蝶蘭花色的定量描述，如目測易混淆為同

一色系的紫羅蘭色和紫色可通過 L*

值進行有效區(qū)

分，實際應用中被定性為粉色的品種如小梅花（P.

Xiaomeihua）、安娜（P. Anna）等被正確劃分為紫

色系，表明 ISCC-NBS 色名表示法的色系劃分具

備可量化的客觀性。但本研究中存在種質(zhì)資源樣

本較少的問題，如劃分為粉色系的供試種質(zhì)僅有

3 種，對應參數(shù)范圍的準確性仍需進一步完善；

此外，受限于分光測色儀的通光孔孔徑的尺寸，

蝴蝶蘭的紋路、斑點、斑塊等顏色分布類型難以

實現(xiàn)對其量化和精確描述。因此，須加強蝴蝶蘭

種質(zhì)資源的收集力度，同時進一步優(yōu)化測色方法，

通過聚類分析結合 ISCC-NBS 色名表示法及實際

生產(chǎn)應用進而綜合得到更科學、適用且精確的蝴

蝶蘭品種分類體系。

花朵呈色主要與其組織結構和組織細胞中的

色素種類、含量密切相關[23]。蝴蝶蘭花色多彩，

供試種質(zhì)在 a*

、b*

參數(shù)坐標上除藍綠色區(qū)間外廣

泛分布，缺乏純正的藍色品種。飛燕草素

（delphinidin）及其衍生物對藍色花形成至關重

要，F(xiàn)3′5′H 被稱為藍色基因，其時空表達和表達

強度決定了飛燕草素的分布和積累量[24]。蝴蝶蘭

中的 F3′5′H 基因與其他植物 F3′5′H 基因同源性僅

為 50%，可能在進化過程中丟失了原有的功能是

導致其無法呈藍色的潛在原因[25-26]。LIANG 等[27]

將大花飛燕草（ Delphinium grandiflorum ） 的

DgF3′5′H 和蝴蝶蘭 PeMYB2 在 P. Sogo Yukidian

‘V3’瞬時共表達，產(chǎn)生一種新奇的藍紫色，其液

泡的 pH 及金屬離子（Al3+、Ca2+、Fe3+）與花青

素的摩爾比均與紫色蝴蝶蘭存在顯著差異。日本

學者將鴨跖草的基因轉入蝴蝶蘭中，培育出轉基

因藍紫色蝴蝶蘭新品種 Blue Gene，但后代繁殖困

難及栽培過程中需添加外源物質(zhì)才能使其花色穩(wěn)

定[28-29]。隨著多組學和生物信息學技術日漸成熟，

基于藍色蝴蝶蘭呈色機制的復雜性，開展多維度

的交叉融合研究是培育藍色蝴蝶蘭新品種的必由

之路。

蝴蝶蘭花色表型的明度和彩度整體呈負相關

關系，可分為兩類：第一類群包括白色、黃色、

棕色、紫羅蘭色、紫色和粉色 6 個色系，第二類

群僅包含紅色系，這可能與決定各色系的多種類

別色素有關。蝴蝶石斛蘭中明度 L*

值與總花青苷

含量和總黃酮含量均呈極顯著負相關[30]。郭鑫等[31]

對 190 個紫斑牡丹品種為材料分析 L*

與 C 值，進

行相關性分析發(fā)現(xiàn)亦分為 2 個類群，紫紅色和黑

紅色系明度和彩度呈正相關，與本研究中紅色系

蝴蝶蘭的表征趨近。大部分植物的萼片為綠色，

而蘭科植物中萼片和花瓣特化的唇瓣均有豐富的

顏色[32]。李崇輝等[30]對 24 份蝴蝶石斛蘭種質(zhì)的

花色表型進行測定，發(fā)現(xiàn)唇瓣顏色比花瓣和萼片

暗，但色彩更濃郁，與蝴蝶蘭的花色特征相同。

在未來的蝴蝶蘭花色育種工作中，須進一步明確

外源基因導入對蝴蝶蘭色素合成途徑和呈色的作

用，亦可結合花型育種培育“三唇瓣”品種[33]；

此外，還可通過引入蝴蝶蘭近緣屬特殊的花色種

質(zhì)資源與其進行遠緣雜交，以期創(chuàng)制出新奇特異

的蝴蝶蘭花色新種質(zhì)，如蝴蝶蘭與萬代蘭屬

（Vanda）中的藍色或火焰蘭屬（Renanthera）的

亮橙色種質(zhì)資源進行屬間雜交，獲得的雜種群體

均可充分遺傳雙親的特點[34-35]。

4 結論

通過對 146 份蝴蝶蘭種質(zhì)資源花色表型值進

行測定，發(fā)現(xiàn)蝴蝶蘭花色較為豐富，缺乏藍色系；

花瓣和萼片顏色整體差異不大，唇瓣相較二者顏

色更暗，彩度較大?；趥然ò甑?L*

、a*

、b*

值

進行聚類分析的分類結果不能完全表征蝴蝶蘭花

色的分布特點；利用 ISCC-NBS 色名表示法可將

供試種質(zhì)資源分為黃色系、棕色系、紅色系、紫

羅蘭色系、粉色系、紫色系和白色系共 7 個色系，

對于蝴蝶蘭花色表型分類更為準確，整理出不同

色系花色參數(shù)范圍；整體上蝴蝶蘭花色明度和彩

度呈負相關，可分為紅色系和其余色系 2 個類群。

本研究初步建立基于表型的蝴蝶蘭花色數(shù)量分類

2234 熱帶作物學報 第 44 卷

體系，為蝴蝶蘭新品種和花色選育提供理論基礎。

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熱帶作物學報 2023, 44(11): 2236?2243

Chinese Journal of Tropical Crops

收稿日期 2023-06-28；修回日期 2023-07-25

基金項目 上海市科學技術委員會項目（No. 19390743600）；國家自然科學基金項目（No. 32271740）；上海市綠化和市容管

理局 2023 年科學技術項目（No. G232408）。

作者簡介 邵 麗（1989—），女，學士，工程師，研究方向：蘭科植物快速繁育。*通信作者（Corresponding author）：黃衛(wèi)

昌（HUANG Weichang），E-mail：huangweichang@csnbgsh.cn。

蘭科蒙自蘭快速繁殖和試管開花的研究

邵 麗1

，曾歆花1

，黃衛(wèi)昌1,2*

1. 上海辰山植物園/華東野生瀕危資源植物保育中心，上海 201602；2. 福建農(nóng)林大學藝術園林學院，福建福州 350002

摘 要：以蒙自蘭種子作為試驗材料，研究不同濃度配比的生長調(diào)節(jié)劑對蒙自蘭的無菌播種、快速繁殖和試管開花的

影響。結果表明：人工授粉后 105 d 的蒙自蘭種子活力強，萌發(fā)率高，1/2MS+0.6 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA 培養(yǎng)基較

適合種子萌發(fā)；叢芽增殖適宜用含 2.0 mL/L 6-BA 的培養(yǎng)基，不添加 NAA；生根壯苗用 1/2MS+1.0 mL/L NAA+30 g/L

土豆勻漿最佳；在 1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L PP333 培養(yǎng)基上蒙自蘭開花率最高。研究結果為蒙自蘭的物種

保護、可持續(xù)利用以及野外種群的恢復和重建提供重要材料和技術支持。

關鍵詞：蒙自蘭；無菌播種；快速繁殖；試管開花

中圖分類號：S682.31 文獻標識碼：A

Rapid Multiplication and in vitro Flowering of Mengzia foliosa (King

& Pantl.) W.C. Huang, Z.J. Liu & C. Hu (Orchidaceae)

SHAO Li1

, ZENG Xinhua1

, HUANG Weichang1,2*

1. Shanghai Chenshan Botanical Garden / Eastern China Conservation Centre for Wild Endangered Plant Resources, Shanghai

201602, China; 2. College of Landscape Architecture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China

Abstract: In this study, the effects of different concentration and ratio of growth regulators on seed germination, rapid

propagation and in vitro flowering of Mengzia foliosa were studied. The results showed that the seeds had strong activity

and high germination rate at 105 days after artificial self-pollination, and 1/2MS+0.6 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA medium was more suitable for seed germination. Meanwhile, 2.0 mL/L 6-BA without NAA was more suitable for cluster

bud proliferation; and 1/2MS+1.0 mL/L NAA+30 g/L potato homogenate medium was the best for rooting and hardening-off. In addition, 1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L PP333 medium had the highest flowering rate. Our results

not only contribute to the conservation and sustainable use of the species, but also provide important materials and

technical support for wild population restoration and reconstruction.

Keywords: Mengzia foliosa; aseptic sowing; rapid propagation; in vitro flowering

DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2023.11.012

蒙自蘭[Mengzia foliosa (King & Pantl.) W.C.

Huang, Z.J. Liu & C. Hu]，是蘭科蒙自蘭屬多年生

草本植物，主要分布于中國云南南部、泰國的山

坡林下?；谇捌谛螒B(tài)學和分子系統(tǒng)學的分析結

果，華白及[Bletilla sinensis (Rolfe) Schltr.]區(qū)別于

蘭科龍嘴蘭族的白及屬和其他屬植物。因此，以華

白及作為模式種，建立蘭科新屬——蒙自蘭屬[1]。

當前，由于生境破壞和人為干擾，蒙自蘭野外居

群和植株數(shù)量極少，目前已被列為國家保護的瀕

危植物[2]。此外，蒙自蘭在引種栽培和繁育過程

中也存在生長緩慢、開花少和結實困難等問題，

這極不利于蒙自蘭野外種群的恢復和重建。蘭科

植物種子數(shù)量巨大，一個果莢內(nèi)含有成千上萬粒

種子，通過無菌播種技術能快速繁殖大量種苗；

第 11 期 邵 麗等：蘭科蒙自蘭快速繁殖和試管開花的研究 2237

此外，通過試管開花技術能打破天氣、季節(jié)和地

域的限制，可提高植物開花率和結實率，從而滿

足植物資源保護和可持續(xù)開發(fā)利用所需的植物材

料。目前，國內(nèi)外對蘭科植物組培快繁和試管開

花的研究有較多報道，如春蘭[3]、建蘭[4]、寒蘭[5]、

鐵皮石斛[6]、梳唇石斛[7]、春石斛[8]、虎舌蘭[9]、

報春石斛[10]和扇形文心蘭[11]等。而瀕危蘭科植物

蒙自蘭由于稀缺的野外材料，其無菌播種繁殖、

藥效和試管開花等相關研究均處于空白狀態(tài)。為

加快該物種的保護和開發(fā)利用，亟需開展蒙自蘭

的快速繁育和試管開花研究。

本研究通過研究不同濃度 6-BA、NAA、營養(yǎng)

物質(zhì)對蒙自蘭生長的影響，以及 6-BA、NAA、

TDZ、2,4-D、PP333 對試管開花的影響，篩選出最

佳培養(yǎng)基配方，建立一套高效的快繁技術體系。

不但可以為該物種的種群回歸和恢復等保育生物

學研究提供幫助，還能為其開花調(diào)控機理研究和

縮短育種周期提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料取自云南人工授粉的蒙自蘭未開裂

果莢。

1.2 方法

1.2.1 種子消毒滅菌 將蒙自蘭蒴果在流水下沖

洗 0.5 h，然后用吸水紙將種莢表面水分吸干后轉

入無菌操作臺。參照王麗等[12]的方法，用 75%酒

精浸泡 30 s，然后用含少許吐溫 20 的 0.1%升汞

溶液震蕩消毒 10~15 min，無菌水沖洗 5 遍，濾紙

吸干表面水分后待用。

1.2.2 種子萌發(fā) （1）不同成熟度種子的萌發(fā)。

播種不同成熟程度的蒴果，成熟度為從自交到播

種的天數(shù)分別為 85、95、105、115 d。剖開消毒

過的蒴果，將種子均勻接種于含 0.5 mg/L NAA、

30 g/L 蔗糖、6.5 g/L 瓊脂、0.2 g/L 活性炭，pH

為 5.8 的 1/2MS 培養(yǎng)基上。共 4 組處理 A1~A4，

每個處理接種 10 瓶，每瓶約 100 粒種子，分別記

錄萌發(fā)時間和統(tǒng)計種子萌發(fā)數(shù)，并計算萌發(fā)率。萌

發(fā)率=萌發(fā)種子數(shù)量/接入種子總數(shù)×100%。

（2）不同培養(yǎng)基對種子萌發(fā)的影響?；九?/p>

養(yǎng)基以MS和1/2MS為對照，添加不同濃度的 NAA

和 6-BA，采用 L16(43

)正交表設計（表 1）。設置

16 組樣本 B1~B16，每組接種 5 瓶，每瓶 100 粒種

子，待種子萌發(fā)后統(tǒng)計萌發(fā)種子數(shù)，計算萌發(fā)率。

表 1 播種正交試驗表

Tab. 1 Orthogonal test table of sowing

水平 Level 培養(yǎng)基 Mmedium NAA/(mg·L–1) 6-BA/(mg·L–1)

1 MS 0 0

2 1/2MS 0.2 0.5

3 0.6 1.0

4 1.0 1.5

1.2.3 叢芽增殖 將萌發(fā)后長小葉的蒙自蘭小苗

接種至不同培養(yǎng)基，基礎培養(yǎng)基為 1/2MS，添加

不同濃度 NAA 和 6-BA，NAA 的濃度梯度設置為

0、0.2、0.5 mg/L，6-BA 的濃度梯度設置為 0.5、

1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L，不添加任何激素的作為

對照組（CK）。15 個處理 C1~C15，每組處理 10

個重復 150 芽，60 d 后統(tǒng)計增殖率。

1.2.4 生根壯苗 將增殖后約同等大小的蒙自蘭

小苗接種至不同的生根壯苗培養(yǎng)基?；A培養(yǎng)基

是 1/2MS，添加不同濃度生長素和營養(yǎng)物勻漿，

設置 L16(43

)正交試驗表（表 2）。不添加任何生長

調(diào)節(jié)劑和營養(yǎng)物的培養(yǎng)基作為對照組（CK），16

個處理 D1~D16，每組 10 個重復共 100 苗，60 d

后測量生根數(shù)量、根長和苗高[13]。

表 2 生根壯苗正交試驗表

Tab. 2 Orthogonal test table of rooting and strenghening

水平

Level

NAA

/(mg·L–1)

營養(yǎng)物

Nutrient

營養(yǎng)物濃度

Nutrient concentration/(g·L–1)

1 0 香蕉 10

2 0.2 椰子水 30

3 0.5 土豆 50

4 1.0 100

1.2.5 試管開花 將叢芽增殖后約同等大小的蒙

自蘭幼苗接種至不同的催花培養(yǎng)基。以 1/2MS 為

基礎培養(yǎng)基，添加不同濃度的細胞分裂素 6-BA

（1.0、2.0 mg/L）、TDZ（0.1、0.5 mg/L）和生長

素 NAA（0.2、0.5 mg/L）、2,4-D（0.2、0.5 mg/L），

兩兩配比，另添加多效唑 PP333 1.0 mg/L，以不添

加 PP333 的處理作為對照組（CK），16 個處理 E1~

E16，每組 5 個重復共 25 苗，90 d 后統(tǒng)計開放花朵

數(shù)，計算開花率和正?；?。開花率=開放花朵數(shù)

/接種外植體數(shù)×100%；正?；?正?；ǘ鋽?shù)/開放

花朵數(shù)×100%。

1.2.6 培養(yǎng)條件 通過預試驗發(fā)現(xiàn)蒙自蘭從萌發(fā)

到幼苗生長各階段在 1/2MS 培養(yǎng)基上均生長良

好，因此設置叢芽增殖、生根壯苗、試管開花試

2238 熱帶作物學報 第 44 卷

驗的基本培養(yǎng)基均為 1/2MS。各培養(yǎng)基中均加入

0.2 g/L 活性炭、6.5 g/L 瓊脂、30 g/L 蔗糖，催花

培養(yǎng)基中另外添加 30 g/L 香蕉勻漿，pH 均調(diào)為

5.8。培養(yǎng)室溫度控制在(25±1)℃，光照時長為

12 h/d，光照強度為 2000 lx。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用正交設計助手Ⅱv3.1 軟件設置正交試驗

表，運用 SPSS16.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理。采用單因

素方差分析比較不同種子成熟度對種子萌發(fā)率的

影響；采用多因素方差分析比較不同培養(yǎng)基對種

子萌發(fā)率，以及不同激素濃度配比對叢芽增殖率、

根長、苗高、根數(shù)量、花芽分化率和正常開花率

的影響。采用 Tukey HSD 方法比較不同實驗組的

顯著性差異（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 不同成熟度對蒙自蘭種子萌發(fā)的影響

蒙自蘭種子的成熟度對其萌發(fā)率有顯著影響

（表 3）。授粉后 85~105 d 的種子呈白色，萌發(fā)所

需時間均在 30 d 左右，隨著種子成熟時間的延長

其萌發(fā)率遞增，A3 與 A1、A2 間呈顯著差異。105 d

的種子萌發(fā)率最高為 87.00%，顯著高于 115 d 的

種子萌發(fā)率，且萌發(fā)出原球莖后葉片分化快。授

粉 115 d 的種子顏色略深，萌發(fā)時間最短，但萌

發(fā)率明顯降低，且萌發(fā)后的原球莖葉分化率低。

表 3 不同成熟度種子的萌發(fā)率

Tab. 3 Germination rate of different maturity seeds

處理

Treatment

授粉后天數(shù)

Days after pollination

萌發(fā)所需天數(shù)

Days required for

germination

萌發(fā)率

Germination

rate/%

A1 85 29 58.00±3.40b

A2 95 30 63.00±6.05b

A3 105 31 87.00±1.14a

A4 115 13 14.00±3.85c

注：同列不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate

significant difference (P<0.05).

2.2 不同培養(yǎng)基對蒙自蘭種子萌發(fā)的影響

成熟度為 105 d 的蒙自蘭種子播種于不同培

養(yǎng)基上，供試的 16 組培養(yǎng)基均能萌發(fā)，但各組萌

發(fā)率有顯著差異（表 4）。B15 處理的培養(yǎng)基

（1/2MS+0.6 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA）的萌發(fā)

率最高，為 97.00%。在 16 組處理中，當 NAA 濃

度相同時，萌發(fā)率隨 6-BA 濃度的升高而增加；

而當 6-BA 濃度相同時，較低 NAA 濃度的萌發(fā)率

較高，其中 B9 和 B15 的萌發(fā)率接近，且 B9 的萌發(fā)

率僅次于 B15；當 NAA 濃度為 1.0 mg/L 時，MS

培養(yǎng)基的萌發(fā)率較低，B4 和 B8 的萌發(fā)率分別為

5.00%和 9.40%；當 6-BA 濃度為 1.5 mg/L 時，

1/2MS 培養(yǎng)基的萌發(fā)率有所降低。從表 5 中可知，

基礎培養(yǎng)基、NAA、6-BA 對蒙自蘭種子萌發(fā)的影

響均存在顯著性差異（P<0.05），對比三因素的 F

值發(fā)現(xiàn)，影響種子萌發(fā)率的大小順序為基礎培養(yǎng)

基＞NAA＞6-BA。

表 4 不同培養(yǎng)基對蒙自蘭種子萌發(fā)的影響

Tab. 4 Effects of different medium on seed germination

of M. foliosa

處理

Treatment

基礎培養(yǎng)基

Basic medium

NAA

/(mg·L–1)

6-BA

/(mg·L–1)

萌發(fā)率

Germination rate/%

B1 MS 0 1.5 87.20±3.60ab

B2 MS 0.2 1.0 41.20±8.05de

B3 MS 0.6 0.5 15.20±6.70fg

B4 MS 1.0 0 5.00±3.16g

B5 MS 0 0.5 77.80±5.38abc

B6 MS 0.2 0 35.60±6.53ef

B7 MS 0.6 1.5 65.00±4.46bcd

B8 MS 1.0 1.0 9.40±4.77g

B9 1/2MS 0 1.0 96.40±0.60a

B10 1/2MS 0.2 1.5 93.40±1.86a

B11 1/2MS 0.6 0 5.20±3.25g

B12 1/2MS 1.0 0.5 57.40±5.59cde

B13 1/2MS 0 0 89.40±4.99a

B14 1/2MS 0.2 0.5 62.40±4.86cd

B15 1/2MS 0.6 1.0 97.00±2.00a

B16 1/2MS 1.0 1.5 79.40±4.61abc

注：同列不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate

significant difference (P<0.05).

表 5 種子萌發(fā)主體間效應檢驗

Tab. 5 Testing of inter subject effects of seed germination

源

Source

平方和

Sum of squares

自由度

df

均方

Mean square

F P

基礎培養(yǎng)基 18 635.513 1 18 635.513 31.640 0.000

NAA 28 840.438 3 9 613.479 16.322 0.000

6-BA 4132.813 1 4 132.813 7.017 0.010

誤差 43 584.425 74 588.979

2.3 不同激素濃度對蒙自蘭叢芽增殖的影響

蒙自蘭種子播種后約 30 d 萌發(fā)形成原球莖。

將其轉接至增殖分化培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)原球莖會分化

第 11 期 邵 麗等：蘭科蒙自蘭快速繁殖和試管開花的研究 2239

成苗，但增殖形成的愈傷組織并未分化且逐漸發(fā)

黃死亡。因此在原球莖分化出葉片后再進行叢芽

增殖處理。將 1/2MS 作為基本培養(yǎng)基，觀察 NAA

和 6-BA 對叢芽增殖的影響（表 6）。結果顯示，

各處理的蒙自蘭叢芽均具有不同程度的增殖，未

添加 NAA 和 6-BA 的 CK 組的增殖率顯著低于添

加激素處理組；C2 和 C4 顯著高于其他處理，2 組

處理均未添加 NAA；C4 處理的增殖率最大，為

47.33%，其 6-BA 添加濃度為 2.0 mg/L；添加激素

處理組中，C5 的增殖率最低為 18.01%，其 6-BA

添加濃度為 2.5 mg/L，C4和 C5處理均未添加 NAA。

主體效應分析顯示（表 7），不同濃度的 NAA 對叢

芽增殖的影響差異不顯著（P>0.05），而不同濃度

的 6-BA 對叢芽增殖的影響差異顯著（P<0.05）。

2.4 不同濃度 NAA 及營養(yǎng)物對蒙自蘭生根壯

苗的影響

將蒙自蘭叢芽接種到不同培養(yǎng)基上，觀察

NAA 和不同營養(yǎng)物質(zhì)對蒙自蘭生根壯苗的影響。

結果表明，D15 培養(yǎng)基 1/2MS+1.0 mg/L NAA+30 g/L

土豆勻漿處理的蒙自蘭生長狀況最佳，苗高、根

長和根的數(shù)量均顯著高于其他處理（表 8）。由表

9 可知，各因素間呈顯著性差異（P<0.05）。營養(yǎng)

物對蒙自蘭根長和根數(shù)量的影響大于 NAA，30 g/L

土豆勻漿處理的生根效果最佳，其次是濃度 10 g/L，

土豆勻漿超過 30 g/L 反而抑制生根；30、50 ml/L

表 6 不同激素濃度對蒙自蘭叢芽增殖的影響

Tab. 6 Effects of different hormone concentration on

cluster buds proliferation of M. foliosa

處理

Treatment

NAA

/(mg·L–1)

6-BA

/(mg·L–1)

增殖率

Proliferation rate/%

C1 0 0.5 21.34±3.41ab

C2 0 1.0 43.98±7.70a

C3 0 1.5 18.68±7.50ab

C4 0 2.0 47.33±11.90a

C5 0 2.5 18.01±5.71ab

C6 0.2 0.5 19.99±4.87ab

C7 0.2 1.0 38.67±7.81ab

C8 0.2 1.5 30.66±11.12ab

C9 0.2 2.0 26.02±5.83ab

C10 0.2 2.5 36.00±4.99ab

C11 0.5 0.5 37.34±5.72ab

C12 0.5 1.0 20.00±4.44ab

C13 0.5 1.5 20.01±5.26ab

C14 0.5 2.0 32.01±9.48ab

C15 0.5 2.5 37.99±8.78ab

CK 6.00±1.84b

注：同列不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate

significant difference (P<0.05).

表 7 從芽增殖主體間效應檢驗

Tab. 7 Testing of inter subject effects of cluster

buds proliferation

源

Source

平方和

Sum of squares

自由度

df

均方

Mean square

F P

NAA 15.920 2 7.960 0.014 0.986

6-BA 7927.236 5 1585.447 2.854 0.017

誤差 84 426.832 152 555.440

表 8 不同濃度 NAA 及營養(yǎng)物對蒙自蘭幼苗生長的影響

Tab. 8 Effects of different concentration of NAA and nutrients on seedling growth of M. foliosa

處理

Treatment

NAA

/(mg·L–1)

營養(yǎng)物

Nutrient

營養(yǎng)物濃度

Nutrient concentration/(g·L–1)

根長

Root length/cm

苗高

Plant height/cm

根數(shù)量

Number of roots

D1 0 香蕉 10 2.96±0.90de 4.83±1.33b

5.85±2.66bc

D2 0 椰子水 30 3.34±1.05cd 4.80±1.63bc 6.45±2.35b

D3 0 土豆 50 1.64±0.67i

3.09±1.61gh 3.21±1.43g

D4 0 香蕉 100 3.94±1.13ab 4.43±1.56bcd 5.10±2.04cd

D5 0.2 香蕉 30 3.02±1.27cde 3.26±1.53fgh 3.91±1.57efg

D6 0.2 椰子水 10 2.60±1.01efg 2.24±0.63ij 3.49±1.36fg

D7 0.2 土豆 100 2.36±0.83fgh 4.24±2.07bcde 4.71±2.05de

D8 0.2 香蕉 50 2.57±1.20efg 4.17±1.73bcde 3.68±1.39fg

D9 0.5 香蕉 50 2.50±0.85efgh 4.26±1.53bcde 3.82±1.39efg

D10 0.5 椰子水 100 2.89±0.99def 2.97±1.09hi 3.73±1.41efg

D11 0.5 土豆 10 4.04±0.85ab 3.98±1.77cdef 4.93±2.20cd

D12 0.5 香蕉 30 2.18±1.14ghi 3.88±1.45defg 4.24±1.27def

D13 1.0 香蕉 100 2.86±1.23def 2.83±1.07hi 3.69±1.80fg

D14 1.0 椰子水 50 3.53±1.16bc 6.81±1.03a

5.00±1.46cd

D15 1.0 土豆 30 4.34±0.97a

6.91±2.21a

9.90±3.04a

D16 1.0 香蕉 10 2.01±0.82hi 3.44±1.43efgh 3.04±1.25g

CK 0.88±0.07j

1.67±0.10j

1.71±0.10h

注：同列不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference (P<0.05).

2240 熱帶作物學報 第 44 卷

表 9 生根壯苗主體間效應檢驗

Tab. 9 Testing of inter subject effects of rooting

and strenghening

指標

Index

源

Source

平方和

Sum of

squares

自由度

df

均方

Mean

square

F P

NAA 49.439 3 16.480 16.516 0.000

營養(yǎng)物 319.573 4 79.893 80.071 0.000

根長

誤差 1340.015 1343 0.998

NAA 425.283 3 141.761 63.212 0.000

營養(yǎng)物 542.129 4 135.532 60.435 0.000

苗高

誤差 3011.834 1343 2.243

NAA 491.185 3 163.728 49.255 0.000

營養(yǎng)物 1266.742 4 316.685 95.269 0.000

根數(shù)量

誤差 4464.272 1343 3.324

椰子水和 100 g/L 香蕉勻漿也有利于生根，但效

果比土豆勻漿差。NAA 對苗高的影響大于營養(yǎng)

物，1.0 mg/L 的 NAA 有利于幼苗莖葉生長，D14、

D15 處理組的苗高顯著高于其他處理。

2.5 不同激素濃度對蒙自蘭試管開花的影響

在蒙自蘭生根壯苗試驗中發(fā)現(xiàn)，添加 30 g/L

香蕉勻漿的培養(yǎng)基上幼苗有部分開花現(xiàn)象，故在

試管開花試驗培養(yǎng)基中以添加 30 g/L 香蕉勻漿來

促進其開花，CK 組不添加。將生長健壯、苗高基

本一致的蒙自蘭幼苗接種到不同培養(yǎng)基上，觀察

不同激素對幼苗花芽分化和開花的影響。從表 10

可知，在添加 PP333 的條件下，E2 處理的花芽分

化率和正常開花率均顯著高于其他處理，是最優(yōu)

催花培養(yǎng)基。觀察花芽分化情況發(fā)現(xiàn)（圖 1），E1、

E2、E3 培養(yǎng)基的花梗均較長且大多植株開 2~4 朵

花（圖 1A），而其他培養(yǎng)基處理的開花株均為 1

梗 1 朵（圖 1B）；與 E1 對比發(fā)現(xiàn)，未添加 PP333

的 CK 培養(yǎng)基幼苗無花芽分化；當添加相同濃度

的 6-BA 時，除 E6 未開花，NAA 與 6-BA 組合處

理的花芽分化率顯著優(yōu)于 2,4-D 與 6-BA 組合處

理，且花朵畸形率也較低；含 2,4-D 的培養(yǎng)基處

理中，除 E16 外，花芽分化率均顯著低于其他處

理，且花朵畸形率較高；TDZ 對蒙自蘭花芽分化

也有促進作用，0.5 mg/L TDZ 處理的作用效果明

顯高于 0.1 mg/L TDZ，但其花朵畸形率高于含

6-BA 的培養(yǎng)基處理，可見添加 TDZ 會增加蒙自

蘭花朵畸形率，而 2,4-D 對蒙自蘭花芽分化有一

定的抑制作用。添加 0.5 mg/L TDZ 和 0.5 mg/L

NAA 的 E12 處理培養(yǎng)基上幼苗的開花狀態(tài)為花梗

短且花瓣卷曲（圖 1C）；添加 0.1 mg/L TDZ 和

0.5 mg/L 2,4-D 的 E14 處理培養(yǎng)基上幼苗的開花狀

態(tài)為花梗短且花朵呈閉合狀態(tài)直至凋謝（圖 1D）。

表 10 不同激素濃度對蒙自蘭試管開花的影響

Tab. 10 Effects of different hormone concentration on in vitro flowering of M. foliosa

處理

Treatment

6-BA

/(mg·L-1)

TDZ

/(mg·L-1)

NAA

/(mg·L-1)

2,4-D

/(mg·L-1)

PP333

/(mg·L-1)

花芽分化率

Flower bud differentiation rate/%

正常開花率

Normal flowering rate/%

E1 1.0 0.2 1.0 20.00±8.94cde 60.00±24.49ab

E2 1.0 0.5 1.0 132.00±4.90a

84.29±6.97a

E3 2.0 0.2 1.0 40.00±10.95bcd 70.00±20.00ab

E4 2.0 0.5 1.0 32.00±10.20bcde 63.33±18.56ab

E5 1.0 0.2 1.0 8.00±4.90de 0c

E6 1.0 0.5 1.0 0e

0c

E7 2.0 0.2 1.0 8.00±4.90de 20.00±20.00bc

E8 2.0 0.5 1.0 4.00±4.00de 20.00±20.00bc

E9 0.1 0.2 1.0 4.00±4.00de 20.00±20.00bc

E10 0.1 0.5 1.0 4.00±4.00de 20.00±20.00bc

E11 0.5 0.2 1.0 64.00±4.00b

80.00±8.16a

E12 0.5 0.5 1.0 12.00±4.90de 20.00±20.00bc

E13 0.1 0.2 1.0 0e

0c

E14 0.1 0.5 1.0 8.00±8.00de 20.00±20.00bc

E15 0.5 0.2 1.0 8.00±4.90de 40.00±24.50abc

E16 0.5 0.5 1.0 52.00±17.44bc 52.00±22.45abc

CK 1.0 0.2 0e

0c

注：同列不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference (P<0.05).

第 11 期 邵 麗等：蘭科蒙自蘭快速繁殖和試管開花的研究 2241

A：一梗多花；B：正常開花；C~D：花朵畸形；E：105 d 種子；F：115 d 種子。

A: A stalk with several flowers; B: Normal flower; C-D: Flowers malformation; E: Seeds of 105 days; F: Seeds of 115 days.

圖 1 蒙自蘭種子及試管開花狀態(tài)

Fig. 1 Seeds and in vitro flowering of M. foliosa

3 討論

蒙自蘭在野生狀態(tài)和人工栽培條件下生長緩

慢，利用無菌種子培養(yǎng)可有效解決分株繁殖系數(shù)

低、繁殖周期長的問題。本研究表明，在 1/2MS

培養(yǎng)基上，蒙自蘭從種子萌發(fā)到壯苗的各階段均

能較好生長，生長調(diào)節(jié)劑對生長各階段起到的促

進或抑制作用各有差異。

種子成熟度對種子萌發(fā)有著重要影響[14]。通

過解剖鏡觀察種子發(fā)現(xiàn)，蒙自蘭 105 d 的種子胚

圓潤飽滿（圖 1E），而 115 d 的種子胚縮小、種皮

變厚（圖 1F）。用 TTC 溶液對種子進行染色發(fā)現(xiàn)，

85、95、105 d 的種子很快被染色，而 115 d 的種

子只有少數(shù)種子被染色，且染色所需時間較長。

因此，115 d 的種子萌發(fā)率低可能與種子活性低、

胚齡長或種皮變厚有關。蔣雅婷等[15]研究發(fā)現(xiàn)，

無距蝦脊蘭種子胚齡為 120 d 時萌發(fā)率最高，隨

后逐漸降低，到 210 d 時，萌發(fā)率降為 0。蒙自蘭

野外植株數(shù)量少，組培苗養(yǎng)護難度高且開花難，

目前能得到的果莢數(shù)量有限，因此尚未觀察到其

果莢自然開裂的時間和狀態(tài)。種子在 115 d 以后

的萌發(fā)率是否會降到 0 以及果莢自然開裂的時間

后續(xù)還需進一步試驗加以驗證。1/2MS 培養(yǎng)基的

種子萌發(fā)率均較高，說明低鹽分培養(yǎng)基有利于蒙

自蘭種子萌發(fā)，這與漆子鈺[3]對春蘭種子的萌發(fā)

研究結果一致。NAA 和 6-BA 的不同濃度組合也

影響種子萌發(fā)，1/2MS+0.6 mg/L NAA+1.0 mg/L

6-BA 的培養(yǎng)基萌發(fā)率最高為 97.00%，而 105 d

的種子在 1/2MS+0.5 mg/l NAA 培養(yǎng)基中的萌發(fā)

率為 87.00%，在 NAA 濃度接近的情況下，其萌

發(fā)率相對較低的原因可能是未添加 6-BA?？梢?，

培養(yǎng)基配方對蒙自蘭種子萌發(fā)起著關鍵作用。

蒙自蘭種子萌發(fā)后原球莖會快速進入葉分化

階段，在分化之前可以通過添加生長調(diào)節(jié)劑對原

球莖進行增殖處理，但增殖出的愈傷組織未能分

化成苗，可能增殖出的愈傷為非胚性愈傷組織。

而對已分化出葉片的幼苗進行叢芽增殖發(fā)現(xiàn)均為

有效增殖，且叢芽健壯，未發(fā)現(xiàn)徒長、弱化或玻

璃化現(xiàn)象。在植物組織培養(yǎng)中，細胞分裂素可刺

激細胞分裂，促進芽分化和生長[3]。不同品種蘭

科植物所需的生長調(diào)節(jié)劑種類、組合和濃度也不

2242 熱帶作物學報 第 44 卷

同。蒙自蘭叢芽增殖試驗結果表明，2.0 mg/L 6-BA

對叢芽增殖效果最佳，這與滇金石斛[13]、血葉蘭[16]

叢芽增殖所需的分裂素一致，但濃度不同，且滇

金石斛還需添加 NAA，血葉蘭還需添加 NAA 和

TDZ。而杜鵑蘭叢生芽增殖需要 2.0 mg/L TDZ 和

0.2 mg/L IAA[17]，與蒙自蘭不同。生長素 NAA 能

促進試管苗生長、生根和壯苗。除生長調(diào)節(jié)劑外，

一些天然營養(yǎng)物質(zhì)，如椰青、香蕉、土豆、蘋果、

酵母浸出物等，對某些植物器官組織有一定的促

進生長作用。椰青、香蕉和土豆被廣泛應用于蘭

科植物的組織培養(yǎng)。1.0 mg/L NAA 和 30 g/L 土豆

為蒙自蘭幼苗生根壯苗的最優(yōu)組合，這與三褶蝦

脊蘭[18]幼苗生長所需的添加物和生長調(diào)節(jié)劑種類

一致，三褶蝦脊蘭需要 100 g/L 土豆泥和 0.1 mg/L

NAA。

蒙自蘭試管開花試驗發(fā)現(xiàn)，生長調(diào)節(jié)劑和營

養(yǎng)物質(zhì)對幼苗開花均有一定促進作用。部分開花

株植株矮小，且球莖大、葉片寬，可能是 PP333

抑制植株莖的生長，刺激其提前開花的原因。這

與李杰等[19]在霍山石斛花芽誘導試驗中 TDZ 與

PP333 組合處理的畸形花比率高的結果一致。蒙自

蘭幼苗在 90 d 內(nèi)陸續(xù)開花，這與梳唇石斛[7]試管

開花狀態(tài)一致，但梳唇石斛開花可持續(xù)半年以上。

蒙自蘭單朵花期在 7~10 d 左右，90 d 后花芽分化

結束，這可能與培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的消耗有關。

本研究結果顯示，蒙自蘭試管開花的最佳培養(yǎng)基

為 1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L

PP333+30 g/L 香蕉。6-BA 與 NAA 組合處理的誘

導效果最佳，這與梳唇石斛[7]的開花誘導結果一

致?；羯绞鶾19]在花芽誘導培養(yǎng)基中也添加了香

蕉勻漿物。但蒙自蘭開花時間不統(tǒng)一，個別植株

從播種到開花僅需 145 d。蘭科植物開花受多種因

素的影響，除培養(yǎng)基成分外，還受環(huán)境因子的調(diào)

控，如溫度、光照強度、光照時長等[20]。本研究

取得蒙自蘭試管開花的初步結果，但如何提高試

管開花率和花朵品質(zhì)，以及誘導開花的機理仍有

待進一步探索。

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熱帶作物學報 2023, 44(11): 2244?2255

Chinese Journal of Tropical Crops

收稿日期 2022-10-21；修回日期 2022-11-09

基金項目 海南省自然科學基金項目（No. 320RC731）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費項目（No. 1630022020023）。

作者簡介 楊晶晶（2001—），女，本科生，研究方向：植物分子生物學。*通信作者（Corresponding author）：肖小虎（XIAO

Xiaohu），E-mail：xiaofeihu_011588@126.com。

巴西橡膠樹 ACA/ECA 基因家族鑒定及分析

楊晶晶1,2，方永軍1

，張鴻韜1,3，龍翔宇1

，秦云霞1

，陽江華1

，肖小虎1*

1. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室/中國熱帶農(nóng)業(yè)學院橡膠研究所，海南?？?571101；2. 云南農(nóng)業(yè)大

學熱帶作物學院，云南普洱 665099；3. 海南大學熱帶作物學院，海南?？?570228

摘 要：Ca2+是植物細胞的第二信使，Ca2+-ATPase（ACA/ECA）作為 Ca2+運輸?shù)闹匾鞍祝诒ＷC細胞內(nèi)鈣離子的平

衡和植物非生物脅迫方面發(fā)揮著至關重要的作用。為了研究巴西橡膠樹中 Ca2+-ATPase（ACA/ECA）的生物學功能，

以模式植物擬南芥的 ACA/ECA 蛋白序列為探針，從橡膠樹基因組中鑒定得到 45 個 ACA/ECA 基因家族成員，其中 ACA

成員 38 個，ECA 成員 7 個。利用 Expasy、Plant-mPLoc 等工具對 45 個成員的理化性質(zhì)、基因結構、染色體定位、系

統(tǒng)進化和表達進行全面分析。理化性質(zhì)分析表明：各成員編碼蛋白的氨基酸數(shù)目為 86~1142 個，氨基酸分子量在 10

048.04~125 412.75 Da 之間，蛋白產(chǎn)物多定位于細胞質(zhì)膜，有少量成員定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、葉綠體、液泡和細胞核。在進化

方面，ACA/ECA 家族成員明顯聚于 ACA 和 ECA 兩個分枝，2 個分支中橡膠樹始終與木薯緊靠，表明在系統(tǒng)進化過程

中橡膠樹與木薯存在較近的親緣關系。染色體定位結果顯示：ACA/ECA 家族的 45 個成員不均勻地分布在橡膠樹的 14

條染色體和 1 個 contig 上，其中 2 號和 9 號染色體上成員分布最多，為 11 個。表達分析顯示：部分成員在不同組織中

的表達存在顯著差異，HbACA31 在葉片中表達豐度最高，HbACA36 在膠乳中表達豐度最高，并且 HbACA36 經(jīng)乙烯利

刺激處理后在膠乳中的表達明顯上調(diào)。另外，本研究還分析了割膠對 ACA/ECA 家族成員基因表達的影響，發(fā)現(xiàn)

HbACA36 在 PR107 和熱研 8-79 兩個橡膠樹品種割膠過程中均處于較高的表達水平，并且在高產(chǎn)品種熱研 8-79 開割過

程中明顯上調(diào)表達，推測 HbACA36 參與橡膠樹產(chǎn)膠排膠調(diào)控，并在其中起重要作用。本研究結果首次揭示了橡膠樹

ACA/ECA 家族成員的理化性質(zhì)和表達模式，為進一步研究 ACA/ECA 基因在巴西橡膠樹中的生物學功能，特別是橡膠

樹產(chǎn)膠調(diào)控方面的功能奠定基礎。

關鍵詞：巴西橡膠樹；Ca2+-ATPase（ACA/ECA）；基因家族；生物學功能；表達分析

中圖分類號：S794.1 文獻標識碼：A

Identification and Analysis of ACA/ECA Gene Family in Hevea brasiliensis

YANG Jingjing1,2, FANG Yongjun1

, ZHANG Hongtao1,3, LONG Xiangyu1

, QIN Yunxia1

, YANG Jianghua1

,

XIAO Xiaohu1*

1. Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree, Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Rubber Research

Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou, Hainan 571101, China; 2. College of Tropical Crops, Yunnan

University, Pu’er, Yunnan 665099, China; 3. College of Tropical Crops, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China

Abstract: Ca2+ is a second messenger in plant cells, and Ca2+-ATPase (ACA/ECA), as an important protein in Ca2+

transport, plays a crucial role in ensuring the balance of intracellular calcium ions and abiotic stress in plants. To investigate the biological function of Ca2+-ATPase (ACA/ECA) in Hevea brasiliensis, 45 ACA/ECA gene family members

were identified from the rubber tree genome using the ACA/ECA protein sequence of the model plant Arabidopsis as a

probe, including 38 ACA members and 7 ECA members. Expasy and Plant-mPLoc were used to comprehensively analyze the physicochemical properties, gene structure, chromosomal localization, phylogeny, and expression patterns of

第 11 期 楊晶晶等：巴西橡膠樹 ACA/ECA 基因家族鑒定及分析 2245

the 45 members. Physicochemical properties analysis showed that the number of amino acids encoded by each member

was 86?1142, the molecular weight of amino acids ranged from 10 048.04 to 125 412.75 Da, and the protein products

were mostly localized on the cytoplasmic membrane, with a few members localized on the endoplasmic reticulum,

chloroplast, vacuole, and nucleus. In evolutionary, members of the ACA/ECA family were clearly clustered into ACA

and ECA two branches, and rubber tree members were always in close proximity to cassava in both branches, indicating

that there was a close relative between rubber tree and cassava during phylogeny. Chromosomal localization revealed

that the 45 members of the ACA/ECA family were unevenly distributed across 14 chromosomes and one contig in rubber tree, in which, chromosomes 2 and 9 had the largest member distribution of 11 members. Expression analysis

showed that there were obvious differences in the expression of some members in different groups, HbACA31 was expressed the most in leaves, HbACA36 was expressed the most in latex, and the expression of HbACA36 was obviously

up-regulated in latex after treatment with ethenol. In addition, we also analyzed the influence of tapping on ACA/ECA

gene expression, and found that HbACA36 was at a high expression level during tapping of the two rubber tree varieties,

PR107 and Reyan 8-79, and significantly up-regulated during tapping of high-yield variety Reyan 8-79 ,which speculated that HbACA36 was involved in the regulation of rubber biosynthesis and played an important role. The results

presented in this study reveal the physicochemical properties and expression patterns of ACA/CA family members for

the first time in rubber tree, and would provide a foundation for further investigation of the biological functions of

ACA/ECA genes in H. brasiliensis, especially in the regulation of the rubber production.

Keywords: Hevea brasiliensis; Ca2+-ATPase (ACA/ECA); gene family; biological functiun; expression analysis

DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2023.11.013

鈣離子（Ca2+）作為植物細胞的第二信使幾

乎參與了植物生長發(fā)育的各個方面，包括對生物

和非生物脅迫的反應[1]。植物細胞內(nèi) Ca2+信號的

傳遞主要是通過改變細胞內(nèi)外鈣離子濃度實現(xiàn)

的，而 Ca2+濃度的變化則主要由膜上的跨膜轉運

蛋白進行控制[2]。植物細胞的 Ca2+轉運主要由鈣

離子通道、鈣離子反向轉運蛋白和鈣離子泵[3]，

Ca2+-ATPase 屬于 P-型 ATP 酶離子超家族的 P2

分支，根據(jù)其蛋白質(zhì)氨基酸序列和生化特征方面

的差異分為 2 個亞家族（P2A 和 P2B），也分別

稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)型 Ca2+-ATPase （ ER-type calcium

ATPase, ECA, P2A）和自抑制的質(zhì)膜（PM）型

Ca2+-ATPase（autoinhibited calcium ATPase, ACA,

P2B）[4]。在植物細胞中，定位于質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中

的 P 型 Ca2+-ATP 酶被認為在調(diào)節(jié)細胞質(zhì) Ca2+濃度

方面起重要作用[5]，同時 P 型 Ca2+-ATP 酶在植物

生長發(fā)育的各個方面都是不可或缺的，包括花粉

管生長、細胞程序性死亡、根部尖端生長，以及

生物和非生物脅迫應答（如低溫、高溫、鹽脅迫、

干旱和滲透脅迫等）、共生等方面[3]。目前已經(jīng)在

擬南芥[6]、水稻[7]、白菜[8]、茄科植物[9]、苜蓿[10]

等植物中鑒定得到 ACA/ECA基因家族多個成員，

并對其在植物中的功能進行了研究。研究表明，

在擬南芥中，ACA8 基因功能的缺失能顯著提高擬

南芥對零下低溫的抗凍性[11]；在低鈣環(huán)境下，

ECA1 表達受到干擾的轉基因株系耐受低 Ca2+

（0.2 mmol/L）或高 Mn2+（0.5 mmol/L）脅迫的

能力降低[12]。水稻 ACA/ECA 家族由 15 個成員組

成，其中有 3 個屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜型鈣離子泵，12 個

屬于自抑制型鈣離子泵，鹽、干旱和 ABA 脅迫可

以顯著激活 OsACA6 的表達，但熱脅迫激活作用

相對較弱[13]。ACA/ECA 家族在大白菜不同組織

中表達模式不同，5 個成員編碼蛋白定位于細胞

膜上，其中 Bra002762、Bra035649、Bra031701

與低溫和鹽脅迫響應有關，而 Bra003276 和

Bra024117 與自交不親和性相關[5]，大白菜缺少

ECA 基因會導致新葉生長緩慢，葉片枯萎黃化[14]。

在茄科植物中，低溫和鹽脅迫處理后，SLyECA1

基因表達豐度較高，且處理前后表達趨勢變化明

顯，說明 SLyACA1 基因可能是提高植株抗性的關

鍵基因[9]。野生大豆 Ca2+ATPase 基因 GsACA1 在

苜蓿中超量表達，能夠顯著提高轉基因苜蓿的耐

鹽堿性[10]。以上研究表明，ACA/ECA 基因家族

成員在多種植物中均發(fā)揮了重要作用。

巴西橡膠樹是大戟科橡膠樹屬喬木，其產(chǎn)生

的膠乳是天然橡膠生成的主要原料。天然橡膠

（natural rubber）是一種以聚異戊二烯為主要成

分的天然高分子化合物，與合成橡膠相比天然橡

膠性能更加優(yōu)良，在很多方面具有不可替代性，

可用于生產(chǎn)飛機輪胎、手套等數(shù)萬種橡膠制品，在

軍事、醫(yī)療、運輸?shù)刃袠I(yè)起著非常重要的作用[15]，

中國是目前為止世界上最大的天然橡膠消費國，

2246 熱帶作物學報 第 44 卷

年消費量占全世界總消費量的 40%以上，但自給

率不足為 15%[16]。理論預測，以及生產(chǎn)上出現(xiàn)的

高產(chǎn)橡膠樹單株都顯示出巴西橡膠樹還具有巨大

的產(chǎn)膠潛能[17-18]。目前已知的 2500 余種產(chǎn)膠植物

中橡膠樹表現(xiàn)出優(yōu)異的產(chǎn)膠能力，推測與橡膠樹

中高豐度表達的橡膠延伸因子/小橡膠粒子蛋白

（REF/SRPP）基因家族發(fā)生擴增有關[19]。已有研

究表明，REF/SRPP 基因[20]、HbNN2 基因[21]、蔗

糖轉運蛋白 HbSUT3[22]對橡膠樹產(chǎn)膠具有重要作

用。生產(chǎn)上，割膠和乙烯刺激都能顯著提高膠乳

產(chǎn)量，表明激素和傷害信號的傳遞與橡膠生物合

成關系密切。鈣離子是植物細胞內(nèi)重要的信號傳

遞因子，在植物應對生物和非生物脅迫方面具有

重要功能，而目前關于鈣離子泵 ACA/ECA 家族

在橡膠樹中的研究卻未見報道。本研究以已發(fā)表

植物 ACA/ECA 蛋白序列為探針從橡膠樹轉錄組

和基因組中鑒定出橡膠樹 ACA/ECA 家族的全體

成員，并從理化性質(zhì)、系統(tǒng)進化和表達模式等方

面進行了全面系統(tǒng)的分析。研究結果將為進一步

研究 ACA/ECA 基因在橡膠樹乳管鈣離子信號的

傳遞，以及橡膠樹生長發(fā)育和逆境脅迫應答等方

面的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料均來自于海南省儋州市中國熱帶農(nóng)

業(yè)科學院試驗基地。用于表達分析的不同組織材

料（葉片、樹皮、膠乳、種子、雄花、雌花等 6

種組織）均來自于正常開割 2 年的熱研 7-33-97

橡膠樹。由于生產(chǎn)上開割樹多為嫁接苗，根部并

非熱研 7-33-97 品種，因而本研究選用熱研

7-33-97 組培苗的根作為根材料。為了分析乙烯刺

激對基因表達的影響，對正常開割 2 年的熱研

7-33-97 橡膠樹（未涂抹過乙烯利，割膠頻率為 3 d

1 刀）進行乙烯利刺激試驗，提前 0、3、12、24 h

將 1.5%的乙烯利涂抹在橡膠樹割面，然后在同

一時間點采集膠乳樣品。為了進一步研究割膠對

ACA/ECA 基因表達的影響，選取相鄰 2 個林段，

PR107 品系和熱研 8-79 的未開割橡膠樹，同時

進行 3 d 1 刀割膠，分別在第 1、3、5、7、9 刀

采集膠乳樣品。利用試劑盒提取以上樣品的

RNA，送往北京百邁克公司進行二代 illumina 轉

錄組測序。

1.2 方法

1.2.1 橡膠樹 ACA/ECA 家族成員鑒定及理化性

質(zhì)分析 根據(jù)文獻[6]的方法，從 NCBI（https://

www.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫中下載模式植物擬

南芥的 ACA/ECA 蛋白序列，以擬南芥蛋白序列

作為探針，通過本地服務器進行 blastp 比對（參

數(shù) e 值為 1e-4），得到候選橡膠樹 ACA/ECA 家

族成員。利用在線軟件 CD-Search（https://www.

ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi ） 對

候選 ACA/ECA 家族成員所包含的結構域進行進

一步鑒定分析，得到橡膠樹 ACA/ ECA 家族成員。

利用在線軟件 Expasy （ https://web.expasy.org/

protparam/）和 Plant-mPLoc（http://www.csbio.sjtu.

edu.cn/bioinf/plant-multi/）對橡膠樹 ACA/ECA 基

因家族成員的氨基酸分子量、蛋白長度、理論等

電點以及亞細胞定位進行分析。

1.2.2 構建系統(tǒng)進化樹以及基因結構圖 在

NCBI 網(wǎng)站通過 blastp 比對檢索并下載水稻、楊樹

和木薯的 ACA/ECA 蛋白序列，使用多序列比對

軟件在線 mafft （ https://mafft.cbrc.jp/alignment/

software/）對擬南芥、水稻、楊樹、橡膠樹和木

薯 5 種植物的蛋白序列進行比對，使用 MEGA

6.0[23]軟件采用鄰接法構建系統(tǒng)進化樹，參數(shù)

bootstrap 設置為 1000，利用在線軟件 Figtree

（http:// tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/）對進化

樹進行調(diào)整；利用基因組序列和基因組注釋 GFF3

文件對橡膠樹 ACA/ECA 基因家族進行基因結構

分析，通過 GSDS（http://gsds.gao-lab.org/）[24]

在線軟件結合系統(tǒng)進化樹繪制出橡膠樹 ACA/ECA

基因結構圖。

1.2.3 橡膠樹 ACA/ECA 家族成員染色體定位分

析 利用 Tbtools[25]軟件，根據(jù)橡膠樹 GFF3 文

件相關信息繪制出橡膠樹 ACA/ECA 基因家族的

染色體定位圖；利用 MCscanX 軟件對橡膠樹基

因組進行共線性分析，繪制染色體之間的共線性

連線[26]。

1.2.4 橡膠樹 ACA/ECA 家族成員表達模式分析

利用本實驗室轉錄組數(shù)據(jù)，對 ACA/ECA 家族成

員在不同組織中、乙烯利處理不同時間點以及割

膠處理條件下的表達進行分析[27]。將測序得到的

轉錄組數(shù)據(jù)上傳到本地服務器，利用 RSEM[28]軟

件包進行表達分析得到每個基因的 FPKM 值，利

用 Tbtools 軟件中的 HeatMap 小程序繪制熱圖。

第 11 期 楊晶晶等：巴西橡膠樹 ACA/ECA 基因家族鑒定及分析 2247

2 結果與分析

2.1 橡膠樹 ACA/ECA 家族成員鑒定及理化性

質(zhì)分析

利用已發(fā)表模式植物擬南芥的 ACA/ECA 蛋白

序列[6]，通過 BLAST 比對篩選橡膠樹 ACA/ ECA

基因家族候選成員，并利用在線軟件 CD-Search 對

候選成員的蛋白結構域進行進一步鑒定，最終鑒定

得到 45 個 ACA/ECA 基因家族成員，其中包含 38

個 ACA 和 7 個 ECA 亞家族成員，分別命名為

HbACA1~HbACA38 和 HbECA1~HbECA7。橡膠樹

ACA/ECA 基因編碼的蛋白分子量在 10 048.04 Da

（HbACA26）~125 412.75 Da（HbACA36）之間，

理論等電點在 5.18（HbACA18）~9.21（HbACA26）

之間，45 個成員中 30 個成員等電點均小于 7，說明

大多屬于酸性蛋白。亞細胞定位結果顯示，橡膠樹

ACA/ECA 基因家族成員大多定位于細胞膜（表 1）。

表 1 橡膠樹 ACA/ECA 基因家族成員信息

Tab. 1 ACA/ECA gene family members of H. brasiliensis

基因名稱

Gene name

基因 ID

Gene ID

染色體

Chromosome

位置

Localization

基因大小

Gene

length/bp

蛋白長度

Protein

length/aa

氨基酸分子量

Molecular

weight/Da

等電點

Isoelectric

point

亞細胞定位

Subcellular

localization

HbACA1 EVM0016302.1 LG07 120 75 368~12 087 029 11 662 818 89 587.47 5.72 葉綠體、液泡

HbACA2 EVM0012621.1 LG03 48 737 744~48 743 632 5889 1032 113 138.54 8.78 葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡

HbACA3 EVM0000857.2 LG12 6 216 555~62 23 381 6827 1020 111 182.75 8.82 葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡

HbACA4 EVM0011980.1 LG06 78 963 020~78 970 776 7757 1015 112 073.73 6.92 葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡

HbACA5 EVM0039732.1 LG16 87 565 443~87 571 971 6529 1015 118 852.42 6.49 葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡

HbACA6 EVM0010645.1 LG16 87 574 251~87 591 324 17 074 943 108 545.60 6.43 葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

HbACA7 EVM0003754.1 LG07 102 697 785~102 701 228 3444 1027 118 823.48 6.37 細胞膜

HbACA8 EVM0006762.1 LG02 3 117 085~3 120 040 2956 728 117 316.59 6.75 細胞膜

HbACA9 EVM0005296.1 LG02 3 265 205~3 267 018 1814 558 23 582.69 9.14 細胞膜

HbACA10 EVM0026077.1 LG02 3 125 359~3 127 310 1952 625 115 834.52 5.94 細胞膜

HbACA11 EVM0031132.1 LG02 3 233 955~3 236 682 2728 883 110 578.33 5.83 細胞膜

HbACA12 EVM0024428.1 LG02 3 243 686~3 246 736 3051 1016 111 393.79 8.36 細胞膜

HbACA13 EVM0015252.1 LG02 3 262 343~3 263 065 723 178 111 989.14 7.98 細胞膜

HbACA14 EVM0024534.1 LG09 66 096 509~66 100 083 3575 750 110 309.03 5.92 細胞膜

HbACA15 EVM0029641.1 LG09 66 317 572~66 321 445 3874 720 103 884.94 5.74 細胞膜

HbACA16 EVM0017927.1 LG08 4 391 059~4 394 100 3042 1013 121 009.41 5.34 細胞膜

HbACA17 EVM0032610.1 LG11 12 512 452~12 513 504 1053 209 113 546.69 8.23 細胞膜

HbACA18 EVM0030427.1 LG09 66 076 346~66 079 704 3359 733 116 818.40 5.18 細胞膜

HbACA19 EVM0003826.1 LG09 66 279 877~66 304 362 24 486 1142 80 664.67 7.21 細胞膜

HbACA20 EVM0027429.1 LG09 66 104 652~66 105 203 552 183 68 724.97 6.08 細胞膜

HbACA21 EVM0015004.1 LG09 66 325 873~66 326 422 550 137 97 047.61 8.07 葉綠體、細胞核

HbACA22 EVM0014853.1 LG09 66 353 279~66 353 827 549 182 112 055.29 8.31 細胞膜、細胞核

HbACA23 EVM0033987.1 LG09 66 354 136~66 354 761 626 151 20 006.51 5.45 細胞膜

HbACA24 EVM0021882.1 LG09 66 116 797~66 120 161 3365 465 61 593.16 6.18 細胞膜

HbACA25 EVM0003506.1 LG08 4 375 525~4 379 761 4237 1004 118 968.46 6.44 細胞膜

HbACA26 EVM0010956.1 LG05 96 367 224~96 370 397 3174 1057 10 048.04 9.21 細胞膜

HbACA27 EVM0037889.1 LG16 10 542 615~10 545 666 3052 1006 104 419.52 6.83 細胞膜

HbACA28 EVM0032692.1 LG16 10 696 931~10 700 001 3071 1011 116 861.51 8.48 細胞膜

HbACA29 EVM0016389.1 LG09 62 325 967~62 328 900 2934 977 117 740.50 5.24 細胞膜

HbACA30 EVM0028891.1 LG09 62 389 407~62 392 328 2922 973 107 702.42 5.35 細胞膜

HbACA31 EVM0000930.1 LG08 38 103 650~38 144 781 41 132 1082 107 266.05 5.40 細胞膜

HbACA32 EVM0008651.1 LG02 8 008 368~8 075 531 67 164 1058 80 305.37 8.37 細胞膜

HbACA33 EVM0021769.1 LG02 7 964 947~8 005 806 40 860 956 82 737.19 6.63 細胞膜

2248 熱帶作物學報 第 44 卷

續(xù)表 1 橡膠樹 ACA/ECA 基因家族成員信息

Tab. 1 ACA/ECA gene family members of H. brasiliensis (comtinued)

基因名稱

Gene name

基因 ID

Gene ID

染色體

Chromosome

位置

Localization

基因大小

Gene

length/bp

蛋白長度

Protein

length/aa

氨基酸分子量

Molecular

weight/Da

等電點

Isoelectric

point

亞細胞定位

Subcellular

localization

HbACA34 EVM0034728.1 LG02 7 829 269~7 854 528 25 260 1082 20 379.37 8.93 細胞膜

HbACA35 EVM0001605.1 LG02 7 963 616~7 964 455 840 86 50 604.66 5.47 細胞核

HbACA36 EVM0027126.1 LG01 5 339 293~5 359 637 20 345 1070 125 412.75 6.14 細胞膜

HbACA37 EVM0017585.1 LG14 36 438 395~36 464 099 25 705 990 79 361.44 6.55 細胞膜

HbACA38 EVM0033009.1 LG14 36 607 045~36 633 937 26 893 1080 15 362.58 8.93 細胞膜

HbECA1 EVM0006681.1 LG12 6 495 924~6 517 245 21 322 1001 20 166.08 5.95 細胞膜

HbECA2 EVM0032367.1 LG10 74 562 648~74 567 522 4875 1050 16 172.53 8.73 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

HbECA3 EVM0035728.1 LG05 101 795 694~101 800 096 4403 1057 116 356.77 7.76 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

HbECA4 EVM0037175.1 LG03 3 585 354~3 589 740 4387 760 84 489.55 5.53 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

HbECA5 EVM0033174.1 LG02 19 860 280~19 864 338 4059 1070 111 941.08 5.94 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

HbECA6 EVM0001506.1 LG13 4 899 156~4 905 549 6394 1059 109 762.53 5.78 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

HbECA7 EVM0042041.1 Contig01284 39 845~46 637 6793 954 104 494.54 5.27 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

2.2 系統(tǒng)進化樹的構建及基因結構分析

為了比較擬南芥（Arabidopsis thaliana, At）、

木薯（Manihot esculenta, Me）、楊樹（Populus

trichocarpa, Pt）、水稻（Oryza sativa, Os）4 種植

物和橡膠樹（Hevea brasiliensis, Hb）ACA/ECA

蛋白在進化上的相互關系，利用 mafft 軟件對 5

種植物蛋白序列進行多序列比對，并用 MEGA 6.0

軟件構建系統(tǒng)進化樹，然后用 Figtree 軟件對進化

樹進行修飾。從進化樹可以看出（圖 1），ACA/ECA

基因家族成員分別聚于 ACA 和 ECA 兩個不同分

支，橡膠樹與木薯的 ACA/ECA 成員聚在一起，

這與系統(tǒng)進化上木薯與橡膠樹的親緣關系較近是

一致的；其中 HbACA13、HbACA12、HbACA11、

HbACA10、HbACA9、HbACA8 和 HbACA35 聚

集在同一個小分支，并且這 7 個成員均位于 LGO2

號染色體上，推測這 7 個成員是通過串聯(lián)復制進

化而來。

利用基因組 GFF3 注釋文件對橡膠樹

ACA/ECA 基因家族成員進行基因結構分析，并通

過 GSDS 軟件結合進化樹繪制內(nèi)含子-外顯子結

構圖（圖 2）。在橡膠樹 45 個 ACA/ECA 基因家

族成員中，35 個成員含有內(nèi)含子，包括 26 個 ACA

和 7 個 ECA 成員，橡膠樹 ACA/ECA 家族成員內(nèi)

含子數(shù)量在 0~33 之間，存在明顯差異。同一分支

上的成員在內(nèi)含子數(shù)目和位置方面相對一致，除

HbACA12、HbACA24、HbACA20、HbACA22、

ACA25、HbACA15 和 HbACA16 等 12 個成員無

內(nèi)含子外，其他成員均存在 1~33 個內(nèi)含子；部分

成員出現(xiàn)了較大數(shù)目的內(nèi)含子，如 HbACA31、

HbACA34、HbACA38 和 HbECA1 的內(nèi)含子數(shù)目

在 30~33 之間。

2.3 橡膠樹 ACA/ECA 基因家族成員染色體定

位分析

從 45 個 ACA/ECA 基因家族染色體定位圖可

看出（圖 3），45 個成員分布在 14 條染色體上，

LG02 和 LG09 號染色體上分布有最多的成員，均

為 11 個，LG16 染色體上有 4 個成員，LG08 染色

體分布有 3 個成員，LG07、LG03、LG12、LG05、

LG14 染色體上均有 2 個成員，LG06、LG01、

LG10、LG13、LG11 染色體上分布最少，均為 1

個成員，另外，contig 上也有 1 個成員。進一步

分析發(fā)現(xiàn)，LG02 和 LG09 號染色體上的成員大部

分成簇分布，LG08、LG12、LG14 和 LG16 四條

染色體上有成員成對分布，這些成員可能是通過

串聯(lián)重復復制而來，表明這些 ACA/ECA 家族成

員蛋白序列具有較高的相似性，可能具有類似的

生物學功能。藍色線連接表明成員之間具有共線

性，在進化過程中通過染色體加倍或大片段復制

形成。

2.4 橡膠樹 ACA/ECA 基因家族表達分析

利用本實驗室轉錄組數(shù)據(jù)對 45 個橡膠樹

ACA/ECA 基因家族成員在不同組織（膠乳、樹皮、

葉片、種子、根、雌花和雄花）、乙烯利和割膠

處理下的膠乳的表達情況進行分析并繪制熱圖。

從橡膠樹 ACA/ECA 基因家族成員在不同組織中

的表達可以看出（圖 4），HbACA1、HbACA3、

第 11 期 楊晶晶等：巴西橡膠樹 ACA/ECA 基因家族鑒定及分析 2249

圖 1 橡膠樹和其他 4 種植物的 ACA/ECA 蛋白系統(tǒng)進化樹

Fig. 1 ACA/ECA protein phylogenetic tree of H. brasiliensis and other four plants

HbACA36、HbECA1、HbECA6 和 HbECA7 功能較

為保守，在各組織中均有表達；HbACA2 在膠乳

中特異高表達，而在其他組織中低表達或不表達，

表現(xiàn)出組織特異性。另外，除 HbACA2 外，

HbACA36、HbACA38 和 HbECA7 四個成員在膠乳

中的表達豐度也比較高，其中 HbACA36 在膠乳表

達豐度最高；在葉片中，HbECA6、HbECA7、

HbACA1、HbACA31 和 HbACA36 表達豐度相對較

高，其中 HbACA31 表達豐度最高；在樹皮中，

HbECA6 、 HbECA7 、 HbACA1 、 HbACA31 、

HbACA36、HbACA26 和 HbACA3 表達豐度較高。

HbECA7 在葉片、樹皮和根等多種組織中都有相

對較高的表達，說明該成員可能在橡膠樹鈣離子

運輸方面具有重要功能。

乙烯利刺激是橡膠生產(chǎn)中常用的一種增產(chǎn)手

段，為了進一步研究橡膠樹 ACA/ECA 基因在乙

烯利刺激后膠乳中的表達，本課題組在乙烯利處

理后的 4 個不同時間點（0、3、12、24 h）對

ACA/ECA 基因家族成員在膠乳中的表達進行了

分析（圖 5）。經(jīng)乙烯利處理后 HbACA2、HbACA36、

HbACA38、HbECA7 四個成員表達呈上升趨勢，

其中 HbACA36 在乙烯利處理 24 h 后呈現(xiàn)高豐度

表達，并且在處理前后相對于其他成員都處于較

高表達水平，這和之前不同組織表達分析的結果

2250 熱帶作物學報 第 44 卷

綠色代表 UTR 區(qū)，黃色代表外顯子，外顯子之間的連線代表內(nèi)含子。

Green represents UTR region, yellow represents exons, and the lines between exons were introns.

圖 2 橡膠樹 ACA/ECA 家族基因結構圖

Fig. 2 Gene structure of ACA/ECA family in H. brasiliensis

圖 3 橡膠樹 ACA/ECA 家族成員在染色體上的定位和共線性

Fig. 3 Localization and collinearity of ACA/ECA family members on chromosomes of H. brasiliensis

第 11 期 楊晶晶等：巴西橡膠樹 ACA/ECA 基因家族鑒定及分析 2251

圖 4 橡膠樹 ACA/ECA 基因家族成員在 7 種組織中的表達分析

Fig. 4 Expression analysis of ACA/ECA family members in seven tissues of H. brasiliensis

一致。 HbACA3 在乙烯利處理后上調(diào)表達，

HbECA5 在膠乳中低表達或不表達但經(jīng)乙烯利刺

激 24 h 后上調(diào)表達。結合染色體定位圖來看，

HbACA36 和 HbACA38 有較高同源性，但在表達

上卻存在差異，HbACA36 表達豐度更高，并且乙

烯利刺激后表達變化也更明顯，推測 HbACA36

在乳管鈣離子運輸方面起主要作用。研究結果表

明，部分成員乙烯利刺激后在膠乳中的表達呈明

顯的上升趨勢，推測這些成員可能在乳管膠乳再

生方面發(fā)揮重要作用。

在橡膠生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，割膠能夠促進橡膠樹產(chǎn)

膠。為了進一步分析割膠對橡膠樹 ACA/ECA 基

因家族成員表達的影響，選用 2 種不同產(chǎn)量水平

的未開割橡膠樹品種進行割膠試驗，包括相對低

產(chǎn)的 PR107 和高產(chǎn)品種熱研 8-79；同時對 2 個品

種的已開割橡膠樹進行割膠試驗，通過轉錄組測

序對基因的表達進行分析。由圖 6 可以看出，在

割膠過程中 ACA/ECA 基因家族成員在 PR107 和

熱研 8-79 中的表達趨勢整體一致，如 HbECA6、

HbECA7、HbACA1、HbACA2、HbACA3、HbACA36、

HbACA37 和 HbACA38 在 2 個品種的割膠過程中

均有表達。其中 HbACA36 在 PR107 和熱研 8-79

割膠過程中均處于較高的表達水平，這與前面不

同組織以及乙烯利處理的試驗結果一致。但是

HbACA36 在熱研 8-79 割膠過程的表達表現(xiàn)出明

顯的上升趨勢（第 1、3、5、7、9 刀的 FPKM 值

分別為 206.19、221.96、281.45、353.36、355.59），

而 HbACA36 在 PR107 中的表達則表現(xiàn)出先下降

后上升再下降的表達趨勢（第 1、3、5、7、9 刀

的 FPKM值分別為 212.89、160.28、209.92、205.15、

2252 熱帶作物學報 第 44 卷

圖 5 橡膠樹 ACA/ECA 基因家族成員在乙烯處理后膠乳中的表達分析

Fig. 5 Expression analysis of ACA/ECA genes in rubber latex after ethylene treatmen

159.48），HbACA36 在熱研 8-79 中的整體表達水

平高于 PR107，這可能與熱研 8-79 的高產(chǎn)具有一

定的相關性。此外，HbACA18 和 HbACA19 經(jīng)割

膠處理后僅在熱研 8-79 中表達，再次說明橡膠樹

ACA/ECA 基因家族成員在 2 個品種中的表達存

在一定差異。

3 討論

Ca2+-ATPase（ACA/ECA）在植物逆境脅迫應

答和生長發(fā)育等方面起重要作用[28]，目前，在擬

南芥[6]、大白菜[8]、茄科植物[9]等多種植物中鑒定

得到 ACA/ECA 家族成員，并對部分家族成員的

功能進行了系統(tǒng)分析，而關于 ACA/ECA 基因在

橡膠樹中的功能的研究還未見報道。天然橡膠是

重要的戰(zhàn)略物質(zhì)，在工業(yè)和國防等方面發(fā)揮著重

要作用，橡膠樹作為生產(chǎn)天然橡膠的唯一來源，

其種植和生產(chǎn)一直備受關注[29]，隨著經(jīng)濟的發(fā)展，

天然橡膠的消耗也不斷增長，出現(xiàn)供不應求[30]，

因而提高橡膠產(chǎn)量顯得尤為重要，鈣離子信號在

乙烯刺激和割膠過程中的傳遞對增加膠乳產(chǎn)量促

第 11 期 楊晶晶等：巴西橡膠樹 ACA/ECA 基因家族鑒定及分析 2253

圖 6 橡膠樹 ACA/ECA 家族成員在 PR107 和熱研 8-79 兩種品系不同割膠刀數(shù)表達分析

Fig. 6 Expression analysis of H. brasiliensis ACA/ECA family members under different tapping

number in PR107 and Reyan 8-79 strains

使乳管膠乳再生至關重要，因此探明 ACA/ECA

基因家族在橡膠樹中的功能有重要研究意義。本

研究鑒定得到橡膠樹中 45 個 ACA/ECA 基因家族

成員，包括 38 個 ACA 成員，7 個 ECA 成員，其

中 ACA 成員明顯多于 ECA 成員，這與其他植物

的研究結果一致。從系統(tǒng)進化樹來看有 2 個明顯

分支，在 2 個分支中橡膠樹與木薯 ACA/ECA 聚

在一起，這與橡膠樹和木薯在系統(tǒng)進化上有較近

的親緣關系是一致的。從染色體定位圖看，有成

員成對或者成簇存在，其中 2 號和 9 號染色體上

的部分成員聚在一起，結合進化樹可以看出，相

對于楊樹和木薯等其他植物，橡膠樹 ACA/ECA

成員在部分分支上出現(xiàn)了擴張，并且擴張主要由

串聯(lián)復制產(chǎn)生的。在表達方面，部分 ACA/ECA

成員在不同組織中的表達表現(xiàn)出組織特異性，如：

HbACA2 在膠乳中表達豐度較高，HbACA12 在種

子中表達豐度較高，而在其他組織中表達豐度很

低或不表達；在膠乳中，HbACA2、HbACA36、

HbACA38 和 HbECA7 四個成員表達豐度相對較

高，其中 HbACA36 在膠乳中表達豐度最高，并且

2254 熱帶作物學報 第 44 卷

明顯高于其他 3 個成員，推測 HbACA36 在乳管鈣

離子轉運方面具有重要作用。乙烯利刺激和割膠

是橡膠樹生產(chǎn)中最主要的 2 種增產(chǎn)手段，乙烯利

處理后，HbACA36 在膠乳中表達呈現(xiàn)明顯的上升

趨勢，在高產(chǎn)品種熱研 8-79 割膠過程中 HbACA36

的表達也表現(xiàn)出明顯的上升趨勢，表明 HbACA36

在橡膠樹乳管中可能具有重要功能并且和橡膠樹

的產(chǎn)量具有一定的相關性。綜上表明，HbACA36

在橡膠樹乳管的信號傳遞方面起重要作用，進而

影響橡膠樹乳管中的橡膠生物合成。本研究相關

結果為進一步研究 ACA/ECA 基因的生物學功能，

及其在乙烯刺激橡膠樹增產(chǎn)過程中的重要作用奠

定了基礎。

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熱帶作物學報 2023, 44(11): 2256?2264

Chinese Journal of Tropical Crops

收稿日期 2022-09-30；修回日期 2022-11-04

基金項目 國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系崗位項目“廣西芒果創(chuàng)新團隊栽培與病蟲害防治”（No. nycytxgxcxtd-2021-06-2）；科技先

鋒隊‘強農(nóng)富農(nóng)’‘六個一’專項行動（No. 202204）；廣西創(chuàng)新驅動發(fā)展專項（桂科 AA22068098-2）。

作者簡介 黃 星（1996—），女，碩士研究生，研究方向：果樹遺傳育種與生物技術。*通信作者（Corresponding author）：何

新華（HE Xinhua），E-mail：honest66222@163.com；羅 聰（LUO Cong），E-mail：22003luocong@163.com。

芒果 MiNAC7 基因的表達模式及在開花和非生物逆境脅迫

應答中的功能分析

黃 星，徐歡歡，黎開獎，何新華*

，夏黎明，陸婷婷，梁容真，羅 聰*

廣西大學農(nóng)學院/亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室/廣西農(nóng)業(yè)環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品安全重點實驗室，廣西南寧

530004

摘 要：NAC 轉錄因子是植物中一個大的基因家族，在調(diào)控植物生長發(fā)育、信號傳導、逆境脅迫響應等方面起重要作

用。前期研究中，從芒果成花基因酵母文庫篩選中分離獲得 1 個 NAC 基因，命名為 MiNAC7，本研究對該基因的生物

信息學、表達模式和基因功能進行分析。生物信息學分析表明：MiNAC7 基因位于 10 號染色體上，有 4 個內(nèi)含子，5

個外顯子；MiNAC7 基因編碼區(qū)長度為 1137 bp，編碼 379 個氨基酸，理論等電點為 4.88，蛋白質(zhì)分子量為 93.41 kDa，

氨基酸序列中含有 1 個 NAM 保守結構域。系統(tǒng)進化樹分析表明，芒果 MiNAC7 與阿月渾子 PvNAC26 親緣關系最接近，

同源性最高，氨基酸序列相似性為 69.64%。啟動子序列分析顯示，MiNAC7 基因的啟動子區(qū)域包含光響應元件、赤霉

素響應元件以及生長素響應元件等。表達分析顯示，MiNAC7 基因在童期組織的莖與芽中表達水平較高，在葉中表達

很低，在成年期組織的莖中表達水平較高，在花和葉中表達很低。同時發(fā)現(xiàn) MiNAC7 基因在營養(yǎng)生長期的葉片中表達

水平較高，在成花轉變期和花發(fā)育期的葉片中表達水平很低。超量表達的 MiNAC7 基因誘導轉基因擬南芥出現(xiàn)晚花表

型，在超量表達 MiNAC7 基因的擬南芥中顯著降低了促花基因 AtFT 和 AtAP1 的表達水平，而 AtFLC 晚花基因的表達

水平顯著提高。逆境脅迫處理顯示，超量表達 MiNAC7 基因的擬南芥提高了對干旱和鹽的抗性，提高了對 GA3 的抗性，

但對 ABA 更敏感。本研究表明，芒果 MiNAC7 基因不僅影響成花也參與對非生物脅迫的應答，為深入研究 MiNAC7

基因參與調(diào)控芒果開花和逆境脅迫應答的基因調(diào)控網(wǎng)絡奠定基礎。

關鍵詞：芒果；MiNAC7；生物信息學分析；表達模式；功能研究

中圖分類號：S667.7 文獻標識碼：A

Expression and Function Analysis of a MiNAC7 Gene in Response to

Flowering and Abiotic Stress in Mango

HUANG Xing, XU Huanhuan, LI Kaijiang, HE Xinhua*

, XIA Liming, LU Tingting, LIANG Rongzhen,

LUO Cong*

College of Agriculture, Guangxi University / State Key Laboratory for Protection and Utilization of Subtropical Agricultural Biological Resources / Guangxi Key Laboratory for Agro-Environment and Agro-Product Safety, Nanning, Guangxi 530004, China

Abstract: NAC transcription factors are a large gene family in plants which play important roles in regulating plant

growth and development, signal transduction, stress response, etc. In the previous study, the NAC gene, named MiNAC7,

was isolated by the yeast two-hybrid system. In this study, the bioinformatics, expression patterns and gene functions of

genes were studied. Bioinformatics analysis showed that the MiNAC7 gene was located on chromosome 10, with 4 introns and 5 exons. The length of the coding region of the MiNAC7 gene was 1137 bp, encoding 379 amino acids, the

theoretical isoelectric point was 4.88, the molecular weight of the protein was 93.41 kDa, and the amino acid sequence

第 11 期 黃 星等：芒果 MiNAC7 基因的表達模式及在開花和非生物逆境脅迫應答中的功能分析 2257

contained a conserved NAM domain. Phylogenetic tree analysis showed that mango MiNAC7 and pistachio PvNAC26

had the closest genetic relationship and the highest homology, and the amino acid sequence similarity was 69.64%.

Promoter sequence analysis showed that the promoter region of the MiNAC7 gene contained light response elements,

gibberellin response elements and auxin response elements. Expression analysis showed that the expression level of the

MiNAC7 gene was high in the stems and buds of juvenile tissues, low in flowers, high in the stems of adult tissues, and

low in flowers and leaves. At the same time, it was found that the MiNAC7 gene maintained a high expression level in

the leaves at the vegetative growth stage and a low expression level in the leaves at the flowering transformation stage

and flower development stage. Overexpression of the MiNAC7 gene led to a late-flowering phenotype in transgenic

Arabidopsis. The overexpression of the MiNAC7 gene in Arabidopsis significantly reduced the expression level of the

floral-promoting genes AtFT and AtAP1, while the expression level of the late-flowering gene AtFLC was significantly

increased. Stress treatment showed that Arabidopsis with excessive expression of the MiNAC7 gene improved its resistance to drought and salt and improved its resistance to GA3 but was more sensitive to ABA. This study shows that the

mango MiNAC7 gene not only affects flowering but also participates in the response to abiotic stress, which would lay a

foundation for further research on the gene regulatory network of the MiNAC7 gene involved in regulating mango flowering and stress response.

Keywords: mango; MiNAC7; bioinformatics analysis; expression pattern; functional research

DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2023.11.014

NAC（NAM、ATAF1/2 和 CUC2）基因家族

是最大的植物特有轉錄因子家族之一，基因成員

數(shù)量龐大[1]。隨著全基因組測序技術日趨完善，

目前已發(fā)現(xiàn)絕大部分物種均存在 100 個以上的

NAC 基因數(shù)量[2]。NAC 基因在影響植物生長[3]、

調(diào)控植株成花[4]、果實成熟[5-6]、葉片衰老[7]和應

對非生物脅迫[8-10]等生理過程中發(fā)揮了重要作用。

NAC 基因家族參與多種激素調(diào)控途徑和非生

物脅迫應答過程。NAC 基因參與調(diào)節(jié) ABA 信號

傳導途徑，如：擬南芥 AtNAC016 可以結合 ABA

依賴性脅迫信號通路中的關鍵轉錄因子脫落酸響

應元件結合蛋白 1 基因（AREB1）的啟動子，通

過抑制AREB1的轉錄來促進對干旱脅迫的反應[11]；

過表達水稻 ONAC022 對外源 ABA 的敏感性增

強，與 ABA 有關的調(diào)控基因表達上調(diào)，即水稻

ONAC022 通過調(diào)節(jié) ABA 信號傳導途徑來提高抗

旱和耐鹽脅迫能力[12]；陸地棉 GhirNAC2 直接與

GhNCED3a/3c 的啟動子結合，通過調(diào)節(jié) GhNCED3a/3c 表達來調(diào)節(jié) ABA 生物合成和氣孔關閉，增

強了轉基因植物的抗旱性[13]。NAC 基因參與調(diào)節(jié)

GA信號傳導途徑，如甘蔗ScNAC23直接與DELLA

蛋白 ScGAI 相互作用調(diào)節(jié) GA 信號傳導途徑來促

進甘蔗開花和葉片衰老[14]。NAC 基因還參與調(diào)節(jié)

生長素和細胞分裂素等途徑，如水稻 OsNAC2 基

因可以直接結合 IAA 和細胞分裂素（cytokinin,

CK）相關基因的啟動子來調(diào)節(jié)根發(fā)育過程中的細

胞分裂[15]。另外，甘蔗 OsNAC14 可以直接與 DNA

修復系統(tǒng)中同源重組的關鍵成分OsRAD51A1啟動

子之間相互作用，招募參與 DNA 損傷修復和防御

反應的因子來提高耐旱性[8]；梭梭 HaNAC1 直接

與 AtNAC32 蛋白相互作用來增強抗旱性[16]。

芒果（Mangifera indica L.）是重要的熱帶水

果，適時開花有利于芒果生產(chǎn)[17]。前期研究中，

課題組從芒果成花基因 LEAFY 的酵母文庫篩選

獲得 1 個 NAC7 基因，而 NAC 轉錄因子參與了植

物的逆境脅迫應答[18]。目前尚不清楚芒果 MiNAC7

基因是否參與了芒果的成花與逆境脅迫應答。因

此，本研究對 MiNAC7 的生物信息學、表達模式

和基因功能進行分析，明確 MiNAC7 基因在芒果

開花和非生物脅迫中的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用芒果品種為四季蜜芒（Mangifera

indica L. cv. SiJiMi），該芒果品種生長于廣西大學

農(nóng)學院標本園中。用于時間表達分析的樣本主要

為成年期的葉片，采集時間為 2021 年 9 月至 2022

年 5 月，每月 1 日下午 5 點采集 1 次。時間表達

主要分為 5 個生長階段，即營養(yǎng)生長期、成花誘

導期、花芽分化期、花序伸長和開花期、果實發(fā)

育初期。用于組織表達分析的樣本主要為童期的

葉、莖、芽，采集時間為 2022 年 2 月 15 日；成

年期的葉、莖、花以及幼胚和成熟胚，采集時間

為 2021 年 11 月 16 日。所有樣品采集后立即用液

氮冷凍并保存在?80 ℃冰箱中。本研究中使用的

擬南芥為哥倫比亞型擬南芥。

2258 熱帶作物學報 第 44 卷

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析 利用 TBtools 軟件和

cDNA 以及 DNA 文件繪制 MiNAC7 的 DNA 序列結

構圖[19]；通過 NCBI/blastp 數(shù)據(jù)庫對芒果 MiNAC7

編碼的氨基酸序列進行同源查找并預測其保守結

構域，利用 DNAMAN 軟件對不同物種的 NAC 蛋

白進行氨基酸序列比對；利用 MEGA 7.0 軟件構

建 NAC 蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹[20]；利用 NewPlace 數(shù)

據(jù)庫對 MiNAC7 基因前 2000 bp 的啟動子區(qū)進行

分析并通過 TBtools 軟件繪制順式元件的分布。

1.2.2 MiNAC7的表達分析 芒果樣品 RNA采用

美基公司的難提植物總 RNA 小提試劑盒提取，擬

南芥樣品 RNA 采用植物 RNA 小量提取試劑盒提

取。利用 M-MLV 逆轉錄酶按照說明書將 RNA 逆

轉錄為 cDNA，用于后續(xù)實驗。利用在線軟件 Primer

3.0 Plus 設計特異引物（MiNAC7u: 5?-CTGCAG

ACATAAACGGTGGA-3?, MiNAC7d: 5?-TGGGTTGACAAGATCCAACA-3?），以芒果 MiActin1 為內(nèi)參

基因[21]（qMiACTu: 5?-CCGAGACATGAAGGAGAAGC-3?, qMiACTd: 5?-GTGGTCTCATGGATACCAGCA-3?）。采用 TaKaRa公司的SYBR Green和SYBR

Premix Ex Taq II 試劑，使用 Applied Biosystems 7500

實時定量 PCR 儀對 MiNAC7 基因的表達進行 RTqPCR 檢測，使用 2–ΔΔCT方法對熒光定量的結果進

行分析[22]。

1.2.3 擬南芥的轉化 將 MiNAC7 的完整 cDNA

序列（CDS）插入到 pBI121 載體中，將陽性重組

質(zhì)粒 pBI121-MiNAC7 按照說明書的方法導入農(nóng)

桿菌 EHA105 中，隨后用花序侵染法對野生型擬南

芥進行轉化[23]。收獲侵染后的種子，將其播種于含

有 50 mg/L 卡納的 1/2MS 培養(yǎng)基中進行陽性苗篩

選，利用余海霞等[24]改良的 CTAB 法提取陽性擬南

芥的 DNA，用 MiNAC7 的特異引物對陽性轉基因

擬南芥進行 PCR 檢測與驗證。對序列檢測正確的陽

性擬南芥進行培育繁殖，直至獲得純合株系。

1.2.4 轉基因擬南芥的表型分析 將擬南芥置于

長日照（16 h 光照/8 h 黑暗）和 21 ℃的條件下培

養(yǎng)，以野生型擬南芥（WT）和轉空載擬南芥

（pBI1121）為對照，觀察轉基因擬南芥的表型，

統(tǒng)計植株第一朵花開放的時間。以 T3 代純合轉基

因擬南芥的 cDNA 為模板，擬南芥基因 AtACTIN2

為內(nèi)參基因（AtActin2u: 5?-TCAGATGCCCAGAAGTCTTGTTCC-3?, AtActin2d: 5?-CCGTACAGATCCTTCCTGATATCC-3?），通過半定量法[25]

檢測芒果 MiNAC7 基因在轉基因擬南芥中的表達

水平。通過 qRT-PCR 法檢測開花相關基因在轉基

因擬南芥中的表達水平（AtFTu: 5?-CTTGGCAGGCAAACAGTGTATGCAC-3?, AtFTd: 5?-GCCACTCTCCCTCTGACAATTGTAGA-3?; AtAP1u: 5?CACCAAATCCAGCATCCTTAC-3?, AtAP1d: 5?GTTCGAGATCATTCCTCCTCA-3?; AtFLCu: 5?ACTTGTGGATAGCAAGCTTGTGG-3?, AtFLCd:

5?-CATGAGTTCGGTCTTCTTGGCTC-3?）。

1.2.5 轉基因擬南芥的非生物逆境脅迫處理 將

T4 代轉基因擬南芥幼苗置于長日照培養(yǎng)箱經(jīng)過 3 d

培養(yǎng)后轉入逆境培養(yǎng)基中，豎直放置并繼續(xù)培養(yǎng) 5 d

后，拍照并記錄野生型和轉基因擬南芥的根長表型

和鮮重。逆境脅迫處理所用的試劑及濃度設計如

下：鹽脅迫使用濃度為 0、100、125 mmol/L 氯化

鈉（NaCl）；干旱脅迫使用的甘露醇（mannitol）濃

度為 0、300、400 mmol/L；ABA 濃度為 0、5 μmol/L，

GA3 濃度為 0、5、10 μmol/L。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究所有數(shù)據(jù)（如表達分析、表型分析和

非生物脅迫逆境分析數(shù)據(jù)等）均使用 Excel 軟件進

行統(tǒng)計處理，采用 IBM SPSS 25.0 軟件進行單因素

方差分析和 Duncan 多重范圍檢驗，利用 GraphPad

Prism 9 繪制條形圖，P<0.05 表示差異顯著，有統(tǒng)

計學意義。

2 結果與分析

2.1 MiNAC7 生物信息學分析

MiNAC7 基因 DNA 全長為 3631 bp，編碼區(qū)長

度為 1137 bp，編碼 379 個氨基酸，等電點為 4.88，

蛋白質(zhì)分子量為 93.41 kDa。MiNAC7 有 4 個內(nèi)含

子，5 個外顯子（圖 1A）。利用 MEGA 7.0 軟件構

建了 NAC 蛋白的系統(tǒng)進化樹（圖 1B），芒果

MiNAC7 與阿月渾子 PvNAC26 最接近，同源性

最高，氨基酸相似性為 69.64%，且 MiNAC7 與

PvNAC26、CcNAC29、CcNAC100、CsNAC29、

LcNAC39 同源性較高。故對這 6 個物種的 NAC

氨基酸序列進行比對，其保守結構域如圖 1C 所

示，6 種蛋白的 N 端表現(xiàn)出高度的相似性，氨基

酸序列中含有 1 個 NAM 保守結構域，是 NAC 基

因家族的典型結構域，C 端表示出明顯的差異。

對 MiNAC7 基因的起始密碼子前 2000 bp 的啟動子

區(qū)域進行順式元件分析（圖 1D），MiNAC7 基因啟

動子主要包含 6 種不同類型的順式調(diào)控元件，即

第 11 期 黃 星等：芒果 MiNAC7 基因的表達模式及在開花和非生物逆境脅迫應答中的功能分析 2259

A：MiNAC7 的 DNA 序列結構，方塊表示外顯子，橫線表示內(nèi)含子；B：MiNAC7 的系統(tǒng)進化樹；

C：MiNAC7 的氨基酸序列比對；D：MiNAC7 的啟動子順式作用元件可視化圖。

A: Gene structure analysis of MiNAC7, squares represent exons and horizontal lines represent introns; B: Phylogenetic analysis of MiNAC7;

C: Sequences analysis of MiNAC7; D: Cis-elements within MiNAC7 gene promoters analysis of MiNAC7.

圖 1 MiNAC7 基因生物信息學分析

Fig. 1 Bioinformatics analysis of MiNAC7 gene

光響應元件（light response element）、ICE 轉錄因

子結合位點、MYB 轉錄因子結合位點、赤霉素響

應元件（gibberellin response）、茉莉酸響應元件

（jasmonic acid response element）以及生長素響

應元件（auxin response element）等。

2.2 MiNAC7 基因的表達模式分析

為探究 MiNAC7 基因在四季蜜芒不同組織的

表達特性，采集童期和成年期的不同組織進行表

達模式分析。如圖 2A 所示，MiNAC7 基因在各

個組織中均表達，但表達存在差異，MiNAC7 在

童期組織的莖中表達最高，其次是在芽中，在葉

中表達很低，在成年期的莖中表達水平較高，在

花和葉中表達很低；表明 MiNAC7 基因在莖中優(yōu)

勢表達。為了探究 MiNAC7 基因在四季蜜芒中不

同生長發(fā)育時期的表達特性，利用 qRT-PCR 對

不同時期的表達模式進行分析。如圖 2B 所示，

MiNAC7 基因在不同時期的葉片中均存在不同程

度的表達，其中在營養(yǎng)生長期的葉片中維持較高

的表達水平，在成花轉變期和花發(fā)育期的葉片中

表達水平很低，說明 MiNAC7 基因與植物生長發(fā)

2260 熱帶作物學報 第 44 卷

A：MiNAC7 基因在不同組織中的表達；B：MiNAC7 基因在不同時期的表達。不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

A: Relative expression of MiNAC7 in different tissues; B: Relative expression of MiNAC7 at different stages.

Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).

圖 2 MiNAC7 基因的表達模式分析

Fig. 2 Expression analysis of MiNAC7 gene in mango

育有關。

2.3 MiNAC7 轉基因擬南芥對開花的影響

將構建好的載體采用花序侵染法轉化野生型

擬南芥植株后，篩選陽性株系并繁育至 T3 代純合

植株。通過半定量 PCR 技術檢測 MiNAC7 在轉基

因擬南芥中的表達情況，結果如圖 3A1 所示，

MiNAC7 在這 3 個轉基因株系（OE-2、OE-3、OE-6）

中均可以正常表達，而在野生型（WT）和轉

pBI121 空載擬南芥中不表達。以野生型擬南芥

（WT）和轉空載 pBI121 擬南芥為對照，觀察

MiNAC7 轉基因擬南芥的開花時間。結果如圖 3A

所示，MiNAC7 轉基因擬南芥顯著延遲開花，開

花時間比對照植株晚約 4 d（圖 3B）。轉基因擬

南芥開花內(nèi)源基因表達水平檢測顯示，MiNAC7

轉基因擬南芥中促花基因 AtFT 和 AtAP1 的表達

水平被顯著下調(diào)，而抑制成花基因 AtFLC 的表達

水平被顯著上調(diào)（圖 3C）。

2.4 MiNAC7 轉基因擬南芥對逆境脅迫應答的

影響

為了解 MiNAC7 在非生物逆境脅迫中的功

能，對野生型擬南芥和 3 個超量表達株系進行鹽

脅迫處理（0、100、125 mmol/L NaCl）、干旱脅

迫處理（0、300、400 mmol/L 甘露醇）和激素處

理（0、5 μmol/L ABA，0、5、10 μmol/L GA3），

結果見圖 4。在對照組中，野生型與 MiNAC7 轉

基因擬南芥在根長和鮮重上差異不顯著，實驗組

的野生型與 MiNAC7 轉基因擬南芥在根長和鮮重

上差異顯著。鹽脅迫處理使擬南芥根長生長受到

抑制，但 MiNAC7 轉基因擬南芥的根長受到的抑

制顯著小于野生型擬南芥。干旱脅迫抑制了擬南

芥根長生長，鮮重重量降低，但 MiNAC7 轉基因

擬南芥的根長受到的抑制比野生型擬南芥輕，鮮

重比野生型擬南芥重。GA3 激素處理使擬南芥根

長和鮮重均受到不同程度的影響，5 μmol/L GA3

激素處理促進了 MiNAC7 轉基因擬南芥的根長生

長，鮮重升高，但對野生型擬南芥的根長生長無

顯著差異；10 μmol/L GA3 激素處理與 5 μmol/L

GA3 激素處理相比，野生型擬南芥和 MiNAC7 轉

基因擬南芥的根長生長均被抑制。在 5 μmol/L

ABA 激素處理下擬南芥表型差異明顯，植株弱

小，MiNAC7 轉基因擬南芥的根長比野生型擬南

芥的短。綜上所述，過表達 MiNAC7 基因增強了

轉基因擬南芥對 ABA 的敏感性、抗 GA3 以及抗

旱和耐鹽堿能力。

3 討論

NAC 基因家族廣泛存在于大量物種中，在植

物激素信號傳導，成花發(fā)育、果實成熟、葉片衰

老等植物生長發(fā)育過程以及高鹽、干旱、低溫或

高溫等非生物脅迫中起重要作用[26]。通過酵母雙

雜交文庫篩選，挖掘獲得了 1個 NAC類轉錄因子，

命名為 MiNAC7，NCBI 同源性比較分析顯示，

第 11 期 黃 星等：芒果 MiNAC7 基因的表達模式及在開花和非生物逆境脅迫應答中的功能分析 2261

A：過表達 MiNAC7 轉基因擬南芥推遲開花圖，A1：MiNAC7 基因在野生型擬南芥、轉 pBI121 空載擬南芥和 3 個超量表達 MiNAC7

擬南芥株系中的半定量表達水平； B：過表達 MiNAC7 轉基因擬南芥表型開花時間分析，不同小寫字母表示處理間差異顯著（P<0.05）；

C：MiNAC7 轉基因擬南芥中 3 個開花相關基因的表達模式，*表示處理間差異顯著（P<0.05）。

A: Overexpression of MiNAC7 in Arabidopsis delays flowering, A1: Semi-quantitative expression analysis of MiNAC7 in wide type,

pBI121-expressing and MiNAC7 overexpression transgenic lines; B: Phenotypic data of overexpressed MiNAC7 gene in Arabidopsis, Different lowercase letters indicate significant difference among treatments (P<0.05); C: Expression analysis of the transgenic Arabidopsis with

flowering time-related genes, * indicates significant difference among treatments (P<0.05).

圖 3 超量表達 MiNAC7 擬南芥推遲開花的表型分析

Fig. 3 Overexpression of MiNAC7 in Arabidopsis delays flowering

A：不同逆境脅迫下過表達 MiNAC7 轉基因擬南芥生長情況；B~E：不同逆境脅迫下過表達 MiNAC7 轉基因擬南芥根長數(shù)據(jù)圖；F~G：

不同逆境脅迫下過表達 MiNAC7 轉基因擬南芥鮮重數(shù)據(jù)圖；*表示處理間差異顯著（P<0.05）。

A: Growth of Arabidopsis seedlings on MS plates with different stress; B-E: Root length data of overexpressed MiNAC7 transgenic

Arabidopsis under different stress; F-G: Weight data of overexpressed MiNAC7 transgenic Arabidopsis under different stress; *

indicates significant difference among treatments (P<0.05).

圖 4 超量表達 MiNAC7 擬南芥植株對逆境脅迫的抗性分析

Fig. 4 Phenotypic analysis of roots of wild-type and MiNAC7-overexpressing Arabidopsis under abiotic stress

2262 熱帶作物學報 第 44 卷

MiNAC7 與多個被命名為不同名字的 NAC 基因具

有同源性，其中與阿方索芒果 MiNAC7 的核苷酸和

氨基酸同源性分別為 98.16%和 96.04%。進化樹分

析顯示芒果 MiNAC7 與阿月渾子 PvNAC26 最接

近，同源性最高，氨基酸相似性為 69.64%。啟動

子順式元件分析表明，芒果 MiNAC7 基因可能受

到光照、激素以及逆境脅迫的調(diào)控。

不同物種 NAC 家族基因表現(xiàn)出不同的表達模

式。蠟梅 CpNAC68 在成熟葉和花上特異表達[27]，

小麥 TtNAC2A 在葉和根中特異表達[28]。黃瓜 NAC

基因家族中有 11 個基因的優(yōu)勢表達部位是莖[29]，

菊花菜 NAC 基因家族中有 3個成員在莖的生長發(fā)

育過程中起重要的調(diào)控作用[30]。在本研究中，芒

果 MiNAC7 基因在童期組織中的表達水平相對于

成年期更高，在童期莖的表達量最高，與北沙柳

SpsNAC005 的研究結果相似[31]。芒果時空組織分

析結果顯示，MiNAC7 基因在營養(yǎng)生長期表達量

較高，但在成花轉變和花發(fā)育期表達水平較低，

說明 MiNAC7 與芒果成花有關。

在植物開花時間的調(diào)控中不同的 NAC基因具

有不同的功能。甘蔗 ScNAC23 的過表達促使轉基

因擬南芥提前開花[14]，黃麻 CcNAC1 可以讓植物

的花期提前[32]，OsNAC7 亞家族 CHR00069684 基

因使轉基因煙草提前開花[30]。本研究中，MiNAC7

過表達的轉基因擬南芥延遲開花，并下調(diào)開花促

進基因 AtFT 和 AtAP1 的表達，上調(diào)成花抑制基

因 AtFLC 的表達，說明 MiNAC7 通過調(diào)控成花相

關基因的表達進而影響轉基因植株成花。芒果

MiNAC1 基因不影響轉基因擬南芥的開花時間[33]，

說明不同類型的 NAC 基因在調(diào)控植物成花過程

中的功能存在差異。

植物 NAC 轉錄因子在多種非生物脅迫應答

中起重要作用，在 NaCl、甘露醇或 ABA 脅迫條

件下，剛毛檉柳 ThNAC13 轉基因植物的根長和鮮

重與野生型植物相比均顯著增加[34]。在 ABA 脅

迫條件下，南荻 MlNAC10[35]、歐李 ChNAC1[36]

轉基因植物都增加了對 ABA 的敏感性。在本研究

中，100、125 mmol/L 濃度的鹽脅迫處理和 300、

400 mmol/L 的干旱脅迫的轉基因擬南芥根長均比

野生型擬南芥根長較長，鮮重比野生型擬南芥重。

5、10 μmol/L GA3 激素處理促進了 MiNAC7 轉基

因擬南芥的根長生長，在 5 μmol/L ABA 激素處理

下轉基因擬南芥根長較短，說明 MiNAC7 也參與了

植物的逆境脅迫應答過程。這與芒果 MiNAC1 基因

在逆境脅迫方面的研究結果相似[33]。

綜上所述，芒果 MiNAC7 基因不僅參與調(diào)控

植株開花，同時響應非生物逆境脅迫應答。

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熱帶作物學報 2023, 44(11): 2265?2272

Chinese Journal of Tropical Crops

收稿日期 2022-10-10；修回日期 2022-11-16

基金項目 國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系項目（No. CARS-11）；海南省院士創(chuàng)新平臺科研專項（No. SQ2021PT0035）。

作者簡介 伍寶朵（1984—），女，碩士，助理研究員，研究方向：胡椒種質(zhì)資源與遺傳育種。*通信作者（Corresponding author）：

閆 林（YAN Lin），E-mail：yanlin2575@163.com。

流式細胞術估測胡椒屬植物基因組大小方法的建立及應用

伍寶朵1,3,4，胡麗松1,3,4，馮楗雄2

，范 睿1,3,4，郭 芬2

，吉訓志1,3,4，郝朝運1,3,4，

閆 林1,4*

1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院香料飲料研究所，海南萬寧 571533；2. 云南農(nóng)業(yè)大學熱帶作物學院，云南普洱 665000; 3. 海南

省 Sim Soonliang 院士工作站，海南萬寧 571533；4. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部香辛飲料作物遺傳資源利用重點實驗室，海南萬寧 571533

摘 要：為建立胡椒屬資源基因組大小流式細胞術測定方法，本研究篩選了 6 種細胞核提取液和 3 種不同部位葉片，

以已知基因組大小的黃瓜為標樣，運用流式細胞術對胡椒屬資源基因組大小進行了測定。結果表明：改良細胞核提取

液和倒一葉是適合胡椒流式細胞術的提取液和取樣部位；栽培胡椒品種古晉、Aman 和 EMAS 胡椒的基因組大小為

667.94~719.32 Mb，而熱引 1 號、柬埔寨小葉種、班尼約爾 1 號和 73F5 的基因組大小為 759.69~785.38 Mb，因此不同

栽培品種之間基因組大小存在差異；推算基因組大于 900 Mb 的石楠藤和山蒟的染色體條數(shù)應該是大于 52 且為 13 的倍

數(shù)，基因組大小在 600~800 Mb 范圍內(nèi)種質(zhì)的染色體數(shù)可能是 52 條。雜交種不但具有與栽培胡椒和黃花胡椒相近的表

型，其基因組大小也幾乎等于栽培胡椒和黃花胡椒的平均值，推測雜交種可能是栽培胡椒和黃花胡椒的雜交后代。本

研究可為胡椒屬資源基因組大小測定提供方法，也將為胡椒屬種質(zhì)資源評價及遠源雜交等研究提供技術基礎。

關鍵詞：胡椒屬；流式細胞術；細胞核提取液；基因組大小

中圖分類號：S573.9 文獻標識碼：A

Establishment and Application of a Method for Genome Size Estimation

of Piper L. Using Flow Cytometry

WU Baoduo1,3,4, HU Lisong1,3,4, FENG Jianxiong2

, FAN Rui1,3,4, GUO Fen2

, JI Xunzhi1,3,4, HAO Chaoyun1,3,4,

YAN Lin1,4*

1. Spice and Beverage Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Wanning, Hainan 571533, China;

2. College of Tropical Crop Science, Yunnan Agricultural University, Pu’er, Yunnan 665000, China; 3. Hainan Sim Soonliang Academician Workstation, Wanning, Hainan 571533, China; 4. Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spiced Beverage

Crops, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Wanning, Hainan 571533, China

Abstract: Six nuclear extracts and three leaves of different development stage were screened to establish the flow cytometry (FCM) method for determining the genomic size of Piper L. and Cucumis sativus L. was used as the DNA reference standard. Result showed that the modified nuclear extract and inverted leaf were suitable for the flow cytometry

of Piper L. The genome size of cultivated varieties, including Kuching, Aman and EMAS, ranged from 667.94 to 719.32

Mb, and Reyin1, microphylla variety from Cambodia, Panniyur-1 and 73F5 ranged from 759.69 to 785.38 Mb. Therefore, the genome size was significantly different among cultivated varieties. Furthermore, it is speculated that the

chromosome numbers of P. wallichii and P. hancei, with genome size larger than 900 Mb, should be larger than 52 with

a multiple of 13, and the number of chromosomes of germplasm, with genome size ranged from 600 to 800 Mb, may be

52. The hybrid not only had similar phenotypes to cultivated varieties and P. flaviflorum, but also had an average genome size of cultivated varieties and P. flaviflorum. Therefore, it is speculated that the hybrid may be the hybrid offspring of cultivated varieties and P. flaviflorum. This study would provide a method for the determination of the genome

size of Piper L. germplasm, and provide a technical basis for the study of Piper L. germplasm evaluation and distant

2266 熱帶作物學報 第 44 卷

hybridization.

Keywords: Piper L.; flow cytometry; modified nuclear extract; genomic size

DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2023.11.015

基因組大小是指某種生物中單倍體細胞核或

配子體中的 DNA 含量，是物種特有的，稱為 C

值（C-value），常用重量皮克（10?12

g）或核苷酸

堿基對數(shù)量（base pair）來表示。基因組大小與物

種的進化有較強的相關性，同時與生物學性狀也

有一定的關系[1]?；蚪M大小測定的方法有多種，

如 Feulgen 染色法、化學分析法及流式細胞術等。

Feulgen 染色法結果相對準確，但是操作過程繁

瑣；化學分析法易受細胞周期影響，致使測定結

果存在偏差[2]；而新技術流式細胞術（flow cytometry, FCM）具有瞬間準確分析大量細胞的特

點，是一種測定基因組大小快速且有效的方法[3]。

流式細胞術在人和動物的臨床和基礎研究中被廣

泛應用，植物體內(nèi)由于含有大量的多糖、多酚等

次生代謝物質(zhì)，嚴重影響了 PI 染料的熒光染色強

度，降低了測定基因組大小的準確性[4]。因此明

確適合測定物種流式細胞術的測定方法對該物種

基因組大小研究至關重要。近年來，流式細胞術

在植物中被廣泛應用。楊轉英等[5]采用流式細胞

術測定不同菠蘿蜜株系基因組大小，發(fā)現(xiàn)不同菠

蘿蜜株系之間基因組大小存在顯著差異，且濕苞

株系大于干苞株系。柳覲等[6]利用改良 OTTO 細

胞核提取液檢測出澳洲堅果基因組大小為 1.872

758×109

bp，該研究發(fā)現(xiàn)運用流式細胞術進行澳

洲堅果基因組 C 值測定準確可靠。

胡椒屬植物是胡椒科（Piperaceae）重要的泛熱

帶組成成分，是基部被子植物中最大的屬之一[7]。

約有 1000 多個種，主要分布于南亞、南美洲、中

美洲等熱帶和亞熱帶地區(qū)。胡椒屬內(nèi)有許多具有

經(jīng)濟價值和開發(fā)潛力的資源，例如胡椒（P. nigrum）、卡瓦胡椒（P. methysticum）和石楠藤（P.

wallichii）等被用來入藥[8]，在亞洲東南部，人們

常將蔞葉（P. betle）和檳榔果連同石灰一起咀嚼

幫助消化。胡椒野生近緣種眾多，部分資源具有

優(yōu)良性狀，例如黃花胡椒（P. flaviflorum）具有較

強的抗瘟病性[9]。大葉蒟（P. laetispicum）具有較

長的花穗，石楠藤具有較強的抗寒性等[10]。胡椒

是人們喜愛的調(diào)味品，素有“香料之王”的美譽。

原產(chǎn)于印度，胡椒自 1947 年引入中國，目前種植

面積達 3 萬 hm2

，年總產(chǎn)量超過 3 萬 t，位居世界

第 5 位。我國胡椒栽培品種以熱引 1 號（P. nigrum

cv. Reyin1）為主，存在栽培品種單一和抗逆性弱的

問題，嚴重限制了我國胡椒產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展[11-12]。

因此亟待開展胡椒資源挖掘和創(chuàng)新利用工作。胡

椒是四倍體植物，染色體數(shù)為 2n=4x=52[13]。JOSE

等[14]報道胡椒屬不同資源具有不同染色體數(shù)，且胡

椒屬植物具有較小的染色體長度（0.56~2.41 μm），

而染色體倍性分析需要較強的實驗技術，利用流

式細胞術可快速測定胡椒屬資源基因組大小，為

染色體倍性估測和分析提供基礎。

本研究以 4 份不同來源地胡椒屬種質(zhì)為材

料，通過篩選 6 種細胞核提取液和不同部位葉片，

明確適合胡椒屬基因組大小的流式細胞術測定方

法。利用篩選出的適合胡椒流式細胞術測定的方

法，以黃瓜為標樣，測定 22 份胡椒屬資源的基因

組大小。本研究可為胡椒屬資源基因組大小測定

提供方法，也將為胡椒屬資源變異、種質(zhì)資源評

價及遠源雜交等研究提供技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為胡椒屬種質(zhì)，胡椒屬種質(zhì)葉片取

材于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院香料飲料研究所的農(nóng)業(yè)

農(nóng)村部萬寧胡椒種質(zhì)資源圃。分別取 4 份來源地

不同的胡椒屬種質(zhì)嫩葉用于細胞核提取液篩選

（表 1）；取 4 份種質(zhì)的下位葉、中位葉、倒一葉

用于葉片部位篩選；22 份胡椒屬資源用于測定基

因組大小。以黃瓜（Cucumis sativus L.）為標樣[15]，

將黃瓜種子播種于 15 cm×20 cm 培養(yǎng)盆中，并在

人工氣候室培育，待長出真葉后取嫩葉用于試驗。

表 1 供試材料

Tab. 1 Test materials

材料名稱

Materials name

種名

Genus name

來源地

Origin place

植株形態(tài)

Plant morphology

熱引 1 號胡椒 P. nigrum cv. Reyin1 中國海南 木質(zhì)藤本

黃花胡椒 P. flaviflorum 中國云南 木質(zhì)藤本

墨西哥胡椒 P. auritum 墨西哥 直立灌木

卡瓦胡椒 P. methysticum 南美洲 直立灌木

第 11 期 伍寶朵等：流式細胞術估測胡椒屬植物基因組大小方法的建立及應用 2267

1.2 方法

1.2.1 細胞核提取液及 DNA 熒光染料的配制

選取 4 種已報道的細胞核提取液（Otto 提取液[5]、

Tris提取液[16]、LB01提取液[4]和 WPB 提取液[17]）、

1 種改良提取液[18]和 1 種 PI 試劑盒（廣州吉源生

物科技有限公司），細胞核提取液具體配方見表 2。

提取液配制完成后過濾、滅菌，并置于 4 ℃冰箱

內(nèi)保存。熒光探針是碘化丙啶（PI），PI 工作液中

碘化丙啶的濃度為 1 mg/mL。

1.2.2 細胞核懸浮液的制備和染色 剪取約

20~40 mg 胡椒葉片放入 60 mm 培養(yǎng)皿中，加入

預冷的細胞核提取液 500 μL，讓提取液充分浸沒

葉片，用厚度為 0.08 mm 鋒利的雙面刀片迅速切

成碎片，傾斜放置 5 min，再用 400~600 目濾膜

過濾至流式細胞儀專用上樣管中，在濾液中加入

2 mL 細胞核提取液或緩沖液、6 μL RNaseA（終

濃度為 40 μg/mL）和 20 μL PI 染液，避光靜置

30 min。

表 2 細胞核解離液及提取液成分

Tab. 2 Nuclear buffer and its components

提取液 Buffer 組分 Component

Otto 提取液 Otto Ⅰ: 100 mmol/L citric acid, 0.5% Tween 20, 20 mmol/L β-mercaptoethanol, pH 2.3

Otto Ⅱ: 400 mmol/L Na2HPO4·12H2O, 20 mmol/L β-mercaptoethanol, pH 8.9

Tris 提取液 200 mmo/L Tris, 4 mmol/L MgCl2, 0.5% (V/V) Tritonx-100 pH 7.5

LB01 提取液 15 mmol/L Tris, 2 mmol/L Na2EDTA, 0.5 mmol/L spermine·4HCl, 80 mmol/L KCl, 20 mmol/L NaCl, 15 mmol/L

β-mercaptoethanol, 0.1% (V/V) Triton X-100, pH 7.5

WPB 提取液 200 mmol/L Tris-HCl, 4 mmol/L MgCl2·6H2O, 2 mmol/L Na2EDTA, 86 mmol/L NaCl, 10 mmol/L Na2O5S2, 1%

PVP-10, 1%(V/V) Triton X-100, pH 7.0

改良提取液 1.0% (V/V) Tritonx-100, 140 mmol/L PVP, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.0), 50 mmol/L NaHSO3, pH 7.5

1.2.3 流式細胞術檢測 將制備好的細胞核懸浮

液采用德國 Partec 公司 CyFlow? Cube6 流式細胞

儀檢測。流式細胞儀的氬離子激光發(fā)射器的激發(fā)

光波長為 488 nm ，檢測通道為 FL2 通 道

590/50[488] ，利用流式細胞儀隨機自帶軟件

CyFlow Cube 15-CFG 收集至少 5000 個細胞，變

異系數(shù)（coefficient of variation, CV）控制在 6%

以內(nèi)；每個樣本重復測定 5 次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用 FlowJo-V10 軟件分析數(shù)據(jù)，以標樣基因

組大小和出峰位置為對照，依據(jù)測定樣品出峰位

置計算出其基因組大?。ɑ蚪M C 值），計算公式

為：待測樣本基因組大小=參考樣本基因組大小?

（待測樣本熒光均值/參考樣本熒光均值）；使用

SPSS 16.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 細胞核提取液的篩選

比較 6 種細胞核提取液流式細胞術測定結果

可知（圖 1），以 Otto 提取液為細胞核提取液時，

只有墨西哥胡椒能檢測出信號峰，熱引 1 號胡椒、

黃花胡椒和卡瓦胡椒 3 份種質(zhì)不能檢測出信號

峰。以 Tris 提取液為細胞核提取液時，熱引 1 號

胡椒和墨西哥胡椒能檢測出信號峰，但是信號峰

碎片較多，CV 值均大于 6，黃花胡椒和卡瓦胡椒

不能檢測出信號峰。以 LB01 提取液為細胞核提

取液時，熱引 1 號胡椒、墨西哥胡椒和卡瓦胡椒

均能檢測出信號峰，其中熱引 1 號胡椒和卡瓦胡

椒的信號峰都是碎片較多，CV 值大于 6，墨西哥

胡椒信號峰碎片相對少一些，黃花胡椒不能檢測

出信號峰。以 WPB 提取液為細胞核提取液時，

熱引 1 號胡椒和墨西哥胡椒均能檢測出信號峰，

但是檢測出的信號峰都是碎片較多，CV值大于6，

黃花胡椒和卡瓦胡椒不能檢測出信號峰。以 PI 試

劑盒為細胞核提取液時，墨西哥胡椒和卡瓦胡椒

能檢測出信號峰，但是卡瓦胡椒信號峰碎片稍多，

熱引 1 號胡椒和黃花胡椒不能檢測出信號峰。以

改良提取液為細胞核提取液時，4 份種質(zhì)均能檢測

出完整信號峰，CV 值小于 6?？梢?，改良提取液

是適合胡椒屬種質(zhì)流式細胞術的細胞核提取液。

2.2 葉片取樣部位的篩選

為選擇適合胡椒屬種質(zhì)資源流式細胞檢測的

最佳部位葉片，利用篩選出的改良提取液分別對

黃花胡椒、熱引 1 號胡椒、卡瓦胡椒和墨西哥胡

椒的下位葉（superior leaf）、中上位葉（inferior

leaf）和倒一葉（inverted one leaf）進行流式細胞

術檢測（圖 2），結果表明 4 份胡椒種質(zhì)使用下位

葉和上位葉檢測時，少數(shù)不能形成完整的信號峰，

2268 熱帶作物學報 第 44 卷

圖 1 6 種細胞核提取液篩選 4 份胡椒種質(zhì)流式圖

Fig. 1 Flow cytometry results analyzed by six nuclear extract buffer for four Piper L. germplasm

第 11 期 伍寶朵等：流式細胞術估測胡椒屬植物基因組大小方法的建立及應用 2269

圖 2 改良提取液檢測 4 份胡椒種質(zhì)不同部位葉片流式結果

Fig. 2 Flow cytometry result of four Piper L. germplasm different sites of leaf samples screened with modified buffer

多數(shù)形成了完整的信號峰，但是與倒一葉相比，

下位葉和上位葉形成的信號峰碎片較多，細胞核

收集偏少?？梢姡挂蝗~是適宜胡椒屬流式細胞

術的葉片采樣部位。

2.3 胡椒屬資源 C 值測定

通過比較待測胡椒資源樣品與黃瓜樣品峰值

的倍數(shù)關系（圖 3），計算出胡椒資源的基因組大

?。ū?3）。以熱引 1 號胡椒為例，其熒光強度是

6596 ，標樣黃瓜的熒光強度為 3184 ，

ARUMUGANATHAN 等[15]報道利用流式細胞術

測定的黃瓜基因組大小為 367 Mb，依據(jù)基因組大

小計算公式，計算出熱引 1 號胡椒基因組大小為

759.69 Mb，HU 等[19]通過全基因組測序估測的熱

引 1 號胡椒基因組大小為 761.2 Mb，二者誤差較

小，說明該方法準確可靠。利用同樣的方法，估

測了 22 份胡椒資源基因組大小，檢測的胡椒種質(zhì)

基因組大于 900 Mb 的種質(zhì)有石楠藤、卡瓦胡椒

和山蒟；基因組在 600~800 Mb 的種質(zhì)有熱引 1

號、柬埔寨小葉種、班尼約爾 1 號、古晉、Aman

胡椒、EMAS 胡椒、73F5、雜交種、復毛胡椒、

華山蒟、蔞葉和篳菝；基因組小于 600 Mb 的種

圖 3 標樣黃瓜的流式細胞術測定結果

Fig. 3 Flow cytometry determination result of

Cucumis sativus L.

2270 熱帶作物學報 第 44 卷

表 3 不同胡椒資源細胞核 DNA 相對含量

Tab. 3 Relative nuclear DNA content in different Piper L. germplasm

種質(zhì)名稱 熒光強度 Fluorescence intensity

Germplasm name

種名

Species name 胡椒 Piper 黃瓜 C. sativus

比值

Ratio

基因組大小

Genome size/Mb

熱引 1 號 Piper nigrum 6596.0 3184 2.07 759.69

柬埔寨小葉種 Piper nigrum 7048.2 3407 2.07 759.69

班尼約爾 1 號 Piper nigrum 6771.6 3219 2.10 770.70

古晉 Piper nigrum 6747.0 3491 1.93 708.31

Aman 胡椒 Piper nigrum 6081.2 3348 1.82 667.94

EMAS 胡椒 Piper nigrum 6943.4 3548 1.96 719.32

73F5 Piper nigrum 6688.0 3124 2.14 785.38

雜交種 未知 5166.4 3124 1.65 605.55

海南蒟 Piper hainanense 5772.0 3592 1.62 594.54

蔞葉 Piper betle 7479.0 3539 2.11 774.37

徦蒟 Piper samentosum 5569.2 3716 1.50 550.50

大葉蒟 Piper laetispicum 5111.0 3472 1.47 539.49

石楠藤 Piper wallichii 9847.0 3116 3.16 1159.72

復毛胡椒 Piper bonii 5852.8 3316 1.77 649.59

尖峰嶺胡椒 Piper jianfenglingense 5235.8 3371 1.55 568.85

蓽菝 Piper longum 6766.8 3316 2.04 748.68

黃花胡椒 Piper flaviflorum 4140.6 3219 1.29 473.43

卡瓦胡椒 Piper methysticum 8026.0 3184 2.52 924.84

墨西哥胡椒 Piper auritum 4208.0 3124 1.35 495.45

斜葉蒟 Piper senporeiense 5225.8 3539 1.48 543.16

華山蒟 Piper cathayanum 6378.4 3361 1.90 679.30

山蒟 Piper hancei 9254.6 3510 2.64 968.88

質(zhì)有海南蒟、假蒟、大葉蒟、尖峰嶺胡椒、斜葉

蒟、黃花胡椒和墨西哥胡椒。綜上可見，胡椒屬

不同種質(zhì)間基因組大小差異較大。

3 討論

植物體內(nèi)含有大量的多糖、多酚等次生代謝

物質(zhì)，嚴重影響了 PI 染料的熒光染色強度，降低

了測定基因組大小的準確性。胡椒屬植物是遍布

于熱帶地區(qū)的重要作物，胡椒葉片具有較厚的蠟

質(zhì)層，葉片硬度較高，細胞中具有較復雜的次生

代謝物質(zhì)，研究表明胡椒葉中 DPPH 清除能力、

多酚含量及氧自由基清除能力均高于胡椒果實，

可能含有高抗氧化因子[20]。本研究嘗試采用已報

道植物流式細胞術測定細胞核提取液（Otto、Tris、

LB01、WPB 提取液和 PI 試劑盒）測試胡椒屬植

物，均不能得到滿意效果，因此，明確適合胡椒

屬植物流式細胞術的細胞核提取液及測定方法對

胡椒屬植物基因組大小研究至關重要。

本研究發(fā)現(xiàn)，與 Otto、Tris、LB01、WPB 提

取液和 PI 試劑盒相比較，以改良提取液為細胞核

提取液檢測胡椒屬植物時，噪音峰能夠與信號峰

較好分離，碎片相對較少，CV 值也符合流式細胞

術分析要求，是適合胡椒屬植物基因組大小測定

的細胞核提取液。本研究選用的 6 種提取液配方

差異較大，以改良提取液檢測胡椒屬植物效果最

好，LB01 提取液效果次之。比較改良提取液和

LB01 提取液配方發(fā)現(xiàn)，二者共有的成分有

Tritonx-100、Cl和 Tris，改良提取液特有的成分

是 NaHSO3 ， 而 LB01 提取液特有的成分是

spermine·4HCl。分析另外 3 種已知配方提取液發(fā)

現(xiàn)，Tritonx-100、Cl和 Tris 這 3 種成分在 Tris 和

WPB 提取液中也同時存在。說明 NaHSO3 和

spermine·4HCl 可能適用于作為胡椒屬植物流式

細胞術檢測的提取液配方，尤其是 NaHSO3 更適

合，當然，它們需與其他成分相互作用才能更好

地發(fā)揮作用。本研究只測試了改良提取液在胡椒

屬植物中的應用，還適用于哪些植物需要進一步

試驗證明。

第 11 期 伍寶朵等：流式細胞術估測胡椒屬植物基因組大小方法的建立及應用 2271

分析不同種質(zhì)信號峰檢測結果發(fā)現(xiàn)，不同種

質(zhì)檢測出信號峰的難易程度差異較大。如：熱引

1 號胡椒在 2 種提取液中能檢測出完整信號峰，3

種提取液中能檢測的信號峰不能與噪音峰分離；

黃花胡椒除在改良提取液中能檢測出完整信號

峰，其他的均不能；而墨西哥胡椒在 4 種提取液

中均能檢測出完整信號峰，另外 2 種的信號峰不

能與噪音峰分離。說明利用流式細胞術檢測胡椒

屬內(nèi)不同種資源時也具有特異性，這可能與不同

種資細胞內(nèi)次生代謝物質(zhì)不同有關。

本研究選用的栽培種胡椒有 7份。古晉、Aman

和 EMAS 胡椒都是馬來西亞育成品種，其中

EMAS 胡椒是由 Balancotta（印度品種）和古晉雜

交并回交選育而成，Aman 胡椒是由從哥斯達黎加

引種的品種 CATIE Row1-1 的無性系選育而來[21]。

經(jīng)測試發(fā)現(xiàn)，古晉、Aman 和 EMAS 胡椒的基因

組大小分別為 708.31、667.94、719.32 Mb；熱引

1 號是由從印度尼西亞引種的品種南榜的無性系

經(jīng)長期選育而來，班尼約爾 1 號是從印度引進的

品種，73F5 是熱引 1 號和班尼約爾 1 號的雜交后

代，柬埔寨小葉種是從柬埔寨引進的小葉種胡椒

品種。熱引 1 號、柬埔寨小葉種、班尼約爾 1 號

和 73F5 的基因組大小分別為 759.69、759.69、

770.70、785.38 Mb。綜上可見，本研究中測定的 7

份栽培種胡椒的基因組大小存在差異。JOSE 等[14]

報道栽培種班尼約爾 1 號、Cheriakaniakadan 和

Karimunda 的總染色體長度分別為 67.04、51.48、

56.66 μm，因此不同栽培種之間基因組大小也會

存在差異。本研究中，來源于馬來西亞的品種與

來源于印度尼西亞、印度、柬埔寨的品種基因組

大小也具有差異。

JOSE 等[14]認為胡椒屬資源的染色體基數(shù)是

n=13（P. cubeba 除外），研究發(fā)現(xiàn)，栽培胡椒、蔞

葉、蓽菝和卡瓦胡椒的染色體數(shù)分別為 2n= 4x=52、

2n=2x=52、2n=2x=52 和 2n=10x=130[14, 22-23]。本研

究測定卡瓦胡椒基因組大小大于 900 Mb，明顯大

于另外 3 種染色體數(shù)為 52 的種質(zhì)，此外，石楠藤

和山蒟的基因組也大于 900 Mb，依據(jù)前面結論推

測石楠藤和山蒟的染色體條數(shù)應該是大于 52 且

為 13 的倍數(shù)[14]。本研究中 7 份栽培胡椒染色體

數(shù)都是 52，基因組大小范圍為 667.94~785.38 Mb，

SAMUEL 等[22]研究中報道，3 份染色體數(shù)為 52

的種質(zhì)（P. nigrum、P. ornatum 和 P. porphyrophyllum）染色體長度為 52.32~72.18 μm，其中 P.

nigrum 的染色體長度最長，推斷基因組大小在

600~800 Mb 范圍內(nèi)的種質(zhì)染色體數(shù)可能也是 52

條。雜交種是一個未知種，從表型和進化上來看，

該種具有與栽培胡椒和黃花胡椒相近的表型，本

研究發(fā)現(xiàn)，其基因組大小幾乎等于栽培胡椒和黃

花胡椒的平均值，因此推測雜交種可能是栽培胡

椒和黃花胡椒的雜交后代。

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熱帶作物學報 2023, 44(11): 2273?2280

Chinese Journal of Tropical Crops

收稿日期 2022-09-19；修回日期 2022-11-17

基金項目 江西省教育廳科學技術研究項目（No. GJJ218111, No. GJJ213308）；江西省撫州市青年科技領軍人才項目（No.

2020ED66）。

作者簡介 許建豐（1982—），女，碩士，講師，研究方向：藥用植物生物技術。*通信作者（Corresponding author）：饒澤昌

（RAO Zechang），E-mail：rzc2005010@163.com。

基于轉錄組測序的斑地錦內(nèi)參基因篩選及驗證

許建豐1

，桂明明2

，張永康1

，堯子釗1

，黃勝和2

，饒澤昌1*

1. 南昌大學撫州醫(yī)學院，江西撫州 344000；2. 江西中醫(yī)藥高等?？茖W校醫(yī)學基礎部，江西撫州 344000

摘 要：斑地錦（Euphorbia maculata）是一種常用中藥材，其中黃酮類化合物槲皮素是其主要藥效成分之一。目前斑

地錦槲皮素生物合成基因研究鮮見報道，而實時熒光定量 PCR（RT-qPCR）是基因研究的常用方法之一，但具有合適

的內(nèi)參基因是 RT-qPCR 相對定量的前提條件。為了獲得適合的斑地錦內(nèi)參基因，本研究基于轉錄組測序結果，篩選出

斑地錦 EmSE、EmUBC、EmGDI1、EmLSM12、EmGBP、EmSYP22、EmTRI1、EmRSZ21、EmRPL7 以及課題組前期得

到的 EmUBQ 共 10 個基因作為侯選內(nèi)參基因。通過 RT-qPCR 檢測 10 個候選內(nèi)參基因在斑地錦營養(yǎng)生長期和生殖生長

期的根、莖、葉及果中的表達情況，利用 geNorm、NormFinder 和 BestKeeper 軟件分析候選基因的表達穩(wěn)定性，通過

幾何平均值法對不同軟件所得結果進行整合并明確綜合排名，即 EmGDI1>EmUBQ>EmSE>EmUBC>EmLSM12=EmGBP>

EmTRI1>EmSYP22> EmRSZ21=EmRPL7。以 EmGDI1 為內(nèi)參基因，對槲皮素生物合成過程中的一個關鍵酶基因 EmC4H

進行表達分析，EmC4H 在不同生長期不同組織內(nèi)的表達差異與轉錄組測序結果趨勢基本一致。本研究開發(fā)的內(nèi)參基因

EmGDI1 可作為斑地錦不同生長期基因組織特異性表達研究中適合的內(nèi)參基因。

關鍵詞：斑地錦；內(nèi)參基因；轉錄組測序；實時熒光定量 PCR

中圖分類號：S567.219 文獻標識碼：A

Selection and Verification of the Reference Genes of Euphorbia maculata Based on Transcriptome Sequencing

XU Jianfeng1

, GUI Mingming2

, ZHANG Yongkang1

, YAO Zizhao1

, HUANG Shenghe2

, RAO Zechang1*

1. Fuzhou Medical College, Nanchang University, Fuzhou, Jiangxi 344000, China; 2. Department of Basic Medicine, Jiangxi College

of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou, Jiangxi 344000, China

Abstract: The flavonoid quercetin is one of the main active ingredients in Chinese medicinal herb, Euphorbia maculata.

At present, there are few reports on quercetin biosynthesis gene, and real-time quantitative PCR (RT-qPCR) is one of the

common methods in gene research. But it is a prerequisite for relative quantitative RT-qPCR to have suitable reference

genes. In order to obtain a suitable reference gene, this experiment was based on the results of transcriptome sequencing,

EmSE, EmUBC, EmGDI1, EmLSM12, EmGBP, EmSYP22, EmTRI1, EmRSZ21, EmRPL7 and EmUBQ obtained by our

research group in the early stage were selected as candidate reference genes. RT-qPCR was used to detect the expression

of the candidate reference genes in roots, stems, leaves and fruits of E. maculata during vegetative and reproduction

stages. The expression stability of the candidate genes was analyzed using geNorm, NormFinder and BestKeeper software. The results of different software were integrated and ranked by the geometric mean method. The ranking was in

the order EmGDI1>EmUBQ>EmSE>EmUBC>EmLSM12=EmGBP>EmTRI1>EmSYP22>EmRSZ21=EmRPL7. EmC4H,

a key enzyme gene in quercetin biosynthesis, was analyzed using EmGDI1 as the reference gene. The difference of

EmC4H expression in different tissues at different stages was consistent with the trend of transcriptome sequencing. The

reference gene EmGDI1 developed in this study could be used as a suitable reference gene for tissue-specific expression

studies of different stages of E. maculata.

2274 熱帶作物學報 第 44 卷

Keywords: Euphorbia maculata; reference gene; transcriptome sequencing; RT-qPCR

DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2023.11.016

斑地錦（Euphorbia maculata L.）是一年生大

戟科（Euphorbiaceae）大戟屬（Euphorbia L.）草

本植物，分布于江西、新疆、河南和浙江等地區(qū)[1]，

具有清熱解毒功效，主治痢疾、泄瀉、尿血、便

血、瘡癤癰腫、濕熱黃疸等[2]。斑地錦主要含有

黃酮類、萜類、酚酸類和生物堿類等成分，目前

已開發(fā)有腸炎寧片、三七止血片、瀉痢寧片等中成

藥，其主要藥效成分之一為黃酮類物質(zhì)槲皮素[3]，

研究槲皮素等藥用植物有效成分生物合成途徑基

因及其調(diào)控已成為熱點之一[4]。

實時熒光定量 PCR（RT-qPCR）是分子生物

學中研究基因表達的重要工具之一，具有定量準

確、特異性強、靈敏度高、重復性好等優(yōu)點，常

用于基因表達定量分析[5]。然而，合適的內(nèi)參基

因是獲得可信相對定量結果的前提[6]。研究表明，

不經(jīng)篩選評價而以一種基因作為任何條件下的內(nèi)

參基因可能會大大降低結果的精確度[7-8]?；蛐?/p>

片及轉錄組測序技術等已被用于篩選傳統(tǒng)的或新

的內(nèi)參基因，以利于 RT-qPCR 的開展[9]。轉錄組

測序是對某一物種的 mRNA 進行高通量測序，反

映特定條件或特定時間點的基因表達情況，通過

分析轉錄組測序結果可以初步篩選出候選內(nèi)參基

因[10]。目前評價內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性的軟件較

多，其中應用較廣泛的有 geNorm、NormFinder

和 BestKeeper[11-12]。為篩選適用于斑地錦不同生

長期不同組織 RT-qPCR 檢測的內(nèi)參基因，本研究

以前期篩選出的內(nèi)參基因 EmUBQ[13]和通過轉錄

組測序數(shù)據(jù)初步篩選出的 9 個表達相對穩(wěn)定的基

因 EmRSZ21、EmSE、EmTRI1、EmGDI1、EmSYP22、

EmLSM12、EmGBP、EmRPL7、EmUBC 為候選內(nèi)

參基因進行 RT-qPCR，分析其在營養(yǎng)生長期和生

殖生長期的根、莖、葉、果中的表達模式，利用

geNorm、NormFinder 和 BestKeeper 等軟件綜合

分析其表達穩(wěn)定性排名，并用 EmC4H（槲皮素生

物合成過程中的關鍵酶基因之一）進行驗證，為

斑地錦不同生長期基因組織特異性表達研究提供

可靠的內(nèi)參基因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供試材料采自江西中醫(yī)藥高等

?？茖W校實驗田，經(jīng)其藥學系中藥教研室鑒定為

斑地錦。分別采集營養(yǎng)生長期（未開花且地上部

分有 2 個及以上分枝）植株的根、莖、葉和生殖

生長期（結 3 個及以上的果）植株的根、莖、葉、

果，7 種樣品皆為來源于 3 株以上植株的混合樣，

樣品采集后立即置于-80 ℃冰箱備用。

1.1.2 主要試劑與儀器 RNA 提取試劑盒（Spin

Column Plant Total RNA Purification Kit）購自生

工生物工程（上海）股份有限公司；反轉錄試劑

盒（PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA

Eraser）、熒光定量 PCR 試劑（PrimeScriptTM RT

Master Mix）、Pfu 酶（TransStart FastPfu DNA

Polymerase）、Taq 酶等購自寶生物工程（大連）

有限公司。普通 PCR 儀（T100TM Thermal Cycler）、

熒光定量 PCR 儀（CFX96 Real-Time）等購自美

國 Bio-Rad 公司。超微量分光光度計（NanoDrop

One）購自美國 Thermo Scientific 公司。引物合成、

測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 總 RNA 的提取和 cDNA 的合成 參照試

劑盒說明書，提取斑地錦不同生長期根、莖、葉、

果總 RNA，通過超微量分光光度計測定 RNA 濃

度，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 的質(zhì)量。cDNA

的合成按相應試劑盒說明書進行操作。

1.2.2 候選內(nèi)參基因的篩選 根據(jù)課題組斑地錦

轉錄組測序結果，選取 FPKM 值大于 10 且變異

系數(shù)小于 0.1 的 9 個基因 EmSE、EmUBC、

EmGDI1、EmLSM12、EmGBP、EmSYP22、EmTRI1、

EmRSZ21 、 EmRPL7 以及課題組前期篩選的

EmUBQ 共 10 個基因為候選基因。

1.2.3 引物設計及特異性檢測 利用 Primer

Premier 5.0 軟件設計 9 個候選內(nèi)參基因及 EmC4H

基因定量 PCR 引物，EmUBQ 定量 PCR 引物參考

文獻[13]，各引物序列見表 1。為排除引物二聚體，

檢驗引物特異性及非特異性擴增產(chǎn)物對結果的影

響，用相應引物進行普通 PCR 擴增。

1.2.4 RT-qPCR 溶解曲線分析 以 cDNA 作為模

板，進行 RT-qPCR 擴增，加熱 RT-qPCR 產(chǎn)物從

65 ℃到 95 ℃，每隔 0.5 ℃停留 5 s 檢測 1 次熒光

強度以獲得溶解曲線。 RT-qPCR 反應體系

（25 μL）：2×TB Green Premix Ex Taq II 12.5 μL，

第 11 期 許建豐等：基于轉錄組測序的斑地錦內(nèi)參基因篩選及驗證 2275

表 1 內(nèi)參基因及 EmC4H 基因的引物設計

Tab. 1 Primer design for reference genes and EmC4H gene

引物名稱

Primer name

引物序列（5′-3′）

Primer sequences (5′-3′)

退火溫度

Annealing

temperature/℃

UBQ-qF ATAACCCTCGAGGTCGAGTC 57

UBQ-qR TGGAGAGTGGACTCCTTCTG

RSZ21-qF TCTCTGCTTCTCTGCACGTC 57

RSZ21-qR CATAACACGCGCTCTGTTGC

SE-qF CCCCAGTGTTGATGCCTGTT 57

SE-qR GCCTTGCATTTCTGCCACC

TRI1-qF AAGCCGTCAAGCAGATTTGG 57

TRI1-qR CCAGGAACCCGACTTTCTCT

GDI1-qF TCTAGGTCCCGTTGACGAGT 57

GDI1-qR TCGAGAGCCTTCCCAGTGAT

SYP22-qF ACCCTTCTCAAGCTGTAGCC 57

SYP22-qR ACCAGATCGCCAATTCGTTG

LSM12-qF TGCAGTCAAAGAACAGCCAC 57

LSM12-qR GGTACACACCCTTCACTGGT

GBP-qF CGCTAAGGTCGATGCAGTTG 57

GBP-qR AAAGCGGAGCTCGTCTTCTG

RPL7-qF ATTTTGCAGCTGTTGCGCTT 57

RPL7-qR TGGTTCACTTTCCCGTAGCC

UBC-qF GCAGTGTCAACACAACCGTC 57

UBC-qR AATAACCTGTGCTGCTCGCT

C4H-qF GTAAACCATCCCGAGATTCAG 57

C4H-qR CATGTGTGGTACAAGCAGC

上游引物、下游引物各 1 μL（10 μmol/L），cDNA

溶液 2 μL，滅菌 ddH2O 8.5 μL。擴增程序：95 ℃

5 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40

個循環(huán)。

1.2.5 候選內(nèi)參基因的篩選 分別將各樣品總

RNA 的反轉錄產(chǎn)物 cDNA 作為模板，以各定量

PCR 引物進行 RT-qPCR 擴增。將 Ct 值按公式 Q=

E(minCt-sampleCt)（E 為擴增效率，默認值為 2；minCt

為基因在各樣品中的最小 Ct 值；sampleCt 為基因

在某樣品中的 Ct 值）進行計算，Q 值導入 geNorm

和 NormFinder 軟件中進行穩(wěn)定性分析。將各樣品

得到的 Ct 值輸入 BestKeeper 軟件中，得到候選內(nèi)

參基因的表達穩(wěn)定性變異系數(shù)（CV）和標準差

（SD）。最后運用幾何平均值算法進行綜合排名，

得出最適合斑地錦不同生長期基因組織特異性表

達研究的內(nèi)參基因。

1.2.6 內(nèi)參基因穩(wěn)定性驗證 以綜合分析排名表

達穩(wěn)定性最優(yōu)的基因為內(nèi)參基因，對槲皮素生物

合成過程中的 EmC4H 基因的表達情況進行分析，

RT-qPCR 方法參照 1.2.4，結合 EmC4H 基因的轉

錄組數(shù)據(jù)，對內(nèi)參基因進行表達穩(wěn)定性驗證。

2 結果與分析

2.1 RNA 提取與質(zhì)量檢測

所有樣品總 RNA 的 OD260/OD280 及 OD260/

OD230 值，利用 Nanodrop 檢測均在 2.0 左右，說

明所提取 RNA 純度較好。所有 RNA 樣品經(jīng) 1%

瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示 28S 和 18S 條帶明顯

（圖 1），說明總 RNA 完整性較好，均可用于

后續(xù)試驗。

1~3：分別為營養(yǎng)生長期根、莖、葉；

4~7：分別為生殖生長期根、莖、葉、果。

1–3: Root, stem and leaf of vegetative stage; 4–7: Root, stem, leaf

and fruit of reproduction stage.

圖 1 斑地錦各生長期不同組織樣品中的總

RNA 瓊脂糖凝膠電泳圖

Fig. 1 Electrophoresis of total RNA in various tissues

at different stages of E. maculata

2.2 內(nèi)參基因引物的特異性與熔解曲線分析

內(nèi)參基因引物 PCR 擴增出單一且較亮的條

帶，條帶大小與預期相符，無引物二聚體（圖 2），

引物特異性強，可用于后續(xù)檢測分析。對 10 個候

選內(nèi)參基因在不同時期各個樣品的 RT-qPCR 分析

表明，各基因 Ct 值均在 22~31 之間，各基因引

物的熔解曲線均顯示單峰（圖 3），表明 RT-qPCR

所用引物可與模板 cDNA 特異性結合并擴增靶

基因。

M: Trans2K Plus Ⅱ; 1: EmUBQ; 2: EmRSZ21; 3: EmSE;

4: EmTRI1; 5: EmGDI1; 6: EmSYP22; 7: EmLSM12;

8: EmGBP; 9: EmRPL7; 10: EmUBC.

圖 2 10 個內(nèi)參基因的 PCR 擴增產(chǎn)物

Fig. 2 PCR products of ten reference genes

2276 熱帶作物學報 第 44 卷

圖 3 候選內(nèi)參基因熔解曲線

Fig. 3 Melting curves of candidate reference genes

2.3 候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性分析

2.3.1 候選內(nèi)參基因的表達豐度分析 10 個候

選內(nèi)參基因中，EmRSZ21 的平均 Ct 值最大，為

28.82，說明該基因的表達豐度最低；EmUBQ 的

平均 Ct 值最小，為 22.26，說明該基因的表達豐

度最高。10 個候選內(nèi)參基因的平均 Ct 值利用

Excel 中的 t 檢驗分析顯著性差異，表達豐度排

序依次是 EmUBQ>EmGBP=EmGDI1>EmTRI1=

EmRPL7=EmUBC>EmLSM12=EmSE>EmSYP22>

EmRSZ21（圖 4）。

2.3.2 geNorm 軟件分析 geNorm 軟件通過計算

穩(wěn)定系數(shù) M，以確定表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。該

軟件以 M=1.5 作為臨界點，M 值越小，穩(wěn)定性越

好。10 個候選內(nèi)參基因在不同組織中表達的 M

值均小于 1.5，穩(wěn)定性排名為 EmSE>EmUBC>

EmGDI1>EmLSM12>EmUBQ>EmGBP>EmSYP22>

EmTRI1>EmRSZ21>EmRPL7（表 2）。

2.3.3 NormFinder 軟件分析 NormFinder 軟件與

geNorm 類似，也是基于各候選內(nèi)參基因的 M，通

過方差評估其表達穩(wěn)定性。NormFinder 分析結果

顯示，10 個候選內(nèi)參基因在各組織中的表達穩(wěn)定

程度存在差異，按 M 值大小排序依次為 EmGDI1>

EmUBQ>EmUBC>EmSYP22>EmSE>EmRPL7>

EmLSM12>EmGBP>EmTRI1>EmRSZ21（表 3）。

2.3.4 BestKeeper 軟件分析 BestKeeper 軟件直

接根據(jù)各基因的 Ct 值，通過計算變異系數(shù)（CV）

和標準偏差（SD）來評估各內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，

且 CV 和 SD 值與基因的穩(wěn)定性呈負相關，即穩(wěn)

定的內(nèi)參基因具有較小的 CV 值和 SD 的值。

BestKeeper 分析結果顯示，10 個候選內(nèi)參基因的

SD 值只有 EmUBQ 和 EmGDI1 小于 1.0（默認閾

值）（表 4）。

2.3.5 綜合性分析 BestKeeper 分析結果與

geNorm 和 NormFinder 軟件分析結果差異明顯，

采用幾何平均值算法進行各候選內(nèi)參基因的綜

合排名，內(nèi)參基因穩(wěn)定性越好則幾何平均值越

低。10 個候選內(nèi)參基因在斑地錦不同生長期的不

同組織中表達穩(wěn)定性綜合排名為 EmGDI1 >

EmUBQ>EmSE>EmUBC>EmLSM12=EmGBP>

EmTRI1>EmSYP22>EmRSZ21=EmRPL7（表 5）。

第 11 期 許建豐等：基于轉錄組測序的斑地錦內(nèi)參基因篩選及驗證 2277

不同小寫字母表示在 0.05 水平差異顯著。

Different lowercase letters represent significant difference at 0.05 level.

圖 4 候選內(nèi)參基因在不同時期不同組織樣品中 RT-qPCR 的 Ct 值

Fig. 4 Ct values of RT-qPCR for candidate reference genes in various tissues at different stages

表 2 geNorm 分析候選內(nèi)參基因在各生長期不同組織中的表達穩(wěn)定性

Tab. 2 Expression stability of candidate reference genes analyzed by geNorm

基因 Gene M 值 M value 排序 Rank 基因 Gene M 值 M value 排序 Rank

EmSE 0.605 1 EmGBP 0.703 6

EmUBC 0.645 2 EmSYP22 0.734 7

EmGDI1 0.650 3 EmTRI1 0.801 8

EmLSM12 0.673 4 EmRSZ21 0.861 9

EmUBQ 0.701 5 EmRPL7 0.886 10

表 3 NormFinder 分析候選內(nèi)參基因在各生長期不同組織中的表達穩(wěn)定性

Tab. 3 Expression stability of candidate reference genes analyzed by NormFinder

基因 Gene M 值 M value 排序 Rank 基因 Gene M 值 M value 排序 Rank

EmGDI1 0.049 1 EmRPL7 0.148 6

EmUBQ 0.092 2 EmLSM12 0.160 7

EmUBC 0.124 3 EmGBP 0.169 8

EmSYP22 0.132 4 EmTRI1 0.242 9

EmSE 0.135 5 EmRSZ21 0.264 10

表 4 BestKeeper 分析候選內(nèi)參基因在各生長期不同組織中的表達穩(wěn)定性

Tab. 4 Expression stability of candidate reference genes analyzed by BestKeeper

基因 Gene SD CV 排序 Rank 基因 Gene SD CV 排序 Rank

EmUBQ 0.816 3.666 1 EmRSZ21 1.283 4.451 6

EmGDI1 0.849 3.544 2 EmLSM12 1.333 5.129 7

EmTRI1 1.009 4.035 3 EmUBC 1.377 5.432 8

EmGBP 1.121 4.737 4 EmRPL7 1.456 5.764 9

EmSE 1.143 4.377 5 EmSYP22 1.574 5.738 10

2278 熱帶作物學報 第 44 卷

表 5 候選內(nèi)參基因在各生長期不同組織中表達穩(wěn)定性綜合排名

Tab. 5 Overall ranking of expression stability of candidate reference genes

基因 Gene geNorm rank NormFinder rank BestKeeper rank 幾何平均值 Geometrical mean 綜合排名 Comprehensive rank

EmGDI1 3 1 2 2.000 1

EmUBQ 5 2 1 2.667 2

EmSE 1 5 5 3.667 3

EmUBC 2 3 8 4.333 4

EmLSM12 4 7 7 6.000 5

EmGBP 6 8 4 6.000 5

EmTRI1 8 9 3 6.667 7

EmSYP22 7 4 10 7.000 8

EmRSZ21 9 10 6 8.333 9

EmRPL7 10 6 9 8.333 9

2.4 內(nèi)參基因穩(wěn)定性驗證

以 EmGDI1 為內(nèi)參基因，分析槲皮素生物合

成過程中關鍵基因之一 EmC4H 的表達量差異，

以驗證軟件分析結果的可靠性。結果表明，以

EmGDI1 為內(nèi)參基因，EmC4H 在營養(yǎng)生長期的表

達差異與轉錄組測序結果趨勢完全一致，在生殖

生長期的表達差異與轉錄組測序結果趨勢基本一

致（圖 5）。因此，使用 EmGDI1 基因為內(nèi)參基

因，能夠較為準確地校準斑地錦不同生長期不同

組織中的 RT-qPCR 檢測結果。

A：轉錄組測序結果；B：RT-qPCR 結果。*代表處理間差異顯

著（P<0.05）；**代表處理間差異極顯著（P<0.01）。

A: The results of transcription sequencing; B: The results of

RT-qPCR. * represents significant difference among treatments

(P<0.05); ** represents the extremely significant difference among

treatments (P<0.01).

圖 5 EmC4H 基因在斑地錦各生長期不同組織中表達差異

Fig. 5 Expression differences of EmC4H in various tissues

of E. maculata at different stages

3 討論

隨著藥用植物分子生物學研究的不斷深入，

藥用活性成分生物合成的關鍵酶基因表達與調(diào)控

逐漸成為研究熱點。熒光實時定量 PCR 是檢測基

因表達模式的高效手段之一，而具有合適、穩(wěn)定

的內(nèi)參基因是熒光實時定量 PCR 的基礎。Act、

GAPDH、UBQ、18SrRNA 等傳統(tǒng)內(nèi)參基因被廣泛

應用，但在不同組織、不同生長期以及不同處理

條件下均穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因并不存在[7]，因此

需要根據(jù)試驗條件的改變篩選出可靠的內(nèi)參基

因，或應用內(nèi)參基因組合以減少基因表達誤差[14]。

基于轉錄組測序的 RT-qPCR 內(nèi)參基因篩選是近年

來發(fā)展的一個新的有效策略，在釀酒酵母中已篩

選鑒定出一套全新的內(nèi)參基因[15]，也已成功應用

于一些絲狀真菌、植物和動物中[16-18]，例如在馬

爾尼菲青霉菌中，Actin 基因在不同細胞類型中表

達最穩(wěn)定[19]，而基于轉錄組測序獲得的 FacpA 和

DigA 基因在雙相轉換過程中表達穩(wěn)定性最高[20]。

本研究根據(jù)斑地錦轉錄組測序結果，篩選出

EmSE、EmUBC、EmGDI1、EmLSM12、EmGBP、

EmSYP22、EmTRI1、EmRSZ21、EmRPL7 和課題

組前期利用同源克隆法獲得的內(nèi)參基因 EmUBQ，

共 10 個候選內(nèi)參基因進行 RT-qPCR，分別用

geNorm、NormFinder 和 BestKeeper 軟件評價其

在各生長期（營養(yǎng)生長期、生殖生長期）根、莖、

葉和果中的表達穩(wěn)定性。結果顯示，不同軟件對

10 個內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性的評估并不完全一致。

EmUBQ 在 BestKeeper 評價時表達最穩(wěn)定，而在

geNorm 和 NormFinder 評估中排序居中；EmSE

在 geNorm 中排序最好，而在其他 2 種軟件中排

序較差。這種現(xiàn)象在地菍（Melastoma dodecandrum）[21]、扇脈杓蘭（Cypripedium japonicum）[22]